陳珺君+閔勇+劉曉艷+楊自文

摘 要：aiiA基因編碼的AiiA蛋白是一類由芽孢桿菌產(chǎn)生的酰基高絲氨酸內酯酶，能夠專一性地水解革蘭氏陰性菌分泌的AHLs信號分子，從而破壞依賴群體感應系統(tǒng)的致病機制，減輕病原菌的致病性。綜述了aiiA基因與AiiA蛋白的研究現(xiàn)狀、aiiA基因在抗病方面的研究進展及AiiA蛋白在工業(yè)發(fā)展的應用現(xiàn)狀等，以期為aiiA基因在更多領域的應用提供理論基礎。

關鍵詞：芽孢桿菌；群體感應；aiiA基因；N-?；呓z氨酸內酯（AHLs）

1994年，F(xiàn)uqua等[1]將細菌之間的一種細胞密度依賴的基因表達調控機制命名為群體感應（Quorum sensing，QS），其在能夠生物發(fā)光（冷光）的海洋細菌——費氏弧菌（Vibrio fischeri）中被發(fā)現(xiàn)。研究證明，群體感應系統(tǒng)存在于許多細菌之中，參與自身的許多生理過程，并且與其致病性相關。該系統(tǒng)是一種被細菌所利用的的信號系統(tǒng)，通過對細胞密度的改變來調控許多動植物病原菌致病基因的表達。具體來說，細菌自身能夠分泌一種小的化學信號分子，被稱為自誘導物（Autoinducer，AI），具有可擴散性，可自由通過細胞壁和細胞膜。其隨著細菌數(shù)量的增加而增加，當達到一個臨界濃度時，細菌群體就會表現(xiàn)為一個多細胞生命體，通過響應信號分子來調控它們的群體行為，對高的細胞密度做出反應，從而表現(xiàn)出單個細菌無法從事的某些生物行為和生理功能，獲得對自身有利的優(yōu)勢[2]。此外，研究者發(fā)現(xiàn)，細菌的群體感應與動植物病原菌毒性因子的產(chǎn)生、生物膜的形成、抗生素的產(chǎn)生以及生物發(fā)光有關，被越來越多的細菌用于強化它們與其他細菌、真菌、植物和動物的生存競爭[3～5]?？紤]到許多細菌都為動植物病原菌，且利用群體感應來調節(jié)自身生理過程增強其競爭力，因此，靶向干擾這種種內間細菌交流的模式對醫(yī)學、環(huán)境、農(nóng)業(yè)都有著重要的意義，它已成為微生物研究的一大熱點。

研究發(fā)現(xiàn)，N-酰高絲氨酸內酯（N-acylhomoserine lactones，AHLs）是一類廣泛存在于革蘭氏陰性細菌群體感應系統(tǒng)中的信號分子，AHLs介導的革蘭氏陰性菌群體感應系統(tǒng)是目前備受關注并且研究最有成效的[6]。研究表明，細胞合成AHLs信號分子和AHLs合成酶的活性相關，這種酶通常由LuxI的同源基因編碼，當所累積的AHLs分子濃度達到一定閾值時，就會與費氏弧菌（Vibriofischeri）LuxR蛋白同源轉錄調控子相互作用[3]，這些調控子便可調控微生物的許多生理行為，如可誘導調控胡蘿卜軟腐歐文氏菌（Erwinia carotovora）、費氏弧菌（Vibriofischeri）和銅綠假單胞（Pseudomonas aeruginosa）等許多病原菌致病基因的表達[1]，根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）Ti質粒接合轉移[1]，以及伯克氏菌（Burkholderia）的群集和蹭行運動、脂肪酶的產(chǎn)生、β-溶血作用、碳代謝等[7]。同時，它還能夠調控其他多種不同的生物功能，如毒力因子、抗生素、二級代謝物的產(chǎn)生、生物膜的形成、生成孢子以及生物發(fā)光等[3，8]。

研究發(fā)現(xiàn)，在大部分芽孢桿菌中存在的AiiA蛋白，能夠使AHLs的內酯環(huán)斷裂導致其失活，從而破壞革蘭氏陰性細菌的群體感應系統(tǒng)，減弱動植物病原菌的致病性[9]。近年來，越來越多的研究報道了芽孢桿菌屬中分布有AiiA蛋白。因此，本文介紹了aiiA基因和AiiA蛋白的研究現(xiàn)狀，aiiA基因在植物抗病方面的進展和轉aiiA基因植物方面的應用現(xiàn)況，以及AiiA蛋白在工業(yè)發(fā)展中的應用現(xiàn)狀，為進一步研究aiiA基因奠定基礎。

