謝益暉，黃曹興，李鑫，賴晨歡，余世袁，勇強

(江蘇省林業(yè)資源高效加工利用協(xié)同創(chuàng)新中心，南京林業(yè)大學化學工程學院，南京 210037)

攪拌轉(zhuǎn)速和通風量對里氏木霉發(fā)酵β-甘露聚糖酶的影響

謝益暉，黃曹興，李鑫，賴晨歡，余世袁，勇強*

(江蘇省林業(yè)資源高效加工利用協(xié)同創(chuàng)新中心，南京林業(yè)大學化學工程學院，南京 210037)

發(fā)酵液中溶解氧濃度是好氧發(fā)酵過程中反映氧傳質(zhì)效率的綜合指標，維持發(fā)酵液適宜的溶解氧濃度是實現(xiàn)好氧發(fā)酵成功的關(guān)鍵所在，攪拌轉(zhuǎn)速和通風量是影響發(fā)酵液溶解氧濃度的重要參數(shù)。筆者研究了在3 L發(fā)酵罐中攪拌轉(zhuǎn)速和通風量對里氏木霉發(fā)酵合成β-甘露聚糖酶的影響。試驗結(jié)果表明，里氏木霉發(fā)酵β-甘露聚糖酶時攪拌轉(zhuǎn)速對氧傳質(zhì)效率的影響大于通風量。以質(zhì)量濃度為1 g/L的葡萄糖和21.95 g/L的微晶纖維素為碳源發(fā)酵合成β-甘露聚糖酶，當攪拌轉(zhuǎn)速450 r/min、通風量0.3 m3/(m3·min)時，發(fā)酵過程中溶解氧濃度保持在20%以上，發(fā)酵120 h，β-甘露聚糖酶活力、β-甘露糖苷酶活力和菌體質(zhì)量濃度達到最大值3.92 U/mL，0.033 U/mL和6.56 g/L。因此，發(fā)酵過程中溶解氧濃度維持在20%以上可獲得較高的β-甘露聚糖酶活力。

β-甘露聚糖酶；里氏木霉；氧傳質(zhì)；溶解氧濃度

β-甘露聚糖酶是一類能夠催化甘露聚糖、葡萄甘露聚糖、半乳甘露聚糖和半乳葡萄甘露聚糖主鏈的β-1,4-甘露糖苷鍵水解生成低聚糖和單糖的復合酶系[1]。β-甘露聚糖酶主要由β-甘露聚糖酶和β-甘露糖苷酶組成，還包括β-葡萄糖苷酶、α-半乳糖苷酶和脫乙酰酶等支鏈降解酶[2]，在飼料加工、造紙、咖啡提取、木質(zhì)纖維素糖化等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用[3-5]。里氏木霉(Trichodermareesei)除分泌纖維素酶[6]，還可分泌大量與植物纖維降解相關(guān)的多種聚糖降解酶系，其中包括β-甘露聚糖酶[7-8]。里氏木霉β-甘露聚糖酶酶系分泌組的主要特點為β-甘露糖苷酶活力低，因此里氏木霉β-甘露聚糖酶較適合應(yīng)用于選擇性降解甘露聚糖制備甘露低聚糖。有關(guān)里氏木霉β-甘露聚糖酶的制備研究主要集中在培養(yǎng)基組成和培養(yǎng)條件對酶合成的影響方面[9]，里氏木霉屬好氧微生物，有關(guān)氧傳質(zhì)對里氏木霉合成β-甘露聚糖酶的影響研究鮮見報道。在好氧發(fā)酵中，氧傳質(zhì)是影響酶活力的重要因素，而在機械通氣式發(fā)酵罐中，氧傳質(zhì)效率主要由攪拌轉(zhuǎn)速和通風量決定[10]。因此，筆者在3 L發(fā)酵罐水平上研究攪拌轉(zhuǎn)速和通風量對里氏木霉發(fā)酵產(chǎn)β-甘露聚糖酶的影響，研究結(jié)果可為β-甘露聚糖酶發(fā)酵技術(shù)的工業(yè)放大提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料

菌種：里氏木霉(Trichodermareesei)NL03，β-甘露聚糖酶生產(chǎn)菌株，于4℃條件下保存在PDA斜面培養(yǎng)基上，由南京林業(yè)大學生物化工研究所負責保存。

微晶纖維素(Avicel PH101)：購于Sigma公司，纖維素質(zhì)量分數(shù)為92%，纖維素結(jié)晶度為72%。洋槐豆膠：購于Sigma公司，半乳甘露聚糖質(zhì)量分數(shù)為56%。

