1.貴州省安順市食品藥品檢驗(yàn)所，貴州 安順 561000；2.貴州省安順市中醫(yī)院，貴州 安順 561000；3.貴州省安順市人民醫(yī)院，貴州 安順561000；4.貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025；5.中央民族大學(xué)，北京 100081

HPLC法測(cè)定貴州不同地區(qū)番石榴葉中兩種黃酮苷的含量

李開(kāi)斌1孫剛1鄭宗華2楊文1宴晨3馬四補(bǔ)4，5*

1.貴州省安順市食品藥品檢驗(yàn)所，貴州 安順 561000；2.貴州省安順市中醫(yī)院，貴州 安順 561000；3.貴州省安順市人民醫(yī)院，貴州 安順561000；4.貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025；5.中央民族大學(xué)，北京 100081

目的對(duì)貴州不同地區(qū)番石榴葉藥材中金絲桃苷和異槲皮苷變化進(jìn)行研究，探討番石榴葉藥材有效成分與產(chǎn)地相關(guān)性變化，為番石榴葉藥材生產(chǎn)和質(zhì)量保障提供數(shù)據(jù)支撐。方法采用高效液相色譜法，色譜柱Agilent XDB-C18柱(4.6mm×250mm，5μm)；流動(dòng)相為乙腈-0.1%甲酸(13∶87)，柱溫為25℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為257nm；流速1.0mL/min，測(cè)定貴州不同地區(qū)番石榴葉藥材中金絲桃苷和異槲皮苷含量。結(jié)果通過(guò)方法學(xué)考察，HPLC檢測(cè)番石榴葉中兩種黃酮苷含量，實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確可靠，方法簡(jiǎn)便易行；在同一時(shí)段內(nèi)，不同產(chǎn)地番石榴葉中兩種黃酮苷變化較大，不同產(chǎn)地藥材質(zhì)量差異明顯。結(jié)論建立了番石榴葉藥材兩種黃酮苷的檢測(cè)方法，方法準(zhǔn)確可靠、簡(jiǎn)便易行；貴州不同區(qū)域產(chǎn)番石榴葉藥材中兩種黃酮苷的含量差異明顯，靠近河谷的羅甸溝亭鄉(xiāng)所產(chǎn)番石榴葉藥材品質(zhì)較好。

番石榴葉；金絲桃苷；異槲皮苷

番石榴(PsidiumguajavaL.)為桃金娘科番石榴屬植物，為常綠多年生灌木或小喬木[1]，在我國(guó)的廣西、廣東、海南等均有人工栽培[1],貴州民間多有習(xí)用，番石榴葉別名“雞矢茶”、“番桃葉”、“番石榴心”、“麻里桿”等，是番石榴的干燥葉及帶葉嫩莖。在貴州多為野生品種。本品質(zhì)脆易碎，氣微，揉之有香氣，味澀，微苦，性平。具有健胃消食、澀腸止瀉、收斂止血、抗氧化的作用。主要含黃酮類、揮發(fā)油、鞣質(zhì)、植物固醇、多糖等化學(xué)成分[2]。結(jié)合貴州民間用藥習(xí)慣，研究選擇與療效相關(guān)的兩種黃酮苷作為控制指標(biāo)對(duì)貴州不同區(qū)域的番石榴葉藥材含量相關(guān)性進(jìn)行探索，測(cè)定了采收時(shí)間和方式相同條件下的不同地區(qū)番石榴葉藥材兩種黃酮苷的變化趨勢(shì)，建立了準(zhǔn)確可靠、簡(jiǎn)便易行的檢測(cè)方法，為番石榴葉藥材質(zhì)量控制和藥材生產(chǎn)提供科學(xué)的數(shù)據(jù)支撐。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Agilent 1260高效液相色譜儀(安捷倫液相色譜工作站，美國(guó)安捷倫公司)；TU-1901型雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)；AY-120型島津托盤(pán)電子天平；KQ3200DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 試劑 乙腈為色譜純，甲醇、甲酸、乙醇均為分析純，水為超純水。金絲桃苷對(duì)照品由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供，批號(hào):111521-201507，含量94.3%，異槲皮苷對(duì)照品由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供，批號(hào):111809-201403，含量92.9%。