1 aiiA基因和AiiA蛋白的研究

1.1 aiiA基因的克隆

從2000年Dong等[9]首次從芽孢桿菌240B1克隆了一種新的內酯酶基因aiiA之后，國內外對aiiA基因越來越關注，接著Dong等[10]又從不同來源的菌株中獲得了9個具有AHLs內酯酶功能的基因，并對其基因序列進行分析，結果表明這些基因和aiiA240B1屬于同一個N-酰基高絲氨酸內酯酶家族。2004年，周燚等[11]根據(jù)蠟狀芽孢桿菌中的aiiA基因序列設計引物，從篩選得到的具有較強抗軟腐病活性的蘇云金芽孢桿菌H38中成功擴增出aiiA基因。河北工業(yè)大學的王艷敏[12]以馬鈴薯為材料，發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌Bt4和蘇云金芽孢桿菌山東亞種ACCC10314能有效地抑制病原菌對馬鈴薯的侵染，證明這2種菌中含有水解AHLs的水解酶。根據(jù)文獻發(fā)表的基因序列設計特異性引物，從這2個菌株中克隆出了aiiA基因。

為了更好地研究aiiA基因的功能，黃天培等[13～15]分別從蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis，Bt），蠟質芽孢桿菌（Bacillus cereus，Bc）和枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis，Bs）中成功克隆出了aiiA基因。近十幾年來許多研究也均能從Bt、Bc及Bs中克隆出aiiA基因，并在不同表達系統(tǒng)中表達具有高活性的AiiA蛋白。2013年丁賢等[16]根據(jù)細菌群體感應信號降解酶（AiiA）基因設計簡并引物，從海洋微生物ZD02基因組中擴增編碼AiiA的基因aiiA，篩選其陽性克隆，測序后并對其進行序列分析。以上研究為該序列的重組表達及其相關活性研究奠定了基礎。

在國內外學者的不斷探索下，最近對aiiA基因的來源有新的發(fā)現(xiàn)。Khoiri等[17]從31株細菌中分離出4株抗蘭花軟腐病致病菌Dickeya dadantii的細菌B37、BT2、GG3、GG6，通過對其16s rRNA進行序列分析，結果表明這些細菌和短小芽孢桿菌、蠟質芽孢桿菌ATCC14579和蘇云金芽孢桿菌ATCC10792有很高的相似性，這是首次以短小芽孢桿菌作為群體淬滅細菌進行報道。

1.2 aiiA基因和AiiA蛋白的生物信息學分析endprint

隨著生物信息學的發(fā)展，許多研究人員利用生物信息學的工具對aiiA基因的序列和AiiA蛋白的結構進行分析，結果發(fā)現(xiàn)aiiA基因有753個堿基，序列具有高度保守性和同源性[18]，與GeneBank上登陸的aiiA基因經(jīng)序列比對，相似度均在80%以上[19]。

AiiA蛋白含有250個氨基酸殘基，推測其分子量為28 kDa左右，等電點為4～5，含有金屬-β-內酰胺酶超家族和鋅依賴的水解酶及乙二醛酶這2個結構域[18]。該酶的氨基酸序列存在比較保守的區(qū)域，即HXHXDH基序，為含鋅水解酶家族的成員。在AHL水解酶中，His119、His188、His210組成催化活性中心。通過定點突變試驗，發(fā)現(xiàn)蛋白序列中保守區(qū)域和組氨酸殘基都是維持AiiA蛋白活性所必需的[9，12]。

2005年Liu等[20]利用單波長反常散射法測出了蘇云金芽孢桿菌AHL內酯酶即AiiA蛋白的三維結構，該研究表明該酶是金屬-β-內酰胺酶家族的成員，并且在它的活性中心有2個鋅離子，這些鋅離子起著調控許多配體的作用，被認為是將AHLs水解為開環(huán)產(chǎn)物的親核試劑，能夠破壞革蘭氏陰性細菌的群體感應。了解AiiA蛋白的詳細結構和作用的機制，有助于我們研究出更有效的生物防治的方法，為解決依賴群體感應系統(tǒng)的病害的消除提供一條新思路。

