陳永平+張素青+李春青+高麗娜+時(shí)文博

摘 要：對(duì)淡水水體和沉積物中孔雀石綠（MG）及無色孔雀石綠（LMG）的高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）檢測(cè)方法進(jìn)行改進(jìn)。主要對(duì)水及沉積物中孔雀石綠及無色孔雀石綠提取試劑進(jìn)行優(yōu)化探索，結(jié)果表明：二氯甲烷作為提取試劑提取效果最佳，兩種待測(cè)物線性范圍為0.20～100 ng/mL，r2≥0.999，空白水體在2.0、10、25 ng/L 3個(gè)加標(biāo)水平下的平均回收率為78.3%～88.8%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.2%～3.3%，檢出限（LOD）和定量下限（LOQ）分別為0.20 ng/L和0.40 ng/L?？瞻壮练e物基質(zhì)在0.2、2.0、10 μg/kg 3個(gè)加標(biāo)水平下，平均回收率為78.9%～86.7%，RSD為0.6%～3.3%，檢出限（LOD）和定量下限（LOQ）分別為0.020 μg/kg和0.040 μg/kg。該方法靈敏度高、選擇性好，適用于淡水養(yǎng)殖環(huán)境水體和沉積物中MG和LMG的殘留測(cè)定。

關(guān)鍵詞：LC-MS/MS；淡水水體；沉積物；有色孔雀石綠；無色孔雀石綠

孔雀石綠（MG）是一種合成的工業(yè)染料[1]。由于其還具有有效殺滅真菌、寄生蟲等病原微生物的作用，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中曾被用來預(yù)防和治療受精卵和成魚的水霉病、鰓霉病和小瓜蟲病等，以及用于活魚運(yùn)輸、暫養(yǎng)和環(huán)境的消毒等[2]。然而，孔雀石綠在生物體內(nèi)有大量蓄積時(shí)，表現(xiàn)出高毒、代謝周期長(zhǎng)、“三致”等毒副作用，還對(duì)生物體的組織、生殖、免疫系統(tǒng)產(chǎn)生影響，尤其是其代謝產(chǎn)物無色孔雀石綠（LMG）毒性更大[3]。雖然孔雀石綠在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的違禁使用情況越來越少，但由于其曾經(jīng)被廣泛應(yīng)用，已對(duì)環(huán)境造成了嚴(yán)重的次生污染，經(jīng)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，MG和LMG主要存在于水體及表層沉積物中。目前，針對(duì)水體、沉積物環(huán)境中的痕量MG和LMG檢測(cè)方法相對(duì)還不成熟，當(dāng)前主要采用靈敏度較低的液相色譜法、超高效液相質(zhì)譜聯(lián)用法[4-6]。由于沉積物中富集多種有機(jī)質(zhì)，分析易產(chǎn)生干擾，導(dǎo)致高效液相色譜法定性不準(zhǔn)確。而高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法由于靈敏度高、選擇性強(qiáng)，因此針對(duì)MG和LMG藥物殘留檢測(cè)具有較強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)。目前報(bào)道了采用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定水或沉積物中MG和LMG殘留[6]，但其前處理方法較繁瑣，回收率低，不適合大批量樣品、痕量分析的需要。本研究充分利用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜靈敏度高、選擇性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，選擇乙腈、乙酸乙酯、按一定比例混合的乙腈和二氯甲烷、二氯甲烷、三氯甲烷等多種試劑提取化合物，通過加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)對(duì)比，篩選出二氯甲烷作為水體及沉積物中的孔雀石綠及其代謝物的提取試劑效果最佳，改進(jìn)后的方法高效、靈敏、定性定量準(zhǔn)確，可為孔雀石綠污染來源排查及評(píng)價(jià)養(yǎng)殖環(huán)境提供可靠的檢測(cè)手段。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器設(shè)備

液質(zhì)質(zhì)聯(lián)用儀（美國(guó)AB公司），天平（賽多利斯公司）；高速離心機(jī)（美國(guó)Sigma公司）；高速組織勻漿機(jī)（飛利浦公司 轉(zhuǎn)速10 000 r/min），MS1 Mini-shaker 渦輪振蕩器（IKA 公司）；MiLLi-Q純水器（MiLLipore 公司）；氮吹儀（Organomation Associates 公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（BUCHI 公司）；移液器（艾本德 公司）。

