王 艷, 晉 玲, 曾翠云, 雒 軍, 朱田田

(甘肅中醫(yī)藥大學(xué), 蘭州 730000)

柴胡斑枯病病原及其生物學(xué)特性

王 艷, 晉 玲, 曾翠云, 雒 軍, 朱田田

(甘肅中醫(yī)藥大學(xué), 蘭州 730000)

據(jù)2011-2014年調(diào)查,甘肅省柴胡斑枯病發(fā)生嚴(yán)重,常年發(fā)病率為13%～21%,嚴(yán)重度1～2級(jí)。本研究以形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方法相結(jié)合,明確了甘肅省柴胡斑枯病病原及其生物學(xué)特性。甘肅省柴胡斑枯病菌分生孢子器近球形或球形,黑褐色,高66.4～90.2 μm,平均77.5 μm;直徑57.3～90.0 μm,平均70.5 μm。分生孢子針形、無(wú)色,有些稍彎曲,具1～3隔膜,大小(13.0～26.0)μm×(1.5～3.0)μm,平均19.0 μm×2.0 μm。通過(guò)ITS、LSU、RBP2和β-tubline多基因位點(diǎn)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),將柴胡斑枯病病原鑒定為柴胡殼針孢SeptoriabupleuricolaSacc.。該菌菌絲生長(zhǎng)、分生孢子萌發(fā)和產(chǎn)孢的溫度范圍分別為0～35℃、0～35℃、5～35℃,最適溫度分別為20～25℃、15℃、10～15℃;連續(xù)光照有利于菌絲生長(zhǎng)、孢子萌發(fā)和病菌產(chǎn)孢;菌絲生長(zhǎng)、孢子萌發(fā)和產(chǎn)孢的適宜pH范圍分別為4.0～10.0、4.51～9.19和5.0～9.0,最適pH分別為5.0、6.49和5.5;此菌在相對(duì)濕度75%以上可萌發(fā),以水中萌發(fā)最好;柴胡葉或根漬液對(duì)孢子萌發(fā)有較強(qiáng)的促進(jìn)作用。表明柴胡殼針孢菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)的適宜溫度偏低,因此該病害在氣溫偏低及持續(xù)陰雨結(jié)露條件下發(fā)生較重。

柴胡斑枯病; 形態(tài)學(xué); 分子生物學(xué); 病原鑒定; 生物學(xué)特性

柴胡BupleurumchinenseDC.屬傘形科多年生草本植物[1],為我國(guó)常用大宗藥材,始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,列為上品,以根入藥,性味苦、微寒,具疏散退熱,升陽(yáng),舒肝等功效,主治瘧疾,肝郁氣滯,胸肋脹痛等癥[2]。主產(chǎn)于我國(guó)東北、華北、內(nèi)蒙古、河南、陜西及甘肅等省區(qū),多為野生[3]。由于長(zhǎng)期過(guò)度采挖,野生資源不能滿足市場(chǎng)需要,中國(guó)從20世紀(jì)80年代初開(kāi)始研究野生變家種試驗(yàn)[4]。甘肅省是柴胡的道地產(chǎn)區(qū)之一,經(jīng)調(diào)查,甘肅省定西市、隴南市以及河西地區(qū)均有大面積種植,僅定西市的隴西縣柴胡種植面積就達(dá)到約2 000 hm2,隴南一帶的禮縣、清水縣,河西地區(qū)的金昌、天祝、武威等地種植規(guī)模也在400 hm2,使甘肅的柴胡產(chǎn)量躍居全國(guó)之首[5],2012年甘肅柴胡種植面積達(dá)19 090 hm2,年產(chǎn)量達(dá)4.34萬(wàn)t,占全國(guó)的50%[6]。