1.2 培養(yǎng)基

活化培養(yǎng)基：Mandels培養(yǎng)基[11]。產(chǎn)酶培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖1.0；微晶纖維素21.95；硫酸銨4.12；尿素2.07；磷酸二氫鉀2.0；硫酸鎂0.08；氯化鈣0.4；七水硫酸亞鐵0.005；一水硫酸錳0.001 6；七水硫酸鋅0.001 4?；罨囵B(yǎng)基和產(chǎn)酶培養(yǎng)基分別用濃度為0.05 mol/L的檸檬酸緩沖液調(diào)節(jié)初始pH為4.8，培養(yǎng)基于121℃條件下滅菌30 min。

1.3 β-甘露聚糖酶發(fā)酵

β-甘露聚糖酶發(fā)酵在3 L發(fā)酵罐中進行(發(fā)酵罐型號BioFlo 110，攪拌器為六葉平直圓盤渦輪攪拌器，美國New Brunswick公司生產(chǎn))。將里氏木霉試管斜面菌種接入活化培養(yǎng)基中，于恒溫振蕩器中170 r/min、30℃條件下活化36 h，活化后的種子按接種量10%接入裝有1 500 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的3 L發(fā)酵罐中，于攪拌轉(zhuǎn)速為100～500 r/min和通風量為0.2～1.0 m3/(m3·min)條件下培養(yǎng)，通過發(fā)酵罐自動控制系統(tǒng)控制發(fā)酵液pH為4.8±0.2。產(chǎn)酶第1天溫度控制為(30±1)℃，第2天后控制為(28±1)℃。

1.4 分析方法

1.4.1 β-甘露聚糖酶活力測定

于25 mL刻度試管中加入0.9 mL質(zhì)量濃度為5.0 g/L的洋槐豆膠底物溶液(用pH 5.0檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液配制)，50℃條件下預熱5 min，加入0.1 mL經(jīng)適當稀釋的酶液，于50℃條件下反應(yīng)30 min后，立即加入3.0 mL DNS試劑，煮沸7 min，冷卻后定容至25 mL，搖勻，采用DNS法測定水解產(chǎn)生的還原糖[12]。以每分鐘水解底物產(chǎn)生1 μmol還原糖(以甘露糖計)的酶量定義為1個β-甘露聚糖酶活單位[13]。

1.4.2 β-甘露糖苷酶活力測定

在試管中加入0.1 mL適當稀釋的酶液和0.9 mL的1 mmol/L對硝基苯基-β-D-吡喃甘露糖苷(pNPM)溶液(50℃條件下預熱5 min)，于50℃下保溫10 min后，立即加入2.0 mL 1 mol/L的Na2CO3溶液終止反應(yīng)，加入10 mL蒸餾水，搖勻。于400 nm下測定釋放的對硝基苯酚吸光度。以每分鐘水解pNPM釋放1 μmol對硝基苯酚所需要的酶量定義為1個β-甘露糖苷酶活單位[13]。

1.4.3 菌絲體質(zhì)量濃度測定

由于發(fā)酵液中微晶纖維素和菌絲體難以分離，不能用常規(guī)方法測定菌絲體濃度，采用測定菌絲體中蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度的方法間接測定菌絲體質(zhì)量濃度[14]。取20 mL發(fā)酵液于3 000 r/min條件下離心10 min，棄上清液，使用60 mL蒸餾水分3次洗滌、離心，沉淀物中加入10 mL 0.2 mol/L的NaOH溶液，在100℃條件下煮沸20 min，于3 000 r/min條件下離心10 min，取上清液采用Bradford方法測定蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度。根據(jù)里氏木霉胞內(nèi)蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度與菌絲體質(zhì)量濃度之間的關(guān)系，計算菌絲體的質(zhì)量濃度。

1.4.4 溶解氧濃度測定

溶解氧濃度以溶解氧的相對濃度(dissolved oxygen tension，DOT)表示，即以一定條件下溶解氧量相對于飽和溶解氧量的百分比表示。未加菌種前，發(fā)酵罐在最適攪拌下的溶解氧濃度設(shè)為100%[10]。DOT采用Hamilton(瑞士)溶解氧電極測定，測定前須進行電極校正。