1.2 試劑與材料

有色孔雀石綠（MG）、無色孔雀石綠（LMG）、有色孔雀石綠-D5、無色孔雀石綠-D6標(biāo)準(zhǔn)品，純度均≥98%（德國(guó)Dr 公司）；甲醇、乙腈（色譜純，德國(guó)Merck公司）；二氯甲烷（色譜純，美國(guó)FLuka 公司）；實(shí)驗(yàn)用水由MiLLipore純水系統(tǒng)（美國(guó)MiLLipore公司）制備；乙酸銨（LC/MS 級(jí)）、乙酸（色譜純）、甲酸（純度>98%）均購(gòu)自美國(guó)FLuka公司；N，N，N'，N'-四甲基對(duì)苯二胺（TMPD，生物試劑），濃鹽酸（分析純）；乙酸銨（色譜純）；中性氧化鋁柱。

1.3 溶液

1.3.1 2 mmoL/L乙酸銨緩沖溶液 稱取0.030 g無水乙酸銨溶解于適量水中，定容至500 mL，再加入0.5 mL甲酸。

1.3.2 TMPD溶液（1.0 g/L） 稱取50 mg TMPD 溶于50 mL甲醇中。

1.3.3 有色孔雀石綠草酸鹽（MG）、無色孔雀石綠（LMG）及其內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（100 μg/mL） 準(zhǔn)確稱取適量的有色孔雀石綠、無色孔雀石綠及其內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品，分別用乙腈溶解并定容，-18 ℃避光保存，有效期1年。

1.3.4 混合標(biāo)準(zhǔn)及內(nèi)標(biāo)中間液（1.0 μg/mL） 分別準(zhǔn)確吸取1.00 mL有色孔雀石綠、無色孔雀石綠及其內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于100 mL容量瓶中，用乙腈稀釋定容，-18 ℃避光保存，有效期3個(gè)月。

1.3.5 混合標(biāo)準(zhǔn)使用液（0.10 μg/mL） 準(zhǔn)確吸取1.0 mL混合標(biāo)準(zhǔn)中間液于10.0 mL容量瓶中，用乙腈稀釋定容，-18 ℃避光保存，有效期1個(gè)月。

1.3.6 混合內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)使用液（0.10 μg/mL） 準(zhǔn)確吸取1.0 mL混合內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)中間液于10.0 mL容量瓶中，用乙腈稀釋定容，-18 ℃避光保存，有效期1個(gè)月。

1.3.7 混合標(biāo)準(zhǔn)工作液 臨用時(shí)準(zhǔn)確吸取一定量的混合標(biāo)準(zhǔn)使用液，加入混合內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)使用液20 μL，用乙腈和5 mmoL/L乙酸銨緩沖溶液（1：1，V/V）稀釋定容至1 mL，標(biāo)準(zhǔn)曲線系列濃度分別為0.50、1.0、2.0、5.0、10、20 ng/mL。

1.4 沉積物的制備

將剛采的濕沉積物置于陰涼通風(fēng)處風(fēng)干，風(fēng)干后再進(jìn)行敲碎、研磨直至成粉狀，密封于廣口瓶中，4 ℃冰箱保存，待測(cè)。

1.5 色譜條件

色譜柱：Shim-pack XR-ODS （75×2.1 mm， 2.2 μm）；色譜柱溫度：30 ℃；樣品盤溫度：15 ℃；流動(dòng)相A相：2 mmoL/L的乙酸銨水溶液（含0.1%甲酸）；流動(dòng)相B項(xiàng)：乙腈（0.1%甲酸）；進(jìn)樣體積：5 μL；流速：0.25 mL/min，具體參數(shù)見表1。endprint

1.6 質(zhì)譜條件

離子化模式：ESI源，正離子掃描；離子源溫度：600 ℃；氣簾氣：20 psi；碰撞氣（CAD）：中；離子化電壓：5 000 v；霧化氣：60 psi；輔助氣：40 psi。