1.3 樣品 樣品采自貴州省黔西南州安龍縣坡腳鄉(xiāng)坡腳村、望謨蔗香鎮(zhèn)移民村、望謨桑朗鎮(zhèn)、冊(cè)亨縣巧馬鎮(zhèn)、黔南州羅甸溝亭鄉(xiāng)，均由貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院生藥教研室魏升華教授鑒定為番石榴(PsidiumguajavaL.)的干燥葉。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：Agilent XDB-C18柱(4.6×250mm，5μm)；流動(dòng)相：乙腈-0.1%甲酸水溶液(13∶87)；柱溫：25 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：257 nm；流速1.0 mL/min；進(jìn)樣體積：10 μL。

2.2 對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱取金絲桃苷對(duì)照品10.61 mg和異槲皮苷對(duì)照品10.78 mg，分別置100 mL量瓶中，加60 %甲醇溶解并稀釋至刻度，作為對(duì)照品貯備液。分別精密量取對(duì)照品貯備液各3 mL于同一25 mL容量瓶中，加60 %甲醇溶液稀釋至刻度，制成每1 mL含金絲桃苷、異槲皮苷分別為12.01 ug、12.02 ug的混合對(duì)照品溶液即得。

2.3 供試品的制備 取番石榴葉粉末(過(guò)四號(hào)篩)約0.2 g，精密稱定，置25 mL容量瓶中，加入60%甲醇20 mL，超聲提取(功率500 W，頻率40 kHz)40 min，取出放冷，用60%甲醇稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液即得。

2.4 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 分別取金絲桃苷，異槲皮苷對(duì)照品溶液、供試品溶液以及甲醇溶液注入液相色譜儀，記錄色譜圖。從圖中可見(jiàn)空白無(wú)干擾，對(duì)照品與供試品圖譜金絲桃苷，異槲皮苷的保留時(shí)間一致，金絲桃苷，異槲皮苷與其相近的峰分離完全(分離度gt;1.5)。對(duì)照品色譜中金絲桃苷，異槲皮苷峰的理論塔板數(shù)分別為8261和8644，供試品溶液的色譜中金絲桃苷，異槲皮苷峰的理論塔板數(shù)分別為7503和4131，即理論板數(shù)以異槲皮苷計(jì)算應(yīng)不低于2000。結(jié)果如圖1、圖2所示。

2.5 線性關(guān)系考察 精密量取“2.2”項(xiàng)下的對(duì)照品貯備液各3 mL于同一10 mL容量瓶中，加60%甲醇稀釋至刻度，精密吸取該混合對(duì)照品溶液1、3、5、10、20、40 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以峰面積A對(duì)質(zhì)量數(shù)X(μg)進(jìn)行線性回歸計(jì)算，得線性回歸方程為：金絲桃苷：A=28.245X-13.341(R2=0.9999)異槲皮苷：A=27.243X+31.685(R2=0.9998),結(jié)果表明金絲桃苷在3.0016～120.0627μg，異槲皮苷在3.0044～120.1754μg范圍內(nèi)與峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

將“2.2”項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液(濃度分別為0.01201 mg/mL，0.01202 mg/mL)所測(cè)得的金絲桃苷峰面積322.453代入上述線性回歸方程得C=0.01189 mg/mL，與0.01201 mg/mL相比，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.92%；再將異槲皮苷峰面積363.122代入回歸方程得C=0.01217 mg/mL，與0.01202 mg/mL相比，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.88%，均較小。所以該濃度的混合對(duì)照品在此線性范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.6 儀器精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性考察 取同一對(duì)照品連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算金絲桃苷和異槲皮苷峰面積的RSD值，分別為0.74%，0.65%；取同一對(duì)照品和同一樣品分別于0、4、8、12、16、24 h進(jìn)樣測(cè)定金絲桃苷與異槲皮苷峰面積，對(duì)照品RSD值為0.44%和0.54%，樣品RSD值為0.72%和0.96%，說(shuō)明對(duì)照品和樣品在24 h穩(wěn)定性均較好；取同一批次樣品6份，平行制備6份供試品溶液，測(cè)定金絲桃苷與異槲皮苷的含量，所得含量RSD值為1.8%和1.1%，說(shuō)明該方法重復(fù)性強(qiáng)。

2.7 加樣回收率試驗(yàn) 取貴州黔西南安龍縣坡腳鄉(xiāng)坡腳村樣品(粉碎，過(guò)4號(hào)篩)6份，每份約0.1 g，精密稱定，置25 mL容量瓶中，加入金絲桃苷與異槲皮苷(濃度分別為0.006003 mg/mL，0.008012 mg/mL)的混合對(duì)照品溶液20mL，按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，測(cè)定含量，計(jì)算金絲桃苷與異槲皮苷的平均回收率分別為96.16%，100.03%，RSD分別為 1.2%，0.4%，表明該方法測(cè)定準(zhǔn)確度較高。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 番石榴葉中金絲桃苷與異槲皮苷的加樣回收試驗(yàn)結(jié)果