2 aiiA基因在抗病方面的進展

大部分動植物致病菌都為革蘭氏陰性細菌，利用群體感應進行侵害[21]。當其自身分泌的信號分子增加到臨界值時，細菌就會啟動自身致病基因的表達，從而達到使動植物致病的目的。例如主要由歐文氏菌（Erwinia）導致的馬鈴薯、蘭花、甜菜、玉米、胡蘿卜、芹菜、洋蔥等多種植物的軟腐病[10，22]，它能夠使正在生長以及儲存運輸中的植物發(fā)生腐爛；伯克氏菌（Burkholderia）群體感應引起的羊紅細胞的β-溶血作用[7]；哈維氏弧菌（Vibrio harveyi）導致的養(yǎng)殖對蝦和魚類的發(fā)炎充血癥狀[23]；以及銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa，Pa）引起的呼吸道感染、敗血癥、骨髓炎、心內膜炎和尿路感染等疾病[24]等。因此，尋找一條有效解決革蘭氏陰性致病菌群體感應的途徑對動植物抗病來說非常有必要。近幾十年科研結果表明，AiiA蛋白對降解AHLs信號分子有著顯著的作用，所以，可以從aiiA基因著手，通過構建工程菌以及轉基因動植物來抵抗病原菌的群體感應。

2.1 構建工程菌提高AiiA蛋白的活性

在aiiA基因的發(fā)現(xiàn)以及群體感應系統(tǒng)研究更為深入之后，近年來許多研究將目標轉向了尋找可以高效表達AiiA蛋白的表達系統(tǒng)，其中包括大腸桿菌、芽孢桿菌及酵母等表達系統(tǒng)。為了提高AiiA蛋白的活性，周燚等[11]從Bt中克隆出aiiA基因，并利用大腸桿菌表達載體PET-28a在BL21（DE3）中進行表達，獲得大量的包涵體蛋白，致病性檢測純化的AiiA蛋白對魔芋軟腐病菌CZY具有較強的致病活性。楊梅等[25]克隆了6株來源不同的蘇云金芽孢桿菌中的aiiA基因，并將aiiA-B15基因插入到大腸桿菌表達載體，構建重組質粒轉入大腸桿菌中表達，經(jīng)誘導劑誘導后得到大量的融合蛋白，并對表達條件進行優(yōu)化，結果表明，0.6 mmol/L IPTG，30℃下誘導3 h為最佳誘導條件。致病性檢測表明，該融合蛋白對胡蘿卜歐文氏軟腐病菌具有較強的抗病作用。由于所表達的融合蛋白多為不可溶的包涵體，楊梅等[26]又經(jīng)過分離、變性溶解、復性獲得具有生物活性的蛋白質，抑菌試驗證明，復性后的AiiA蛋白能夠有效抑制胡蘿卜歐文氏菌引起的馬鈴薯軟腐病。此外，楊梅等[27]還將蘇云金芽孢桿菌LLB15中aiiA基因克隆到pET-29a，在大腸桿菌BL21（DE3）中表達，經(jīng)過低溫IPTG誘導，獲得大量的可溶性蛋白，并在國內外首次純化了帶6-His標記的AiiA蛋白。

研究表明，芽孢桿菌中的AiiA蛋白為一種胞內蛋白，不能分泌到細胞外直接降解環(huán)境中的AHLs信號分子，且表達量低，因此構建外源高效分泌表達AiiA蛋白的工程菌是一條有效的解決途徑。朱晨光等[28]利用重疊延伸PCR，用殺蟲晶體蛋白基因cry3Aa啟動子替換aiiA基因本身的啟動子，構建了融合基因pro3A-aiiA并裝入穿梭載體pHT304，得到重組質粒并轉化Bt無晶體突變株BMB171，結果重組菌株AiiA蛋白表達量大幅度增加，并且對降解AHLs和抑制胡蘿卜歐文氏菌感染馬鈴薯的能力也明顯增強。這一研究成功將AiiA蛋白分泌到胞外，解決了AiiA蛋白表達和降解信號分子AHLs的局限性，大大提高了對病原菌的抑制作用。吳懷光等[29]為了進一步提高抗軟腐病工程菌的抗病活性，除了用殺蟲晶體蛋白基因cry3Aa啟動子來提高aiiA基因的表達量外，還利用蘇云金芽孢桿菌s-層表面展示系統(tǒng)構建了融合基因slh-aiiA，將2個融合pro3A-aiiA和slh-aiiA基因單獨或同時裝入穿梭載體中，轉化蘇云金芽孢桿菌無晶體突變株BMB171，同時利用溫度敏感型輔助質粒pEG922，在Bt體內發(fā)生同源重組，消除抗性基因等非必需片段，減少質粒的壓力。結果獲得的3個重組菌都能在Bt中穩(wěn)定高效地表達AiiA蛋白，其降解AHLs分子的能力和對胡蘿卜軟腐歐文氏菌的抑制作用都有所增強，且同時裝入2個融合基因AiiA蛋白的表達量和活性最高。這種同時將2個融合基因裝入同一表達載體的方法，對我們提高蛋白的表達量及活性有著重要的啟示，為基因工程操作提供了一種新方法。