但是隨著栽培面積逐年增大,柴胡病害發(fā)生日趨嚴(yán)重,國(guó)內(nèi)記載柴胡病害主要有斑枯病SeptoriabupleuriSacc.[7-9]、殼二孢葉斑病AscochytabupleuriThüm.[9]、銹病PucciniabupleuriRudolphi[10]、根腐病FusariumoxysporumSchl.[11]、Rhizoctoniasp.[12]和鏈格孢葉斑病Alternariaalternata(Fr.:Fr.) Keissl.[13]。在2011-2014年甘肅省藥用植物病害調(diào)查中,發(fā)現(xiàn)斑枯病是甘肅省柴胡生產(chǎn)中的主要病害,甘肅省定西地區(qū)隴西縣、靈臺(tái)縣、渭源縣、漳縣及安定區(qū)都有發(fā)生,發(fā)病率平均13%～21%,嚴(yán)重度1～2級(jí)[12]。作為柴胡栽培過(guò)程中影響柴胡質(zhì)量和產(chǎn)量的重要病害,國(guó)內(nèi)僅對(duì)其病原進(jìn)行了記載,但是對(duì)該病害的發(fā)生危害情況,病原的生物學(xué)特性及病害的防治措施等均無(wú)系統(tǒng)的研究報(bào)道。本研究旨在對(duì)該病的病原進(jìn)行研究,測(cè)定其生物學(xué)特性,同時(shí)提出一定的防治建議,為柴胡規(guī)范化種植以及斑枯病的有效防治提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試菌種:2007年10月采自甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥材示范園的柴胡斑枯病新鮮標(biāo)樣,經(jīng)分離培養(yǎng)后鏡檢確定為殼針孢屬真菌Septoriasp.,純化后接種健康柴胡葉片發(fā)病的病菌,再次分離后,于4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 病原形態(tài)觀察

從采集的柴胡斑枯病病葉組織上挑取病原分生孢子器,置于載玻片上,以水為浮載劑,在光學(xué)顯微鏡下觀察并測(cè)定分生孢子器20個(gè),分生孢子30個(gè),分別取最大值和最小值作為該指標(biāo)的上限和下限,同時(shí)觀察菌株在PDA、OA和MEA培養(yǎng)基[14]上,于25℃下黑暗培養(yǎng)20 d的培養(yǎng)性狀,并利用冷凍切片機(jī)對(duì)分生孢子器進(jìn)行切片,觀察分生孢子器內(nèi)部結(jié)構(gòu),再參照相關(guān)資料[7-9]鑒定病原。

1.2.2 病原菌DNA提取及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建

取在PD培養(yǎng)液中于20℃、45 r/min振蕩培養(yǎng)7 d的柴胡斑枯病病原菌菌絲在液氮中研磨,用UNIQ-10柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒(SK1375,上海生工)提取DNA。ITS、LSU、RBP2和β-tubline 4個(gè)片段的PCR擴(kuò)增分別采用引物ITS1/ITS4、LROR/LR5[15]、fRPB2-5f/fRPB2-7cR[16]、T1/β-Sandy-R[17-18]。50 μL PCR反應(yīng)體系:10×PCR Buffer(含MgCl220 mmol/L)5 μL、dNTPs 10 mmol/L 0.5 μL、10 μmol/L引物各2.5 μL、2 U/μLTaq4 μL、模板DNA 2 μL。PCR擴(kuò)增條件:95℃預(yù)變性3 min;94℃變性30 s,分別以53℃(ITS、LSU),55℃(RBP2),52℃(β-tubulin)退火45 s,72℃延伸1 min,共30個(gè)循環(huán);最后72℃延伸8 min,4℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳,用凝膠成像儀進(jìn)行觀察并照相。PCR產(chǎn)物委托生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行純化和測(cè)序。并用BioEdit[19]軟件反復(fù)校對(duì),去除兩端不確定的序列后,在GenBank中進(jìn)行BLASTn比較搜索,下載相似序列并進(jìn)行多基因片段的拼接,選用Readeriellamirabilis作為外群(菌株號(hào):CBS125000;ITS、LSU、RBP2和β-tublin在GenBank登錄號(hào)分別為:KF251332、KF251836、KF252335和KF252804)。MEGA 6.0軟件采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.2.3 柴胡斑枯病菌生物學(xué)特性測(cè)定