掃描模式：選擇性離子掃描（MRM），母離子、子離子荷質(zhì)比、錐孔電壓和碰撞能量見表2。

1.7 前處理方法

水樣：取1 000 mL水，分液漏斗中，加入40 μL內(nèi)標(biāo)混合液（0.1 μg/mL），加入300 μL三甲基戊二醇（TMPD）溶液，加入30 mL的二氯甲烷，振搖5 min，靜置30 min，取下層二氯甲烷于雞心瓶中，再加入30 mL二氯甲烷重復(fù)一次，將下層液合并于雞心瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮近干，殘留物加入2.0 mL的乙腈-2 mmoL/L乙酸銨溶液（1∶1），渦旋振蕩1 min，超聲波振蕩2 min，過0.22 μm白色微濾膜于進(jìn)樣瓶中，上機(jī)測(cè)定。

粉末沉積物：準(zhǔn)確稱?。?.0±0.01） g粉末狀沉積物樣品于50 mL聚乙烯離心管中，加入40 μL內(nèi)標(biāo)溶液（100 ng/mL），加入200 μL TMPD溶液，加入10 mL二氯甲烷，渦旋震蕩2 min，超聲萃取5 min，6 000 r/min離心5 min，取上清液于20 mL玻璃離心管中，再向離心管中加入10 mL二氯甲烷，重復(fù)上述操作，合并上清液于20 mL玻璃離心管中，氮?dú)獯抵两桑瑲埩粑锛尤?.0 mL的乙腈-2 mmoL/L乙酸銨溶液（1∶1），渦旋振蕩1 min，超聲波振蕩2 min，過SHIMADZU-GL Ⅱ MCE 0.22 μm有機(jī)相濾膜后，上機(jī)測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 液相色譜及質(zhì)譜條件的優(yōu)化

在已有文獻(xiàn)的研究基礎(chǔ)上，無機(jī)相選擇2.0 mmoL乙酸銨0.1%甲酸，分別選擇乙腈、甲醇、乙腈（0.1%甲酸）、甲醇（0.1%甲酸）有機(jī)相，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明有機(jī)相為乙腈（0.1%甲酸）洗脫出峰效果最佳，這可能與梯度洗脫時(shí)甲酸濃度保持一致，離子化效果較好所致。

根據(jù)MG 和LMG 的化學(xué)性質(zhì)，選擇ESI 正離子模式。以濃度為50 ng/mL有（無）色孔雀石綠與氘代有（無）色孔雀石綠作為優(yōu)化標(biāo)液。首先通過Q1全掃描確定化合物母離子質(zhì)荷比，再通過Q3子離子掃描確定定量和定性離子的質(zhì)荷比，根據(jù)確定的母離子和子離子優(yōu)化去簇電壓和碰撞能量，最后優(yōu)化離子源溫度、電壓等參數(shù)。

2.2 水及沉積物中孔雀石綠提取劑的優(yōu)化

根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道沉積物中提取目標(biāo)化合物需加入一定量的TMPD作為抗氧化劑來提高樣品中MG 和LMG 的回收率[6]。本實(shí)驗(yàn)沉積物中孔雀石綠的提取選擇乙腈：二氯甲烷（15∶10）混合液、純乙腈、二氯甲烷分別作為沉積物、水基質(zhì)中孔雀石綠提取試劑，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：乙腈∶二氯甲烷（15∶10）混合液提取時(shí)，離心后不分層，將全部提取液濃縮至干，定容，測(cè)定結(jié)果回收率低于70%，實(shí)驗(yàn)耗時(shí)長(zhǎng)；純乙腈提取，濃縮較耗時(shí)，回收率低于70%，穩(wěn)定性差；二氯甲烷作為提取劑，再加入20 mL TMPD解吸附溶液，回收率80%以上，穩(wěn)定性好，最終二氯甲烷作為沉積物、水中孔雀石綠提取試劑。

本實(shí)驗(yàn)水體中目標(biāo)化合物的提取同理加入一定量的TMPD作為抗氧化劑來提高樣品中MG 和LMG 的回收率，提取方式選擇固相萃取柱富集和有機(jī)相（二氯甲烷、乙酸乙酯）富集兩種方式對(duì)比實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明固相萃取柱富集要求水體較純凈，實(shí)驗(yàn)過程過柱速度較慢實(shí)驗(yàn)耗時(shí)較長(zhǎng)，平均回收率60%～70%，有機(jī)相提取方式相對(duì)要求水體純凈程度較低，富集時(shí)間較短，兩種試劑提取效果表明二氯甲烷明顯優(yōu)于乙酸乙酯，平均回收率大于70%，最終實(shí)驗(yàn)選擇有機(jī)相提取方式，二氯甲烷作為提取水體中的目標(biāo)化合物的提取試劑。