此外，國內外學者為了獲得高效的生防效果，紛紛將aiiA基因轉入熒光假單胞菌中表達AiiA蛋白。2003年，Molina等[30]把aiiA基因轉入生防效果不顯著的熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）P3中，構建了能夠降解AHLs的生物防治菌株，轉化株P3/pME6863能夠顯著地減弱由胡蘿卜歐文氏菌導致的馬鈴薯腐爛以及土壤農(nóng)桿菌導致的番茄冠癭病。張霞等[31]將aiiA基因導入到植物根際促生熒光假單胞菌P303中，構建了防治效果良好的植物工程菌，其能在一定程度上抑制馬鈴薯和大白菜的軟腐病。endprint

婁瑞娟等[32]將aiiA基因克隆到畢赤酵母表達載體pPIC3.5K，轉化畢赤酵母GS115，經(jīng)一系列篩選過后獲得高拷貝表達盒的酵母轉化子，誘導表達后經(jīng)RT-PCR可檢測到重組菌中編碼aiiA基因的mRNA，同時SDS-PAGE和Western blot檢測結果顯示，aiiA基因在畢赤酵母中成功表達，以紫色桿菌突變株CV026為指示菌檢測發(fā)現(xiàn)目的蛋白能夠降解N-?；呓z氨酸內酯。

為了提高AiiA的表達量，近年來許多研究利用在不同表達系統(tǒng)中密碼子的偏好性，通過優(yōu)化aiiA基因密碼子的方式來實現(xiàn)。

曾世涌等[33]對蘇云金芽孢桿菌中aiiA基因的密碼子使用情況進行分析，比較了aiiA基因在大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌以及畢赤酵母中的密碼子偏好性。結果表明，aiiA基因偏好使用以A、T結尾的密碼子，且aiiA基因的密碼子用法在這幾種菌中都有不同程度的偏好差異，其中與畢赤酵母的密碼子用法差異最大；比較了aiiA基因分別以這幾種菌為宿主時密碼子的使用頻率，發(fā)現(xiàn)都存在不同程度的低頻密碼子聚集現(xiàn)象，這為以后在上述幾種表達系統(tǒng)中實現(xiàn)aiiA基因的高效表達提供了新思路。2014年，簡思美等[34]利用定點突變技術，對aiiA基因進行密碼子優(yōu)化，在畢赤酵母中進行分泌表達，抗病性實驗分析結果表明，分泌表達的AiiA蛋白能有效抑制胡蘿卜軟腐歐文氏菌（Erwinia carotovora）的致病性；之后，簡思美等[35]基于畢赤酵母基因組偏好密碼子數(shù)據(jù)表對編碼AiiA蛋白的堿基序列進行密碼子優(yōu)化，并構建多拷貝重組表達載體，成功表達出具有活性的AiiA蛋白。試驗結果表明，優(yōu)化后aiiA基因的表達量較優(yōu)化前的表達量有成倍地提高，但優(yōu)化后的多拷貝表達量增加并不明顯，結果表明優(yōu)化密碼子可以有效提高AiiA蛋白在畢赤酵母中的表達量，但是多拷貝表達載體對AiiA的表達促進作用并不顯著，提示未來探索AiiA蛋白在畢赤酵母中的高表達時，通過增加拷貝數(shù)來提高產(chǎn)量并不是一個很好的途徑，而進行密碼子的優(yōu)化可以有效提高產(chǎn)量。此外，AiiA蛋白在畢赤酵母中的分泌表達，拓寬了AiiA蛋白的獲取途徑，為AiiA蛋白的產(chǎn)業(yè)化提供理論依據(jù)。