1.2.3.1不同溫度對(duì)菌絲生長(zhǎng)、產(chǎn)孢量及孢子萌發(fā)的影響

在已培養(yǎng)30 d的菌落邊緣打取直徑為7 mm的菌餅接種于PDA平板上,分別置于5、10、15、20、25、30、35℃溫度下培養(yǎng),每溫度處理重復(fù)3皿。每隔4 d用十字交叉法測(cè)定菌落大小,20 d后測(cè)定產(chǎn)孢量。孢子量測(cè)定采用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù);孢子萌發(fā)采用懸滴培養(yǎng),每溫度處理重復(fù)3次,定時(shí)觀察孢子萌發(fā)率,每重復(fù)觀察計(jì)數(shù)5個(gè)視野約300個(gè)孢子,統(tǒng)計(jì)其萌發(fā)率。

1.2.3.2不同光照對(duì)菌絲生長(zhǎng)、產(chǎn)孢量及孢子萌發(fā)的影響

將菌餅接種于PDA平板上,置25℃連續(xù)光照,光暗12 h交替及連續(xù)黑暗條件下培養(yǎng);將孢子懸浮液于20℃在上述光照條件下懸滴培養(yǎng),其他同上。

1.2.3.3不同pH對(duì)菌絲生長(zhǎng)、產(chǎn)孢量及孢子萌發(fā)的影響

將菌餅接種于由NaOH和HCl調(diào)制的pH為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0的PDA培養(yǎng)基平板上,25℃下培養(yǎng);用檸檬酸-磷酸二氫鉀緩沖液配制pH為4.51、5.58、6.49、7.00、7.41、8.39、9.19的孢子懸浮液,20℃下懸滴培養(yǎng),其他同上。

1.2.3.4不同濕度對(duì)孢子萌發(fā)的影響

將孢子懸浮液均勻涂抹于載玻片上,在室溫下自然干燥,用小容器調(diào)節(jié)法,以硫酸控制相對(duì)濕度,濕度設(shè)置為70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99.5%,以100%飽和濕度為對(duì)照,共9個(gè)處理,20℃下培養(yǎng)。其他同上。

1.2.3.5不同營(yíng)養(yǎng)條件對(duì)孢子萌發(fā)的影響

分別以尿素、馬糞浸漬液、土壤浸漬液、葡萄糖、柴胡根浸液、柴胡葉浸液1∶5、1∶10、1∶20稀釋成孢子懸浮液,20℃下懸滴培養(yǎng)[16],其他同上。

2 結(jié)果與分析

2.1 癥狀

病原菌主要危害葉片、莖稈。葉部產(chǎn)生直徑為1～2.5 mm的近圓形、橢圓形、半圓形小病斑,邊緣紫褐色,稍隆起,中部黃褐色、灰褐色，后變灰白色。葉片兩面的病斑上均可產(chǎn)生黑色小顆粒,即病菌的分生孢子器。有些病斑自葉尖向下擴(kuò)展呈“V”字形,有些沿葉緣發(fā)生,造成中脈一側(cè)枯死。發(fā)病嚴(yán)重時(shí),病斑相互匯合,引起葉片枯死。

2.2 病原

病原菌在PDA培養(yǎng)基上菌落灰白色至肉粉色,分生孢子器埋生在菌絲中,孢子量少,菌絲呈紫紅色,菌絲壁較厚,產(chǎn)紫色色素,生長(zhǎng)速度0.73 mm/d(圖1a);在OA培養(yǎng)上的培養(yǎng)性狀同PDA培養(yǎng)基,生長(zhǎng)速度:0.99 mm/d,有少量分生孢子器,似乎孢子還未成熟(圖1b);在MEA培養(yǎng)基上,菌落黑灰色,有大量的分生孢子器,孢子角肉粉色,生長(zhǎng)速度0.44 mm/d(圖1c)。