2.3 方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線與準(zhǔn)確度

內(nèi)標(biāo)法定量，MG和LMG兩者質(zhì)量濃度均在0.2～100 ng/mL 范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系，線性方程：MG y=0.334 x+0.015 8（r2=1.000），LMG y=0.618 x+0.007 83（r2=1.000），r2均大于0.999?；厥章示笥?0%，大大減少了基質(zhì)效應(yīng)或其他實(shí)驗(yàn)條件帶來的偏差，采用向陰性樣品中添加標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的方法，進(jìn)一步考察方法的靈敏度。在方法規(guī)定的取樣體積和定容體積下，按3倍信噪比計(jì)算得該方法在環(huán)境水樣和底泥樣品中的檢出限（LOD）分別為0.2 ng/L和0.02 μg/kg，以信噪比S/N>10得其定量下限（LOQ）分別為0.4 ng/L和0.04 μg/kg。標(biāo)準(zhǔn)圖見圖1。

2.4 方法的回收率與精密度

采用空白加標(biāo)的方式，在環(huán)境水樣中分別添加2.0、10、25 ng/L，沉積物中MG 和LMG 分別添加0.20、2.0、10 μg/kg 3個(gè)濃度梯度，按照本方法處理后測(cè)定，回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差見表3。沉積物中有色孔雀石綠的平均回收率為82.9%～84.4%，RSD為1.4%～3.5%；沉積物無色孔雀石綠的平均回收率為78.9%～86.7%，RSD為0.8%～5.2%，沉積物中空白及加標(biāo)圖分別見圖2、圖3。水體中有色孔雀石綠的平均回收率為78.3%～86%，RSD為1.2%～2.6%；水體中無色孔雀石綠的平均回收率為81.5%～88.8%，RSD 為0.6%～3.3%。因此，MG和LMG在水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境水和沉積物中的加標(biāo)回收率均能達(dá)到檢測(cè)要求，說明本方法具有較高的準(zhǔn)確性。同時(shí)，RSD均低于15%，表明結(jié)果在置信區(qū)間內(nèi)，本方法具有較高的可靠性。

2.5 實(shí)際樣品的測(cè)定

采用該方法測(cè)定天津津南區(qū)、西青區(qū)6家水產(chǎn)養(yǎng)殖場(chǎng)的養(yǎng)殖池塘水體和沉積物中有（無）色孔雀石綠的殘留情況，結(jié)果表明：一家企業(yè)有無色孔雀石綠檢出，水中無色孔雀石綠濃度為2.1～4.3 ng/L，沉積物中無色孔雀石綠的濃度為0.6～3.5 μg/kg，其他企業(yè)均未檢出。經(jīng)進(jìn)一步調(diào)查，發(fā)現(xiàn)該養(yǎng)殖企業(yè)在幾年前確曾采用過MG來防治和治療水霉病，因此，該方法可用于水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境水體和底泥中MG 和LMG殘留量的測(cè)定。

3 結(jié)論

本文通過優(yōu)化液液萃取條件，改進(jìn)了水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境水體和沉積物中有（無）色孔雀石綠殘留的高靈敏分析和確證方法。結(jié)果表明，本方法在0.2～100 ng/mL 范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，水體和沉積物中的檢出限分別為0.2 ng/L 和0.02 μg/kg；相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD） 均小于15%。該方法步驟簡(jiǎn)單、回收率高、精密度良好，可作為水體和沉積物中MG及其代謝物L(fēng)MG殘留的檢測(cè)方法，并可為MG及LMG在水產(chǎn)品中的富集規(guī)律與養(yǎng)殖環(huán)境中MG及其代謝物L(fēng)MG殘留的相關(guān)性分析及毒理評(píng)價(jià)提供靈敏、準(zhǔn)確的分析手段，為水產(chǎn)品中MG及LMG溯源和質(zhì)量監(jiān)督提供檢測(cè)技術(shù)支持。

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