2 結(jié)果與分析

2.1 攪拌轉(zhuǎn)速對里氏木霉合成β-甘露聚糖酶的影響

在好氧發(fā)酵中，維持發(fā)酵液中一定的溶解氧水平是保證微生物發(fā)酵成功的關(guān)鍵。在發(fā)酵生產(chǎn)中，影響發(fā)酵液溶解氧濃度的主要因素為發(fā)酵罐結(jié)構(gòu)、攪拌轉(zhuǎn)速和通風量，其中攪拌轉(zhuǎn)速對溶解氧濃度的影響較大。在3 L發(fā)酵罐中，里氏木霉在通風量0.3 m3/(m3·min)條件下發(fā)酵產(chǎn)酶，攪拌轉(zhuǎn)速對β-甘露聚糖酶合成的影響如表1所示。由表1可知，里氏木霉在固定通風量0.3 m3/(m3·min)條件下發(fā)酵產(chǎn)酶時，攪拌轉(zhuǎn)速越大，越有利于菌絲體獲得更多的溶解氧用于菌體的增殖和酶的合成。在攪拌轉(zhuǎn)速低于450 r/min時，β-甘露聚糖酶活力、β-甘露糖苷酶活力和菌絲體質(zhì)量濃度隨攪拌轉(zhuǎn)速增加而升高，當攪拌轉(zhuǎn)速從100 r/min增大到450 r/min時，β-甘露聚糖酶活力、β-甘露糖苷酶活力和菌絲體質(zhì)量濃度分別從0.28 U/mL，0.005 U/mL和0.52 g/L升高至3.92 U/mL，0.033 U/mL和6.56 g/L。 當攪拌轉(zhuǎn)速高于450 r/min時，酶活力和菌絲體質(zhì)量濃度反而下降，其原因可能為攪拌轉(zhuǎn)速增加，攪拌槳對絲狀真菌的剪切力增大，導致菌絲體斷裂而影響菌體的增殖和酶的合成。Feng等[15]在6.6 L發(fā)酵罐中研究地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)以魔芋粉為碳源合成β-甘露聚糖酶時發(fā)現(xiàn)，當攪拌轉(zhuǎn)速從600 r/min增加至750 r/min后，盡管能保證發(fā)酵液中足夠的溶解氧濃度，但酶活力反而下降。該結(jié)果與本研究的結(jié)果一致，即發(fā)酵罐攪拌轉(zhuǎn)速達到一定值時，繼續(xù)提高轉(zhuǎn)速不利于微生物發(fā)酵合成β-甘露聚糖酶。

表1 攪拌速度對里氏木霉發(fā)酵合成β-甘露聚糖酶的影響Table 1 Effects of agitation speed on β-mannanasepreparation by Trichoderma reesei

2.2 攪拌轉(zhuǎn)速對發(fā)酵液中溶解氧濃度的影響

在好氧發(fā)酵過程中，發(fā)酵液中溶解氧濃度一般要求在臨界溶解氧濃度(維持微生物正常生長和代謝需要的最低溶解氧濃度)以上，絲狀真菌的臨界溶解氧質(zhì)量分數(shù)一般為20%[16]。里氏木霉在通風量0.3 m3/(m3·min)條件下發(fā)酵，發(fā)酵過程中不同攪拌轉(zhuǎn)速下溶解氧濃度的變化如圖1所示。由圖1可知，里氏木霉在3 L通氣攪拌發(fā)酵罐中發(fā)酵產(chǎn)β-甘露聚糖酶，在通風量0.3 m3/(m3·min)條件下，攪拌轉(zhuǎn)速對發(fā)酵液中溶解氧濃度影響較大。攪拌轉(zhuǎn)速分別為100，200和300 r/min時，當發(fā)酵過程進入菌體利用微晶纖維素進行增殖和酶合成時(12 h后)，溶解氧濃度快速下降并保持在較低水平，遠低于絲狀真菌的臨界溶解氧濃度(DOT=20%)，從而不能保證里氏木霉正常生長和酶合成對氧的需求，導致酶活力較低。當攪拌轉(zhuǎn)速增加至450 r/min時，在整個發(fā)酵過程中發(fā)酵液溶解氧濃度基本保持在臨界溶解氧濃度以上，滿足了里氏木霉菌體增殖和產(chǎn)酶對氧的需求。當攪拌轉(zhuǎn)速繼續(xù)增加至500 r/min時，在發(fā)酵過程中發(fā)酵液溶解氧濃度均高于攪拌轉(zhuǎn)速為450 r/min時的溶解氧濃度，但過高的攪拌轉(zhuǎn)速存在高剪切力、泡沫量大和動力消耗大等不利影響。

圖1 不同攪拌轉(zhuǎn)速下發(fā)酵液溶解氧濃度變化Fig. 1 Changes of dissolved oxygen tension at different agitation speeds