圖1 柴胡斑枯病菌菌落及微觀形態(tài)Fig.1 Colonies and morphology of Septoria bupleuricola

挑取組織上病原并對(duì)分生孢子器切片觀察,此菌分生孢子器近球形或球形,黑褐色,器壁由1～2層細(xì)胞構(gòu)成,高66.4～90.2 μm(平均77.5 μm),直徑57.3～90.0 μm(平均70.5 μm)(圖1d),外壁細(xì)胞黑褐色,內(nèi)層淡褐色至無(wú)色,具圓形孔口,大小(10～30.2)μm×(10～31.4)μm,平均18 μm×20.25 μm,孔口細(xì)胞壁明顯增厚;分生孢子梗產(chǎn)生于內(nèi)壁細(xì)胞,無(wú)色,大小為(1.5～5.0)μm×(1.0～3.0)μm,平均2.7 μm×2.8 μm(圖1e)。分生孢子針形、基部較圓,頂部較細(xì)、無(wú)色,有些稍彎曲,具1～3隔膜,大小(13.0～26.0)μm×(1.5～3.0)μm,平均19.0 μm×2.0 μm(圖1f)。此菌分生孢子兩端和中間細(xì)胞均可萌發(fā)長(zhǎng)出無(wú)色芽管。經(jīng)分離培養(yǎng)和從組織上挑取病原鏡檢,內(nèi)有順序排列的小油珠。該菌引起的病害在甘肅省干旱地區(qū)種植的柴胡上發(fā)生普遍,且較嚴(yán)重。

依據(jù)形態(tài)和培養(yǎng)特性,根據(jù)參考資料,將柴胡斑枯病菌鑒定為真菌界無(wú)性態(tài)真菌柴胡殼針孢SeptariabupleuricolaSacc.。

2.3 柴胡枯斑病病原系統(tǒng)發(fā)育分析

通過(guò)對(duì)ITS、LSU、RBP2和β-tubline片段的擴(kuò)增和測(cè)序,得到長(zhǎng)度分別為516、894、1 166和423 bp的序列(登錄號(hào)分別為:KC874675,KY798144,KY798146和KY798145)。用BLASTn在GenBank中搜索并下載同源序列,通過(guò)多基因片段拼接并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)發(fā)現(xiàn),菌株TCM-5與寄生于柴胡B.chinense的柴胡殼針孢S.bupleuricola(菌株:CBS128601,CBS128603)聚類(lèi)在同一分支上(圖2),同時(shí)該菌株分生孢子1～3個(gè)隔膜,孢子大小為(15.3～38.8)μm×(0.9～1.2)μm,與柴胡殼針孢S.bupleuricola相似,依據(jù)多基因序列片段和形態(tài)鑒定結(jié)果,將柴胡斑枯病菌TCM-5鑒定為柴胡殼針孢S.bupleuricola。

圖2 柴胡斑枯病菌多基因序列分析Fig.2 Phylogenetic tree of 8 strains based on a combined dataset of ITS, LSU, RPB2 and β-tubulin sequences

2.4 病原菌生物學(xué)特性

2.4.1 溫度對(duì)菌絲生長(zhǎng),產(chǎn)孢和孢子萌發(fā)的影響

該菌在0～35℃范圍內(nèi)均能生長(zhǎng),適宜溫度為20～25℃,但生長(zhǎng)緩慢,5～25℃病菌的生長(zhǎng)量隨溫度的升高而緩慢升高,低于5℃或高于30℃生長(zhǎng)速率急劇下降,在20℃下,生長(zhǎng)速度最快，為0.6 mm/d,20 d時(shí)菌落直徑11.8 mm；而35℃時(shí)急劇下降,20 d菌落直徑僅為1.8 mm。這表明該菌生長(zhǎng)極其緩慢,并且高溫抑制該菌正常生長(zhǎng)發(fā)育(表1)。

該菌產(chǎn)孢溫度范圍較寬,在5～35℃均能產(chǎn)孢,適宜溫度為10～15℃,產(chǎn)孢量分別為18.1×104個(gè)/ cm2和18.5×104個(gè)/cm2,與其他溫度的產(chǎn)孢量存在極顯著的差異。低于5℃不產(chǎn)孢,高于30℃產(chǎn)孢量急劇下降(表1)。

表1不同溫度對(duì)柴胡殼針孢菌絲生長(zhǎng)、產(chǎn)孢量和孢子萌發(fā)的影響(20d)1)