2.2 轉aiiA基因植物的抗病研究

相比較傳統(tǒng)的昂貴且對環(huán)境不利的化學抗病方法，轉基因技術對于植物抗病研究也是一種有效的應對群體感應系統(tǒng)的途徑。2001年，Dong

等[36]將aiiA基因轉入馬鈴薯和煙草花葉中后，這2種轉基因植物表達的AHL內酯酶能夠淬滅群體感應的信號分子，并且提高對胡蘿卜軟腐歐文氏菌的抗性。柴鑫莉等[37]和Ban等[38]分別將蘇云金芽孢桿菌的aiiA基因的密碼子進行優(yōu)化后，利用農(nóng)桿菌介導的轉化法將人工合成優(yōu)化后的aiiA基因導入花魔芋中，AHLs酶活性檢測表明轉aiiA魔芋葉片的蛋白可以降解AHLs信號分子。且有相關研究證明，aiiA基因在轉基因魔芋中是穩(wěn)定和可遺傳的[39]。陳磊等[40]利用PCR技術從馬鈴薯塊莖基因組DNA中克隆塊莖特異性啟動子patatin，從蘇云金芽孢桿菌218中克隆aiiA基因，構建抗軟腐病植物表達載體pBI121-patatin-aiiA，并利用農(nóng)桿菌介導法將aiiA基因導入花魔芋，結果表明，轉化后的植株經(jīng)GUS染色，僅在花魔芋的球莖部位出現(xiàn)藍色斑點，經(jīng)PCR檢測，RT-PCR及Southern雜交檢測證實aiiA基因已整合到花魔芋基因組，初步表明aiiA基因可在魔芋球莖內特異性表達。本研究對今后魔芋通過分子遺傳工程改良軟腐病抗性具有一定的應用價值。

細菌軟腐病也是石斛蘭及其他蘭花栽培和生產(chǎn)中的一大病害。潘麗晶等[41]從Bt菌中克隆出aiiA基因，并裝載入植物表達載體構建出pSAN載體轉入石斛蘭中，獲得了轉aiiA基因植株，肖揚[42]將aiiA基因和抗菌肽hacD基因的成熟肽片段融合插入到一個雙元轉化載體中，構建了高效植物表達載體pC-AH。利用農(nóng)桿菌介導的轉化法轉化石斛蘭，經(jīng)過PCR、Southern blot分析，從13株獲得的抗性轉基因苗中確定了3株抗性苗的基因組中已整合了融合基因aiiA-hacD。這些研究為獲得具有抗軟腐病的石斛蘭品種打下基礎。

尾巨桉是尾葉桉與巨桉雜交種，樹高40m以上用途廣泛，但隨著桉樹林的擴大，病蟲侵害這一問題已逐漸成為桉樹種植的一大障礙。為了提高其抗病害的能力，Ouyang等[43]從枯草芽孢桿菌中克隆aiiA基因，構建植物表達載體Pcam-PPP3-aiiA，利用農(nóng)桿菌轉化法導入尾巨桉中進行表達，RT-PCR檢驗表明aiiA基因成功導入巨尾桉，致病性檢測結果表明轉aiiA基因植物較非轉基因而言，能夠延遲萎蔫和降低疾病的病情指數(shù)。這些試驗表明，aiiA基因在轉基因植物中的表達水平很高，足以減弱病原菌的生長以及疾病的發(fā)展，也意味著這種方法可以應用于其他農(nóng)作物，以達到增強抵抗植物病原菌能力的目的。

除了利用農(nóng)桿菌轉化法獲得轉aiiA植物，我國學者還嘗試了幾種其他將外源基因導入植物的方法。例如韓麗偉[44]利用花粉管道法將aiiA基因轉入大白菜二牛心品種中獲得轉aiiA基因大白菜；張言朝等[45]用子房注射法對南瓜子房進行aiiA基因的遺傳轉化等，這些研究表明，基因操作技術的進步為轉基因植物的發(fā)展奠定了堅實的技術基礎，有利于我們獲得更有益的轉基因植物及食品。