2.3 通風量對里氏木霉合成β-甘露聚糖酶的影響

通風量是影響好氧微生物發(fā)酵過程中氧傳質(zhì)的另一個因素，通風量越高，體積溶氧系數(shù)越大，但當通風量增加到一定值時，通風量對體積溶氧系數(shù)沒有影響。里氏木霉在3 L發(fā)酵罐中，于攪拌轉(zhuǎn)速450 r/min條件下發(fā)酵產(chǎn)酶，通風量對β-甘露聚糖酶合成的影響如表2所示。由表2可知，當攪拌轉(zhuǎn)速為450 r/min、通風量為0.3 m3/(m3·min)時，里氏木霉發(fā)酵產(chǎn)β-甘露聚糖酶活力最高。當通風量為0.2 m3/(m3·min)時，β-甘露聚糖酶活力、β-甘露糖苷酶活力和菌絲體質(zhì)量濃度均低于通風量為0.3 m3/(m3·min)時的酶活力和菌絲體質(zhì)量濃度，其原因可能是當通風量為0.2 m3/(m3·min)時，在發(fā)酵28～36 h時段內(nèi)發(fā)酵液中溶解氧濃度低于臨界溶解氧濃度(DOT=20%)，從而不利于里氏木霉的生長和酶的合成(圖2)。當通風量高于0.3 m3/(m3·min)時，盡管發(fā)酵液中溶解氧濃度均高于臨界溶解氧濃度，但酶活力和菌體質(zhì)量濃度反而降低，原因可能是過高的通風量使得發(fā)酵過程中產(chǎn)生大量泡沫，多數(shù)菌體存在于發(fā)酵罐上層泡沫中而得不到營養(yǎng)。

表2 通風量對里氏木霉發(fā)酵合成β-甘露聚糖酶的影響Table 2 Effects of aeration rate on β-mannanasepreparation by T. reesei

圖2 在通風量0.2 m3/(m3·min)下里氏木霉發(fā)酵的溶解氧變化Fig. 2 Change of dissolved oxygen tension in fermentationof T. reesei with aeration rate of 0.2 m3/(m3·min)

2.4 典型發(fā)酵過程分析

在好氧發(fā)酵過程中溶解氧濃度是表征微生物代謝的重要指標。里氏木霉以1 g/L葡萄糖和21.95 g/L微晶纖維素為碳源，在450 r/min、0.3 m3/(m3·min)條件下發(fā)酵合成β-甘露聚糖酶，發(fā)酵過程中溶解氧和主要參數(shù)變化如圖3和4所示。由圖3和4可知，里氏木霉在3 L通氣攪拌發(fā)酵罐中，于攪拌轉(zhuǎn)速450 r/min、通風量0.3 m3/(m3·min)條件下發(fā)酵產(chǎn)β-甘露聚糖酶，發(fā)酵0～6 h期間，菌體快速利用培養(yǎng)基中的葡萄糖用于生長，發(fā)酵液中氧的溶解速率低于菌體耗氧速率，溶解氧濃度迅速下降至45%；發(fā)酵6～12 h期間，培養(yǎng)基中葡萄糖基本消耗，菌體開始以微晶纖維素為碳源進行生長，由于菌體質(zhì)量濃度較低，其分解產(chǎn)生的葡萄糖量較少，因此菌體耗氧較少，發(fā)酵液中氧的溶解速率高于菌體攝取氧的速率，溶解氧濃度上升；發(fā)酵12～36 h期間，隨微晶纖維素分解的葡萄糖增加，菌體大量消耗葡萄糖進行增殖，菌體生長進入對數(shù)生長期，發(fā)酵液中氧的溶解速率低于菌體的攝氧速率，溶解氧濃度快速下降并維持在較低水平，且溶解氧濃度維持在臨界溶解氧濃度20%水平左右；在發(fā)酵36 h后，隨菌體生長進入穩(wěn)定期，表現(xiàn)為菌體生物量增長緩慢，菌體開始大量合成β-甘露聚糖酶，菌體耗氧量減少，發(fā)酵液中氧的溶解速率高于菌體攝氧速率，溶解氧濃度增加；發(fā)酵末期，隨菌體進入凋亡期，菌體開始死亡溶解，酶合成基本停止，發(fā)酵液中溶解氧濃度繼續(xù)增加。

圖3 典型發(fā)酵過程中的溶解氧變化Fig. 3 Change of dissolved oxygen tension duringtypical fermentation process