Table1Colonydiameters,sporeproductionandgerminationratesofSeptoriabupleuricolaatdifferenttemperatures(20d)

溫度/℃Temperature菌落直徑/mmDiameterofcolony4d8d12d16d20d產(chǎn)孢量/×104·(cm2)-1Yieldofspores孢子萌發(fā)率/%Germinationrate8h12h24h36h48h60h72h00．00．00．00．5(1．3±1．2)e(0．0±0．0)c0．00．00．00．00．20．7(1．2±0．8)e50．00．00．50．8(2．2±1．0)cde(8．7±2．0)b0．00．30．81．82．54．2(5．7±1．0)e100．00．21．21．5(3．5±2．2)cd(18．1±1．2)a0．00．72．03．74．56．7(8．8±1．2)cd150．01．01．52．8(4．0±2．1)bc(18．5±3．0)a0．87．812．319．731．534．0(36．5±2．0)a200．01．56．08．8(11．8±3．2)a(12．0±2．4)b0．76．711．817．825．830．8(36．2±2．0)a250．01．74．88．2(11．3±2．0)a(4．0±1．2)c0．03．29．313．716．324．8(31．2±3．2)a300．00．31．84．5(5．7±1．0)b(1．4±1．0)c0．01．86．77．88．313．8(19．3±1．0)b350．000．51．0(1．8±1．0)de(1．4±1．0)c0．000．74．75．56．5(12．8±2．0)c

1) 表中數(shù)據(jù)為平均值±SD,同列數(shù)據(jù)后不同小寫(xiě)字母表示在0.05水平差異顯著。下同。

Data are mean±SD.Different lowercase letters in the same column indicate significant difference at 0.05 level by LSD. The same below.

分生孢子在0～35℃均可萌發(fā),15℃為適宜萌發(fā)溫度,30℃時(shí)萌發(fā)率急劇下降,35℃不萌發(fā)。該菌孢子萌發(fā)速度很緩慢,最適溫度下8 h萌發(fā)率0.8%,72 h最高萌發(fā)率達(dá)36.5%(表1)。由此可見(jiàn),病菌菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)速度均緩慢;孢子萌發(fā)和孢子形成的適溫均為15℃,而菌絲生長(zhǎng)的適溫為(20～25℃),由此可見(jiàn),柴胡殼針孢孢子形成、萌發(fā)和菌絲生長(zhǎng)緩慢,但是適應(yīng)溫度范圍較廣,所以在甘肅省發(fā)生面積和地域范圍較廣。

2.4.2 菌絲生長(zhǎng)、產(chǎn)孢及孢子萌發(fā)的光照條件

從表2可以看出,菌絲在連續(xù)光照條件下生長(zhǎng)較好,20 d菌落直徑可達(dá)到11.0 mm,產(chǎn)孢量最大,達(dá)到5.8×104個(gè)/cm2,顯著高于其他處理;同樣分生孢子在連續(xù)光照條件下,72 h萌發(fā)率最高達(dá)34.3%。而在光暗交替和連續(xù)黑暗條件下菌落生長(zhǎng)、產(chǎn)孢量和孢子萌發(fā)率無(wú)顯著差異,但均低于連續(xù)光照。表明連續(xù)光照有利于菌絲生長(zhǎng)、孢子萌發(fā)和病菌產(chǎn)孢。

表2不同光照對(duì)柴胡殼針孢菌絲生長(zhǎng)、產(chǎn)孢量(20d)和孢子萌發(fā)的影響

Table2Colonydiameters,sporeproduction(20d)andgerminationratesofSeptoriabupleuricolaatdifferentilluminationconditions

處理Illuminatingcondition菌落直徑/mmDiameterofcolony8d12d16d20d產(chǎn)孢量/×104個(gè)·(cm2)-1Yieldofspores孢子萌發(fā)率/%Germinationrate8h12h24h36h48h60h72h連續(xù)光照Continuousillumination1．24．57．2(11．0±3．2)a(5．8±1．5)a0．33．39．315．522．028．3(34．3±2．0)a光暗交替12hillumination/12hdarkness1．54．77．3(9．3±1．8)b(3．1±1．8)b0．24．811．814．217．023．7(31．5±3．2)b連續(xù)黑暗Continuousdarkness0．73．87．3(9．8±1．2)b(3．7±2．0)a0．04．210．312．013．821．0(28．7±2．3)b