3 AiiA蛋白在酶的工業(yè)化方面的進展

AiiA蛋白是一種非常好的用于發(fā)展生物凈化藥物的材料，它能夠破壞工業(yè)和環(huán)境微生物的群體感應系統(tǒng)，但對于AiiA的商業(yè)化生產(chǎn)來說，有幾個局限，包括酶生產(chǎn)的高成本和缺少從應用環(huán)境中回收再利用的方法。對于高成本的問題，可以通過相同成本使產(chǎn)量最大化。Rajesh等[46]利用響應優(yōu)面化（RSM）及中心合成設計軟件優(yōu)化植物內生菌產(chǎn)氣腸桿菌培養(yǎng)條件，以C6-HSL為底物，和內生植物病菌的上清液共培養(yǎng)，以紫色桿菌CV026作指示菌，設計不同培養(yǎng)溫度，共培養(yǎng)時間，底物濃度及pH值來檢驗AHL內酯酶的產(chǎn)量以及相對活性，活性檢測結果表明，植物內生菌產(chǎn)氣腸桿菌能夠有效地抑制紫色桿菌素的產(chǎn)生，且優(yōu)化培養(yǎng)條件后增加了1.33倍的相對活性；二次回歸模型的方差數(shù)據(jù)分析表明RSM模型非?？煽?，有著較高的回歸系數(shù)以及低的變異系數(shù)。由此可見，優(yōu)化培養(yǎng)條件的策略對于酶的最大產(chǎn)生是一種非常有價值的手段。endprint

AiiA蛋白商業(yè)化的另一個局限性是從環(huán)境中回收再利用，也有一些專家做過一些嘗試。

Beladiya等[47]克隆、純化了重組的AiiA蛋白（r-AiiA），將其共價固定在磁性納米粒子（MNPs）上，并且在水溶液中對r-AiiA-MNPs納米生物催化劑群體感應淬滅的能力進行檢測，結果表明它能夠水解3-O-C10AHL以及在水溶液中抑制群體感應，并且利用外部磁場能夠將其從反應混合物中再生，且多次再生的r-AiiA-MNPs仍能夠水解3-O-C10AHL。

4 研究目的、意義及前景展望

隨著對AHLs信號分子調控的群體感應系統(tǒng)（QS）研究的深入，細菌的AiiA蛋白在抑制許多病原菌中發(fā)揮越來越重要的作用，已經(jīng)成為解決利用群體感應細菌病害的新方法，但其中仍有許多機制和過程不太清楚，有待進一步研究和探索。例如，如何讓來源于芽孢桿菌的aiiA在外源表達系統(tǒng)中高效表達，并且有抑菌活性；來源不同的aiiA基因，降解AHLs的效果差異很大的原因以及AiiA蛋白在細胞生長過程中何時發(fā)揮作用。此外，對于農(nóng)業(yè)和工業(yè)來說，AiiA蛋白的酶活力、熱穩(wěn)定性和存儲穩(wěn)定性極其重要。因此，發(fā)現(xiàn)新的aiiA基因，研究細菌群體感應系統(tǒng)的調控機理，不僅具有重要的理論意義，而且具有重要的實踐價值。目前研究aiiA基因的表達系統(tǒng)多集中在大腸桿菌、蘇云金芽孢桿菌、酵母等微生物中，除此之外，枯草芽孢桿菌也是當下研究和應用十分廣泛的微生物殺菌劑之一，其菌種資源十分豐富，能夠分泌抑菌物質和多種抗菌多肽，廣泛應用于醫(yī)藥和農(nóng)業(yè)行業(yè)。因此，在芽孢桿菌中表達aiiA基因，產(chǎn)生高效的AiiA蛋白，對構建植物生防菌有著重要的啟示。另外，構建轉基因植物也是預防病原菌的一條重要的途徑，所以我們要深入研究AiiA蛋白的作用機制，利用基因工程的工具，為構建更高效、廣譜的殺菌劑或殺蟲劑奠定基礎。

參考文獻

[1] Fuqua W C， Winans S C， Greenberg E P. Quorum sensing in bacteria： the LuxR-Lux family of cell density-responsive transcriptional regulators[J]. Journal of Bacteriology， 1994， 176（2）： 269.

[2] Schauder S， Bassler B L. The languages of bacteria[J]. Genes & Development， 2001， 15（12）： 1 468-1 480.

[3] Lin Y H， Xu J L， Hu J， et al. Acyl-homoserine lactone acylase from Ralstonia strain XJ12B represents a novel and potent class of quorum-quenching enzymes[J]. Molecular Microbiology， 2003， 47（3）： 849-860.

[4] Taga M E， Bassler B L. Chemical communication among bacteria[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences， 2003， 100： 14 549-14 554.

[5] Zhang L H， Dong Y H. Quorum sensing and signal interference： diverse implications [J]. Molecular Microbiology， 2004， 53（6）： 1 563-1 571.