2.8 樣品測(cè)定 取貴州南盤(pán)江流域內(nèi)不同地區(qū)的番石榴葉藥材粉末，照“2.3”項(xiàng)下方法提取供試品溶液，測(cè)定含量，按干燥品計(jì)算藥材中金絲桃苷與異槲皮苷的總量。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 不同產(chǎn)地番石榴葉藥材中金絲桃苷與異槲皮苷含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

實(shí)驗(yàn)采用HPLC法同時(shí)測(cè)定了番石榴葉藥材中兩種黃酮苷類成分，待測(cè)組分互不干擾，控制指標(biāo)成分法定可得，兩種黃酮苷結(jié)構(gòu)相似，其中金絲挑苷具有較好活性。通過(guò)檢測(cè)兩種槲皮素苷對(duì)番石榴藥材質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)，較單一用槲皮素評(píng)價(jià)藥材有很強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)。槲皮素作為質(zhì)量控制指標(biāo)之一涉及水解過(guò)程，在藥典和報(bào)道中多采用酸水解，提取條件控制較苛刻，操作要求較高，而黃酮苷作為指標(biāo)控制成分，實(shí)驗(yàn)操作性強(qiáng)，簡(jiǎn)便卻準(zhǔn)確可靠。多組分活性物質(zhì)作為藥材質(zhì)量控制指標(biāo)，可以更全面地評(píng)價(jià)藥材的質(zhì)量，由于番石榴葉藥材特異性和檢測(cè)可追溯性，選擇金絲桃苷與異槲皮苷的總量作為番石榴葉藥材控制方式較為合適。

由表2可知貴州省不同產(chǎn)地的番石榴葉藥材中金絲桃苷與異槲皮苷的含量差異較大，金絲桃苷在1.0～3.8 mg/g，異槲皮苷在1.7～2.7 mg/g，金絲桃苷波動(dòng)較大，而異槲皮苷的波動(dòng)較平穩(wěn)，兩者的總量波動(dòng)也較大，且有伴隨緯度降低而升高的一致性。通過(guò)對(duì)貴州省番石榴葉不同地區(qū)藥材質(zhì)量的對(duì)比研究，結(jié)合民族用藥與中藥質(zhì)量控制特點(diǎn)[7]，以看出該藥材隨地域環(huán)境不同的質(zhì)量變化趨勢(shì)，為更好應(yīng)用和開(kāi)發(fā)貴州民族醫(yī)藥提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支撐。

[1]鐘思強(qiáng),黃樹(shù)長(zhǎng).番石榴的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值及其高效栽培技術(shù)[J].中國(guó)南方果樹(shù)，2008,37(1)：41-43.

[2]歐陽(yáng)文，朱曉艾，邵祥輝，等.番石榴葉乙酸醋萃取化學(xué)成分研究[J].食品科學(xué)，2014,35(15)：30-37.

[3]Gutié rrez R M P，Mitchell S，Solis R V.Psidium guajava：A review of its traditional uses，phytochemistry and pharmacology[J].Journal of Ethnopharmacology，2008，117(1)：1-27.

[4]Makino T,KanemaruM,Okuyama S,et al.Anti-allergic effects of enzymatically modified isoquercitrin(alpha-oligoglucosyl quercetin3-O-glucoside),quercetin3-O-glucoside,alpha-oligoglucosyl rutin,and quercetin,when administered orally to mice[J]. Nat Med,2013,67(4):881-886.

[5]黃凱，楊新波，黃正明.金絲桃苷藥理作用研究進(jìn)展[J].醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2009,28(8)：1046-1048.

[6]林萍，易宏偉，張裴.金絲挑著藥理作用研究進(jìn)展[J].中國(guó)現(xiàn)代中藥，2012,14(10):23-26.

[7]李志勇，李彥文，樸香蘭，等.論中藥與民族藥的關(guān)系[J].貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2012,34(1):26-28.

李開(kāi)斌(1979-)，男，漢族，本科，主管中藥師。研究方向?yàn)樗幉馁|(zhì)量控制與檢驗(yàn)檢測(cè)。E-mail：826735176@qq.com

馬四補(bǔ)(1979-)，男，回族，博士研究生在讀，副教授。研究方向?yàn)橹兴?、民族藥物質(zhì)基礎(chǔ)研究。E-mail：453175568@qq.com

R284.1

A

1007-8517(2017)21-0019-03

2017-09-13 編輯：鄧佳麗)