2.4.3 菌絲生長(zhǎng)、產(chǎn)孢及孢子萌發(fā)的pH

表3結(jié)果表明:病菌生長(zhǎng)適宜的pH范圍較寬,在pH 4.0～10.0范圍內(nèi)均能生長(zhǎng),pH5.0時(shí)菌落生長(zhǎng)最快,20 d可達(dá)到13.8 mm;產(chǎn)孢要求的pH為5.0～9.0。其中以pH 5.5產(chǎn)孢量最大,達(dá)到6.7×104個(gè)/cm2,pH低于5.0和高于9.0均不產(chǎn)孢。

表4結(jié)果表明:分生孢子在pH 4.51～9.19間均可萌發(fā),以pH 6.49最好,72 h孢子萌發(fā)率達(dá)10.33%,pH高于7.00孢子萌發(fā)率逐漸下降。孢子的形成、萌發(fā)及菌絲的生長(zhǎng)均以偏酸性條件為好。

表3不同pH條件對(duì)柴胡殼針孢菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢量(20d)的影響

Table3Colonydiameters,sporeproduction(20d)ofSeptoriabupleuricolaatdifferentpHdegrees

pH菌落直徑/mm Diameterofcolony8d12d16d20d產(chǎn)孢量/×104個(gè)·(cm2)-1Yieldofspores4．01．34．57．5(8．5±0．8)c (0．0±0．0)c4．52．36．811．8(13．2±1．3)a(0．0±0．0)c5．04．37．812．0(13．8±1．2)a(4．0±0．7)bc5．50．53．06．2(11．5±1．3)b(6．7±0．5)a6．01．85．28．7(11．3±1．8)b(5．2±1．2)b6．51．24．59．0(11．7±2．2)b(5．2±3．7)b7．01．04．77．5(11．0±2．2)b(4．0±3．1)bc7．51．74．87．8(10．8±2．6)bc(3．9±0．2)bc8．02．24．57．7(9．8±2．1)bc(4．5±2．2)bc8．52．35．38．5(10．8±1．6)bc(1．7±1．2)c9．01．03．86．0(8．3±3．1)c(1．6±0．2)c9．51．03．06．2(8．7±1．3)c(0．0±0．0)c10．01．24．37．2(8．3±1．5)c(0．0±0．0)c

表4不同pH條件下孢子萌發(fā)率

Table4GerminationratesofSeptoriabupleuricolaatdifferentpHdegrees

pH孢子萌發(fā)率/% Germinationrate8h12h24h36h48h60h72h4．510．01．22．74．26．27．3(8．3±1．2)bc5．580．52．24．76．38．08．7(9．7±3．2)ab6．490．31．74．35．56．88．8(10．3±3．2)a7．000．31．53．85．26．36．7(7．3±2．6)cd7．410．01．03．54．24．55．2(5．7±0．8)d8．390．00．82．02．32．53．2(3．8±1．7)e9．190．00．71．71．82．22．8(3．5±0．3)e

2.4.4 孢子萌發(fā)的濕度條件

表5結(jié)果表明:分生孢子在相對(duì)濕度75%～99.5%和水滴中均可萌發(fā),以對(duì)照水滴中萌發(fā)最好,達(dá)到23.0%,與其他處理均有極顯著差異,其次為100%的相對(duì)濕度,萌發(fā)率13.7%,而RH在99.5%以下,孢子萌發(fā)率逐漸下降,70%時(shí)不萌發(fā)。