[6] 吳紅，宋志軍.細菌與細菌之間的信息交流——革蘭氏陰性細菌的 Quorum-Sensing 系統(tǒng)[J].自然科學進展，2003， 13（7）：679-687.

[7] Ulrich R L. Quorum quenching： enzymatic disruption of N-acylhomoserine lactone-mediated bacterial communication in Burkholderia thailandensis[J]. Applied and Environmental Microbiology， 2004， 70（10）： 6 173-6 180.

[8] Kjelleberg S， Steinberg P， Givskov M C， et al. Do marine natural products interfere with prokaryotic AHL regulatory systems？[J]. Aquatic Microbial Ecology， 1997， 13（1）： 85-93.

[9] Dong Y H， Xu J L， Li X Z， et al. AiiA， an enzyme that inactivates the acylhomoserine lactone quorum-sensing signal and attenuates the virulence of Erwinia carotovora[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences， 2000， 97（7）： 3 526-3 531.

[10] Dong Y H， Gusti A R， Zhang Q， et al. Identification of quorum-quenching N-acylhomoserine lactonases from Bacillus species[J]. Applied and Environmental Microbiology， 2002， 68（4）： 1 754-1 759.endprint

[11] 周燚，孫明，喻子牛.蘇云金芽孢桿菌 AiiA 蛋白對魔芋軟腐病菌的抗病活性[J].武漢大學學報：理學版，2004，50（6）：761-764.

[12] 王艷敏.AHL 酶基因的克隆及序列分析[D].天津：河北工業(yè)大學，2005.

[13] 黃天培，楊梅，姚帆，等.蠟質芽孢桿菌aiiA基因的克隆及融合表達[J].福建農(nóng)林大學學報：自然科學版，2006， 35（3）：292-297.

[14] 黃天培，姚帆，潘潔茹，等.枯草芽孢桿菌新抗病基因aiiA 的克隆[J].福建農(nóng)林大學學報：自然科學版，2007，36（3）： 269-273.

[15] 黃天培.蘇云金芽孢桿菌的重要功能基因[D].福州：福建農(nóng)林大學，2006.

[16] 丁賢，孫威文，張殿昌，等.海洋微生物 ZD02 信號降解酶基因aiiA克隆及其生物信息學分析[J].生態(tài)學雜志，2013（8）：2 056-2 061.

[17] Khoiri S， Tri A D， Giyanto G. Identification of quorum quenching bacteria and its biocontrol potential against soft rot disease bacteria， Dickeya dadantii[J]. Agrivita， 2017， 39（1）： 45-55.

[18] 黃天培，潘潔茹，姚帆，等.蠟質芽孢桿菌?；呓z氨酸內酯酶基因的克隆及序列分析[J].武夷科學，2008（4）：374-378.

[19] 韓麗偉，屈淑平，崔崇士.aiiA基因在植物軟腐病研究中的應用進展[J].中國蔬菜，2011（8）：1-6.

[20] Liu D， Lepore B W， Petsko G A， et al. Three-dimensional structure of the quorum-quenching N-acyl homoserine lactone hydrolase from Bacillus thuringiensis[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 2005， 102（33）： 11 882-11 887.

[21] 溫曉芳.aiiA基因在大腸桿菌中的表達及其活性檢測[D]. 廣州：華南熱帶農(nóng)業(yè)大學，2005.

[22] Perombelon M C M， Kelman A. Ecology of the soft rot

Erwinias[J]. Annual Review of Phytopathology， 1980， 18（1）： 361-387.

[23] Austin B， Austin D A. Bacterial fish pathogens： diseases of farmed and wild fish. 4th edition[J]. UK： Praxis Publishing Ltd， 2007.

[24] 王瑤，戴岳，張勇，等.群體感應信號分子降解基因對銅綠假單胞菌毒力和生物膜形成的影響[J].中國科學：C 輯，2007，37（2）：234-240.

[25] 楊梅，姚帆，黃勤清，等.不同來源的蘇云金芽孢桿菌 aiiA 基因表達及其抗病性分析[J].應用與環(huán)境生物學報，2007，13（3）：373-381.

[26] 楊梅，郭麗清，關夏玉，等.AiiA 融合蛋白包涵體變性和復性的研究[J].福建師范大學學報：自然科學版，2008，24（4）：76-79.