圖4 里氏木霉發(fā)酵合成β-甘露聚糖酶的發(fā)酵歷程Fig. 4 Course of β-mannanase fermentation by T. reesei

綜上可知，里氏木霉在3 L發(fā)酵罐中發(fā)酵合成β-甘露聚糖酶，當攪拌轉(zhuǎn)速和通風量分別為450 r/min和0.3 m3/(m3·min)時，可保證發(fā)酵過程中溶解氧濃度維持在臨界溶解氧濃度以上，從而滿足里氏木霉發(fā)酵對氧的需求。鑒于本研究所采用的3 L發(fā)酵罐規(guī)模較小，通風量結(jié)果可能存在一定誤差，今后將在本研究基礎(chǔ)上在更大規(guī)模發(fā)酵罐上開展研究，為β-甘露聚糖酶發(fā)酵的工業(yè)化放大提供更準確數(shù)據(jù)。

3 結(jié) 論

在3 L發(fā)酵罐水平上研究不同攪拌轉(zhuǎn)速和通風量對里氏木霉發(fā)酵合成β-甘露聚糖酶的影響。結(jié)果表明，里氏木霉以1 g/L葡萄糖和21.95 g/L微晶纖維素為碳源發(fā)酵合成β-甘露聚糖酶時，當攪拌轉(zhuǎn)速為450 r/min、通風量為0.3 m3/(m3·min)時，發(fā)酵120 h，β-甘露聚糖酶活力、β-甘露糖苷酶活力和菌體質(zhì)量濃度達到最大值分別為3.92 U/mL，0.033 U/mL和6.56 g/L。發(fā)酵液溶解氧濃度是反映微生物發(fā)酵時氧傳質(zhì)效率的綜合指標，里氏木霉發(fā)酵合成β-甘露聚糖酶，發(fā)酵過程中溶解氧濃度維持在20%以上可取得良好的發(fā)酵效果。

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Effectofagitationspeedandaerationrateonfermentationsynthesisofβ-mannanasewithTrichodermareesei

XIE Yihui, HUANG Caoxing, LI Xin, LAI Chenhuan, YU Shiyuan, YONG Qiang*

(Jiangsu Co-Innovation Center for Efficient Processing and Utilization of Forest Products, College of ChemicalEngineering, Nanjing Forestry University, Nanjing 210037, China)

Trichodermareeseiis a kind of microorganism that can secrete enzymes (cellulase, hemicellulase,β-mannanase etc.) by aerobic fermentation with carbon sources, nitrogen source, and nutritive salt. For aerobic fermentation, the concentration of dissolved oxygen of fermentation broth is a comprehensive index to reflect the oxygen transfer efficiency. Meanwhile, maintaining a suitable concentration of dissolved oxygen in the fermentation broth is important to aerobic fermentation. During the fermentation process, the agitation speed and the aeration rate are both important parameters for oxygen transferring. In this study, the effects of the agitation speed (100-500 r/min) and the aeration rate (0.2-1.0 m3/(m3·min)) on the production ofβ-mannanase byT.reeseiwere investigated in a 3 L fermentor. Specifically, theβ-mannanase activity,β-manosidase activity and biomass were investigated when different agitation speed and aeration rate were carried out. The results showed that both the increased agitation speed and aeration rate could lead to higher oxygen transfer efficiency. However, the effect of agitation speed on oxygen transfer efficiency was greater than that of aeration rate. With the fermentation conditions for 1 g/L of glucose and 21.95 g/L of microcrystalline cellulose as carbon sources at 450 r/min of agitation rate and 0.3 m3/(m3·min) of aeration rate for 120 h, the dissolved oxygen tension can be remained above 20% during fermentation process. Accordingly,T.reeseicould produce theβ-mannanase with maximalβ-mannanase activity,β-manosidase activity and biomass of 3.92 U/mL, 0.033 U/mL and 6.56 g/L, respectively. Therefore, it can be concluded that higherβ-mannanase activity can be obtained when the dissolved oxygen tension is maintained at more than 20% in the fermentation process.

β-mannanase;Trichodermareesei; oxygen transfer; dissolved oxygen concentration

2017-01-15

2017-03-03

國家林業(yè)公益性行業(yè)科研專項(201404615)；江蘇省前瞻性聯(lián)合研究項目(BY2015006-05)；江蘇省重點研發(fā)計劃(BF2015007)；江蘇高校自然科學研究項目(15KJB530009)。

謝益暉，男，研究方向為生物化工。

勇強，男，教授。E-mail:swhx@njfu.com.cn

TQ351

A

2096-1359(2017)06-0092-05