表5不同濕度對(duì)柴胡殼針孢孢子萌發(fā)率的影響

Table5SporegerminationratesofSeptoriabupleuricolaatdifferentrelativehumidities

相對(duì)濕度/%Relativehumidity孢子萌發(fā)率/% Germinationrate8h12h24h36h48h60h72h水滴Water0．0．20．51．711．819．321．0(23．0±3．3)a1000．00．00．75．38．710．3(13．7±2．6)b99．50．00．00．72．55．36．3(7．7±1．6)b980．00．00．31．52．84．3(5．8±1．4)b950．00．00．20．51．21．8(3．2±2．1)c900．00．00．00．30．81．5(2．3±1．2)cd850．00．00．00．20．30．8(1．7±1．6)cd800．00．00．00．00．20．7(0．8±0．5)d750．00．00．00．00．00．3(0．7±0．5)d700．00．00．00．00．00．0(0．0±0．0)d

2.4.5 孢子萌發(fā)的營(yíng)養(yǎng)條件

圖3表明,分生孢子在柴胡葉片浸漬液中萌發(fā)最好,萌發(fā)率達(dá)57.0%～60.33%,高出對(duì)照40.66百分點(diǎn),其次是柴胡根浸液和土壤浸漬液,分別為49.3%～60.5%及15.3%～26.5%,均高于清水對(duì)照的萌發(fā)率。

圖3 不同營(yíng)養(yǎng)液中柴胡斑枯病菌孢子萌發(fā)率(72 h)Fig.3 Spore germination rates (72 h) of Septoria bupleuricola in different nutrition media

圖4表明,柴胡斑枯病菌分生孢子萌發(fā)時(shí)速度很慢,即使在適宜的營(yíng)養(yǎng)液中,前期12 h萌發(fā)率在10%左右, 24～48 h間增長(zhǎng)至54%,說(shuō)明24～48 h是孢子萌發(fā)的最快時(shí)期,這與溫度、濕度等試驗(yàn)中的結(jié)果一致。

3 討論

3.1 病原

生于柴胡葉上的殼針孢屬真菌記載有4種:(1)S.amphigenaMiyake,其分生孢子器120～150 μm,分生孢子3個(gè)隔膜,大小(18～22)μm×(1.5～2)μm; (2)S.buplenricolaSacc.,其分生孢子大小(24～30)μm×2 μm;(3)S.buplenrina,其分生孢子3個(gè)隔膜,大小(32～43)μm×2.2 μm;(4)S.buplenri-taleatiDiet.,其分生孢子3個(gè)隔膜,大小(30～40)μm×2 μm[9]。白金鎧認(rèn)為這4種菌在形態(tài)上均與S.buplenri相似,其分生孢子器大小(55～135)μm×(50～110)μm,分生孢子1～4個(gè)隔膜,多為2～3個(gè)隔膜,分生孢子器球形,分生孢子隔膜和大小也均相近,均應(yīng)視為其異名。甘肅省柴胡斑枯病的病原通過(guò)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定,確定為S.bupleuricolaSacc.。

圖4 不同營(yíng)養(yǎng)液中柴胡斑枯病菌孢子萌發(fā)率Fig.4 Spore germination rate of Septoria bupleuricola in different nutrition media

3.2 病原菌的生物學(xué)特性

病原菌的培養(yǎng)特性和生物學(xué)特性與病害的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。殼針孢屬Septoria真菌是在全球分布最廣泛、最常見(jiàn)的一類(lèi)病原菌,寄主范圍廣泛,可寄生于很多植物的葉片和果實(shí)上,引起葉斑或果斑癥狀[20]。該屬真菌普遍生長(zhǎng)緩慢,菌絲生長(zhǎng)、產(chǎn)孢和孢子萌發(fā)均需要較低的溫度和持續(xù)的露水。如當(dāng)歸褐斑病菌Septoriasp.分生孢子萌發(fā)的適溫為20℃,相對(duì)濕度要求在75%以上[21]。本研究對(duì)柴胡斑枯病菌生物學(xué)特性的測(cè)定結(jié)果表明,該菌菌絲生長(zhǎng)、產(chǎn)孢和孢子萌發(fā)的最適溫度分別為20～25℃、15、10～15℃,孢子萌發(fā)相對(duì)濕度要求在75%以上,菌絲生長(zhǎng)、孢子萌發(fā)和產(chǎn)孢的適宜pH分別為5.0、6.49和5.5,因此在低溫,高濕和中性偏酸環(huán)境下該病易于侵染和發(fā)生。甘肅省定西地區(qū)柴胡主產(chǎn)區(qū)隴西縣、靈臺(tái)縣、渭源縣、漳縣及安定區(qū)等地屬高寒陰濕地區(qū),氣溫較低,陰濕多露,適于孢子的萌發(fā)和侵染,因此病害發(fā)生重。