[27] 楊梅，張鋒，林彬輝，等.AiiA 蛋白的可溶性表達及其抗菌活性研究[J].分子細胞生物學報，2008，41（6）：465-472.

[28] 朱晨光，孫明，喻子牛.帶 cry3Aa 啟動子的aiiA基因在蘇云金芽孢桿菌中的表達[J]. 生物工程學報，2003，19（4）：397-401.

[29] 吳懷光，葉偉星，喻子牛，等.在蘇云金芽孢桿菌中高效和穩(wěn)定表達 AiiA 蛋白[J].中國農(nóng)業(yè)科學，2007，40（10）： 2 221-2 226.

[30] Molina L， Constantinescu F， Michel L， et al. Degradation of pathogen quorum sensing molecules by soil bacteria： a preventive and curative biological control mechanism [J]. FEMS Microbiology Ecology， 2003， 45（1）： 71-81.

[31] 張霞，胡玉琴，賈振華，等.含蘇云金芽孢桿菌aiiA基因的重組熒光假單胞菌的構建及對軟腐病的抗病活性[J]. 華北農(nóng)學報，2006，21（4）：13-16.

[32] 婁瑞娟，張霞，羅利龍，等.aiiA基因表達載體的構建及其在畢赤酵母中的表達[J].微生物學通報，2010，37（5）： 658-663.

[33] 曾世涌，蘇小惠，謝盼盼，等.蘇云金芽孢桿菌中 aiiA 基因密碼子偏好性分析[J].生物技術進展，2013，3（4）：257-263.

[34] 簡思美，何晶晶，毛惠民，等.蘇云金芽孢桿菌 N-酰基高絲氨酸內酯酶基因（aiiA）在畢赤酵母中的優(yōu)化表達[J]. 農(nóng)業(yè)生物技術學報，2014，22（11）：1 347-1 356.endprint

[35] 簡思美，蔡斌斌，吳程，等.基因改造 AiiA 蛋白在畢赤酵母中的表達[J].福建師范大學學報：自然科學版，2015，31（6）：55-63.

[36] Dong Y H， Wang L H， Xu J L， et al. Quenching quorum-sensing-dependent bacterial infection by an N-acyl homoserine lactonase[J]. Nature， 2001， 411（6 839）： 813-817.

[37] 柴鑫莉，周盈，林擁軍，等.蘇云金芽孢桿菌抗軟腐病 aiiA 基因轉花魔芋研究[J].分子植物育種，2007，5（5）：613-618.

[38] Ban H， Chai X， Lin Y， et al. Transgenic Amorphophallus konjac expressing synthesized acyl-homoserine lactonase （aiiA） gene exhibit enhanced resistance to soft rot disease[J]. Plant Cell Reports， 2009， 28（12）： 1 847-1 855.

[39] 班慧芳.轉aiiA基因魔芋的軟腐病抗性及魔芋內生菌產(chǎn)生抑菌蛋白的組成分析[D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學，2009.

[40] 陳磊，廖甜甜，郭政宏，等.抗軟腐病基因在花魔芋塊莖 組織中特異表達的研究[J].分子植物育種，2014，12（6）：1 230-1 234.

[41] 潘麗晶，張妙彬，梁擎中，等.蘇云金芽孢桿菌 aiiA 基因載體構建及石斛蘭轉化[J].中山大學學報：自然科學版，2009，48（1）：67-71.

[42] 肖楊.雙價基因轉化石斛蘭的研究[D].廣州：中山大學，2010.

[43] Ouyang L J， Li L M. Effects of an inducible aiiA[J]. Transgenic Research， 2016， 25（4）： 441-452.

[44] 韓麗偉.花粉管通道法介導aiiA和TuMV-CP基因轉化大白菜的研究[D].哈爾濱：東北農(nóng)業(yè)大學，2011.

[45] 張言朝，葛宇，于楊，等.南瓜子房注射法遺傳轉化的研究[J].中國蔬菜，2012（16）：27-31.

[46] Rajesh P S， Rai V R. Use of aiiA gene amplification for AHL-lactonase production from endophytic bacterium Enterobacter species[J]. International Journal of Biological Macromolecules， 2015， 72： 1 013-1 019.

[47] Beladiya C， Tripathy R K， Bajaj P， et al. Expression， purification and immobilization of recombinant AiiA enzyme onto magnetic nanoparticles[J]. Protein Expression and Purification， 2015， 113： 56-62.endprint