李云龍 高峰 張海濤 顧開朗 （徐州生物工程職業(yè)技術學院 江蘇徐州 221006）

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奶牛溶菌酶基因多態(tài)性與乳房炎的關聯(lián)分析

李云龍 高峰 張海濤 顧開朗 （徐州生物工程職業(yè)技術學院 江蘇徐州 221006）

通過研究奶牛溶菌酶基因(Bos taurus 1ysozyme，LYZ)的多態(tài)性與乳房炎的相關性，為奶牛的抗病育種提供新的分子遺傳標記。利用PCR-SSCP技術對420頭中國荷斯坦牛LYZ基因進行多態(tài)性檢測，并對LYZ基因的多態(tài)位點與SCS(somatic cell score)和泌乳性狀進行相關分析。結(jié)果表明：LYZ基因的外顯子1上存在115(T>G)突變位點，使精氨酸變?yōu)榱涟彼?；發(fā)現(xiàn)了3種基因型GG，TG和TT，頻率分別為0.20、0.48和0.32；GG基因型個體的SCS最小二乘均值極顯著低于TT基因型個體(P<0.01)，顯著低于TG基因型個體(P<0.05)；GG基因型個體的305d產(chǎn)奶量最小二乘均值極顯著高于TT基因型個體(P<0.01)，顯著高于TG基因型個體(P<0.05)。LYZ基因該位點的突變對奶牛的SCS和305d產(chǎn)奶量有較大的遺傳效應，可作為分子標記應用于奶牛乳房炎抗性和產(chǎn)奶量的篩選。

LYZ基因 PCR-SSCP 多態(tài)性 SCS

奶牛乳房炎是奶牛多發(fā)病，在世界范圍內(nèi)造成了巨大的經(jīng)濟損失，據(jù)調(diào)查我國奶牛乳房炎發(fā)病率普遍高于國外。如果能通過奶牛的抗病育種來減少奶牛乳房炎發(fā)病率，減少經(jīng)濟損失具有極其重要的意義。溶菌酶(Lysozyme)全稱1,4-β-N-溶菌酶，又稱粘肽N-乙酰基胞壁酰水解酶，能夠特異水解細菌細胞壁中肽聚糖N-乙酰胞壁酸和N-乙酰葡糖胺之間的β-1，4-糖苷鍵，是一種具有抗菌、溶菌活性的固有免疫效應分子[1]。目前已知在高等反芻動物(如牛、羊和鹿等)基因組中存在大概10種溶菌酶相似基因[2]。然而研究發(fā)現(xiàn)，反芻動物雖然有眾多溶菌酶基因，但相對于其他動物機體缺乏溶菌酶[3]此外，不同組織溶菌酶表達差異巨大，牛腎、血液、淚液、乳汁中溶菌酶表達水平低于大多數(shù)動物[4]，牛溶菌酶在乳腺中水平較低，僅為0.05~0.13mg/L，相比之下，人乳腺溶菌酶表達量可比其高2000~4000倍[5]。溶菌酶作為哺乳動物機體防御因子的重要成員，因為其具有抗菌、消炎、組織修復以及提高免疫力等多方面活性，同時又是一種天然、無毒的蛋白質(zhì)，只作用于細菌細胞壁，而對動物機體無害。本研究采用 PCR-SSCP 技術對奶牛乳腺表達的溶菌酶基因進行多態(tài)性檢測，并與奶牛體細胞評分(Somatic Cell Score, SCS)和泌乳性狀進行關聯(lián)分析，旨在探索溶菌酶基因突變與奶牛乳房炎易感性是否存在關聯(lián)，為標記輔助育種、提高奶牛對病原微生物抵抗力、降低奶牛乳房炎發(fā)病率提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

420頭中國荷斯坦牛血樣采自徐州張集鎮(zhèn)某奶牛場，產(chǎn)奶性能記錄由該場提供。該場每月進行一次DHI(Dairy Herd Improvement)測定。

1.2 試驗方法

1.2.1 基因組DNA提取 采用常規(guī)的苯酚-氯仿抽提法[6]。

1.2.2 引物設計 根據(jù)GenBank公布的牛LYZ基因序列(NC-007303)，用Primer5.0軟件對LYZ基因的4個外顯子分別設計4對引物。引物由上海生物工程技術有限公司合成(表1)。

表1 LYZ基因引物 (℃)

1.2.3 PCR擴增擴增體系：10×buffer2.0μl、25mmol/ LMg2+1.5μl、dNTP0.5μl、TaqDNA聚合酶0.3μl、上下游引物各(10pmol/μl)1.0μl、DNA模板1.0μl、ddH2O12.7μl。擴增程序：94℃預變性5min；94℃變性40s，復性40s(具體退火溫度見表1)，72℃延伸10min，30個循環(huán)；最后72℃延伸10min，4℃保存。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，EB染色并拍照。

1.2.4 SSCP分析 將2μl PCR產(chǎn)物和8μl變性上樣緩沖液加入離心管中并混勻，98℃變性10min，冰浴5min。采用交聯(lián)度為29:1的聚丙烯酰胺凝膠，150V電泳過夜，電泳結(jié)束后銀染顯色。根據(jù)PCR~SSCP檢測結(jié)果，選取不同基因型的PCR產(chǎn)物用試劑盒純化回收后，送至上海生工生物工程技術服務有限公司進行序列測定。

1.3 數(shù)據(jù)分析

計算基因頻率、基因型頻率、有效等位基因數(shù)和多態(tài)信息含量，運用卡方檢驗器軟件計算卡方值，運用SPSS16.0進行最小二乘分析。在進行統(tǒng)計分析時，先將乳中體細胞數(shù)(Somatic Cell Counts，SCC)用如下公式轉(zhuǎn)換為體細胞評分(SCS)：SCS=log(SCC/100)+3，并保留小數(shù)點后2位有效數(shù)字。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR-SSCP檢測結(jié)果