3.3 防治建議

在栽培過(guò)程中,建議多采用玉米-柴胡和小麥-柴胡套種模式, 不僅利用前作物的遮陰保濕作用代替地面蓋草,節(jié)約了蓋草成本,有利于柴胡出苗、出壯苗,而且還可以減少病蟲(chóng)害的發(fā)生[22]。依據(jù)課題組對(duì)當(dāng)歸褐斑病防治的研究[23]以及國(guó)內(nèi)對(duì)龍膽草斑枯病的藥劑防治研究結(jié)果[24],建議在柴胡斑枯病發(fā)病初期噴施50%多菌靈可濕性粉劑600倍液、70%甲基硫菌靈可濕性粉劑700倍液、10%苯醚甲環(huán)唑水分散顆粒劑1 800倍液、78%波·錳鋅可濕性粉劑600倍液及70%丙森鋅可濕性粉劑600倍液。7～10 d噴施1次,連續(xù)噴施3次。并且在柴胡收獲后,徹底清除病殘組織,集中燒毀或漚肥,減少越冬菌源,可減輕來(lái)年病害的發(fā)生。

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(責(zé)任編輯： 田 喆)

PathogenidentificationandbiologicalcharacteristicsofleafspotonBupleurumchinense

Wang Yan, Jin Ling, Zeng Cuiyun, Luo Jun, Zhu Tiantian

(GansuUniversityofChineseMedicine,Lanzhou730000,China)

During disease surveys on medicinal plants in Gansu Province in 2011-2014, we found that leaf spot onBupleurumchinenseDC.was a serious disease with 13%-21% disease incidence and 1-2 level of disease severity. Morphological and molecular methods were combined to identify and test the biological characteristics of the pathogen. The pycnidia of the pathogen was spherical or sub-spherical, 66.4-90.2 μm (mean: 77.5 μm)in height, 57.3-90.0 μm (mean: 70.5 μm) in diameter, conidia hyaline, needle, with 1-3 septates of (13.0-26.0)μm×(1.5-3.0)μm (mean: 19.0 μm×2.0 μm) in size. Multi-locus phylogenic analysis of the five loci: ITS, LSU, RBP2 andβ-tubulin showed that the pathogen wasSeptoriabupleuricolaSacc. The temperature ranges of hypha growth, spore germination and production were 0-35, 0-35 and 5-35℃, respectively. The optimum temperatures were 20-25, 15 and 10-15℃, correspondingly. Continuous illumination facilitates hyphal growth, spore production and germination. The pH ranges of the hypha growth, spore germination and production were 4.0-10.0, 4.51-9.19 and 5.0-9.0, with the optimum values of 5.0, 6.49 and 5.5, respectively. The relative humidity for spore germination was above 75%. Spores germinated well in water. Root and leaf extracts stimulated spore germination. The optimum temperature for mycelium growth and spore germination of the pathogen was low, indicating that the disease might worsen under low-temperature, dewing and continuous rainy weather.

Bupleurumchinenseleaf-spot; morphology; multi-locus phylogeny; pathogen identification; biological characteristic

2017-01- 08

2017-03-03

國(guó)家自然科學(xué)基金(31460013);甘肅省科技計(jì)劃項(xiàng)目(1508RJ2A011);甘肅省科技計(jì)劃基礎(chǔ)研究創(chuàng)新群體(1606RJIA323);中央財(cái)政引導(dǎo)地方科技創(chuàng)新平臺(tái)項(xiàng)目(2016-A-02)

聯(lián)系方式 E-mail:gswangyan101@163.com

S 435.67

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2017.06.012