4對引物的PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到了預期的產(chǎn)物(圖1)。對PCR擴增產(chǎn)物進行SSCP檢測，引物P1中共檢測出3種基因型，分別命名為GG、TG和TT型(圖2)。根據(jù)測序結(jié)果(圖3)表明：LYZ基因第一外顯子的115(T>G)位點發(fā)生突變，此突變使密碼子Arg轉(zhuǎn)變?yōu)長eu。引物P2、P3和P4在所有個體的SSCP檢測中均沒有發(fā)現(xiàn)多態(tài)。

圖1 引物P1-4的PCR產(chǎn)物

M：Marker pBR322；1-4：引物P1-4的PCR產(chǎn)物

圖2 中國荷斯坦牛LYZ基因第1外顯子SSCP分析

圖3 115(T>G)位點的測序

2.2 基因型頻率、等位基因頻率及遺傳特性

LYZ基因115(T>G)位點的等位基因頻率和基因型頻率結(jié)果如表2所示：基因型TT、TG和GG的頻率分別為0.32、0.48和0.20，等位基因T和G的頻率分別為0.56和0.44。T為優(yōu)勢等位基因，雜合子TG為優(yōu)勢基因型。LYZ基因115(T>G)位點的多態(tài)信息含量(PIC)大于0.50，表明該位點處于高度多態(tài)，變異程度較大。

表2 LYZ基因115位點基因型頻率和等位基因頻率及遺傳特性

2.3 LYZ基因多態(tài)性與奶牛泌乳性狀的相關性

對LYZ基因多態(tài)位點進行最小二乘分析結(jié)果表明：115(T>G)位點對SCS和305d產(chǎn)奶量有顯著影響。TT基因型個體的SCS極顯著高于GG基因型個體(P<0.01)，顯著高于TG基因型個體(P<0.05)；TT基因型個體的305d產(chǎn)奶量極顯著低于GG基因個體(P<0.01)，顯著低于TG基因型個體(P<0.05)。

表3 LYZ基因115(T>G)位點對泌乳性狀的效應 (kg、%)

注：同列大寫字母不同表示差異極顯著(P<0.01)；同列小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)。

3 討論

（1）SCC是指每毫升牛奶中體細胞的含量，乳中體細胞含量的多少是衡量乳房健康狀況及乳衛(wèi)生質(zhì)量的標志之一。SCC作為乳房炎的常規(guī)檢測方法有兩大優(yōu)點：(1)隨著大量牧場DHI的實施，SCC已成為日常記錄的一部分，可以通過儀器測定。（2）SCC的遺傳力高于乳房炎的遺傳力。乳房炎遺傳力約為0.02~0.06[7]，但為了提高SCC反映乳房炎的客觀性、準確性和便于統(tǒng)計，在關聯(lián)分析中往往將SCC轉(zhuǎn)化為SCS，SCS的遺傳力在0.1-0.2之間[8]，而SCS與乳房炎之間存在遺傳相關，相關系數(shù)在0.60-0.80之間[9]。本研究中LYZ基因的三種基因型對SCS的影響存在顯著差異，GG基因型個體的SCS極顯著低于TT基因型個體(P<0.01)，顯著低于TG基因型個體(P<0.05)，對于乳房炎而言GG是最有利基因型，TT是最不利基因型。因此，在奶牛的乳房炎抗性育種中，該位點可以作為標記輔助育種，降低奶牛乳房炎的發(fā)病率。（2）LYZ基因的研究多集中在轉(zhuǎn)基因和疾病防治上，很多學者嘗試將具有較高活性的人溶菌酶基因轉(zhuǎn)入到奶牛[10]和奶山羊[11]，使牛、羊乳腺分泌表達人溶菌酶，從而提高對乳房炎的抵抗力。楊睿[12]等用不同來源的四種溶菌酶對引起奶牛乳房炎的葡萄球菌做抑菌實驗，并從中篩選出抑菌效果最好的樣品。孫懷昌[13]等將兩種自行構(gòu)建的表達人溶菌酶基因的重組質(zhì)粒注射到患病奶牛的乳腺，經(jīng)CMT試驗證明對臨床型和隱性乳房炎具有治療作用。而目前對牛的LYZ基因多態(tài)性與奶牛乳房炎關聯(lián)分析的研究較少，最近有研究發(fā)現(xiàn)，在水牛LYZ基因外顯子3上存在多態(tài)位點[14]，并研究得出血清中溶菌酶AA基因型個體活性高于其它基因型個體，而AA基因型個體奶中的體細胞數(shù)低于其它基因型個體。本試驗通過PCR-SSCP技術檢測奶牛的LYZ基因3個外顯子多態(tài)性，在第一外顯子的115位點發(fā)現(xiàn)了T→G的突變，與陳仁金等[15]的檢測結(jié)果一致，該位點進行相關性分析表明：其顯著影響305d產(chǎn)奶量，GG基因型個體極顯著高于TT基因型個體(P<0.01)，顯著高于TG基因型個體(P<0.05)。由于G等位基因不是優(yōu)勢等位基因，該位點多態(tài)信息含量(PIC)大于0.50，表明該位點處于高度多態(tài)，變異程度較大，存在較大的選擇潛力，對該位點的選擇有望獲得更多的遺傳進展。所以應逐步固定優(yōu)勢等位基因，以提高奶牛生產(chǎn)和抗病性能。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明：LYZ基因?qū)χ袊伤固古?05d產(chǎn)奶量和SCS評分有較大的遺傳效應，可用于中國荷斯坦牛的分子標記輔助選擇。

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（2017–07–26）

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