蔡建

(鄭州大學(xué) 體育學(xué)院，河南 鄭州，450000)

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定運(yùn)動(dòng)飲料中的葉酸

蔡建

(鄭州大學(xué) 體育學(xué)院，河南 鄭州，450000)

建立了一種超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析運(yùn)動(dòng)飲料中葉酸的方法。樣品前處理用體積分?jǐn)?shù)10%乙醇沉淀提取后，采用Waters Atalantis T3色譜柱(2.1mm×150mm,3μm)分離，以0.1%甲酸-10.0 %甲醇為流動(dòng)相的梯度洗脫模式下，葉酸組分在1.0～200.0 ng/mL內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)r2為0.999 5，檢出限為0.4 μg/kg，定量限為1.5 μg/kg，加標(biāo)回收率為91.0%～98.6%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為2.1%～3.7%。該方法具有前處理簡(jiǎn)單、靈敏度高和檢測(cè)速度快的優(yōu)點(diǎn)，適用于運(yùn)動(dòng)飲料中較寬濃度范圍的葉酸含量的分析。

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜；運(yùn)動(dòng)飲料；葉酸

運(yùn)動(dòng)飲料是依據(jù)人體運(yùn)動(dòng)后身體消耗大量能量后，急需補(bǔ)充能量而配制成的一種富含多種營養(yǎng)元素的飲料[1-2]。運(yùn)動(dòng)飲料中營養(yǎng)物質(zhì)主要有糖類，電解質(zhì)，維生素，氨基酸等成分，都是人體所需的各種營養(yǎng)元素。其中葉酸是一種重要的水溶性維生素，是人體正常的物質(zhì)代不可缺少的化合物，在人體生長各個(gè)過程中發(fā)揮著重要的作用[3-5]。在我國標(biāo)準(zhǔn)GB 15266—2009《運(yùn)動(dòng)飲料》中[6]，僅針對(duì)VC、硫胺、核黃素這3種維生素作出了限量要求，葉酸含量未作出限量要求，但是針對(duì)特殊人群的飲料，有必要了解其葉酸的含量，以便保障人們科學(xué)、定量地?cái)z入此種維生素。

目前，國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 5009.211—2008《食品中葉酸的測(cè)定》和GB 5413.16—2010《嬰幼兒配方食品和乳品中葉酸(葉酸鹽活性)測(cè)定》中對(duì)食品和嬰兒食品和乳制品中葉酸的測(cè)定采樣微生物法[7-8]，此方法比較繁瑣，重復(fù)性差。其他一些文獻(xiàn)中檢測(cè)葉酸含量多采用紫外分光光度法、熒光法、液相色譜法、氣質(zhì)聯(lián)用和高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用等方法[9-15]。本研究利用質(zhì)譜的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式的選擇性和特異性，結(jié)合運(yùn)動(dòng)飲料中成分相對(duì)簡(jiǎn)單，可簡(jiǎn)化提取過程的特點(diǎn)，建立一種超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定運(yùn)動(dòng)飲料中葉酸的方法，靈敏度高，線性范圍寬，極大地提高了檢測(cè)效率，可為運(yùn)動(dòng)飲品中葉酸含量的測(cè)定提供技術(shù)支持和參考。

1 材料與方法

1.1儀器與試劑

超高效液相色譜儀-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜儀，美國Waters公司UPLC/XEVO TQ-S；標(biāo)準(zhǔn)品葉酸、13C5-葉酸放射性同位素內(nèi)標(biāo)，美國 Sigma公司；乙腈、甲醇均為色譜純，美國 Fisher Scientific 公司。

1.2超液相色譜條件

色譜柱：Waters Atalantis T3(2.1mm×150mm,3μm)；流速：0.2mL/min；進(jìn)樣量：10μL；柱溫：30℃；流動(dòng)相A為0.1 %甲酸水溶液，B為10.0 %甲醇；流動(dòng)相梯度洗脫程序見表1。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

采用針泵連續(xù)進(jìn)樣的方式，在正離子模式(ESI+)下，先對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行母離子全掃描，然后對(duì)其子離子進(jìn)行全掃描，分別選定定性離子和定量離子，并對(duì)噴霧電壓、離子源溫度、碰撞氣、掃描停滯時(shí)間、去簇電壓及碰撞電壓等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

葉酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：稱取5.0 mg的葉酸標(biāo)準(zhǔn)品，用0.02 mol/L的磷酸鹽緩沖液溶解并定容至50 mL，避光保存。

葉酸-13C5標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：稱取5.0 mg的葉酸-13C5標(biāo)準(zhǔn)品，用0.02 mol/L的磷酸鹽緩沖液溶解并定容至50 mL，避光保存。

準(zhǔn)確吸取上述葉酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，稀釋成濃度為1.0、10.0、20.0、100.0、200.0 ng/mL的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3.3 樣品前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

運(yùn)動(dòng)飲料若直接上樣測(cè)定葉酸含量，樣品中的干擾成分太多會(huì)影響測(cè)定，故要對(duì)運(yùn)動(dòng)飲料中的一些干擾基質(zhì)進(jìn)行沉淀凈化。本實(shí)驗(yàn)結(jié)合葉酸成分的化學(xué)性質(zhì)以及樣品為運(yùn)動(dòng)飲料的特性，比較了甲醇、10%甲醇、10%乙醇、10%乙腈等4種提取溶劑對(duì)目標(biāo)物的提取效果。

1.3.4 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)及樣品測(cè)定

以已知目標(biāo)成分含量的運(yùn)動(dòng)飲料為基質(zhì)，加入葉酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，選擇優(yōu)化后的前處理?xiàng)l件和儀器條件，上機(jī)檢測(cè)，計(jì)算回收率。

2 結(jié)果與討論

2.1色譜柱的選擇

食品中葉酸的檢測(cè)比較常用的色譜柱有C18柱和T3柱[16-18]。因此，本實(shí)驗(yàn)比較了Waters BEH C18(2.1 mm×150 mm，3 μm)和Waters Atalantis T3(2.1 mm×150mm，3 μm)這2款不同的色譜柱。結(jié)果發(fā)現(xiàn)葉酸是以離子形態(tài)存在于溶液中，在C18柱上的保留能力較弱，目標(biāo)物的總離子流圖的分析效果不理想；但是在T3柱分析柱上由于其特殊鍵合力，能與葉酸形成氫鍵的結(jié)合力強(qiáng)弱不同，在分離時(shí)更具有優(yōu)勢(shì)，目標(biāo)物的分離效果更好，所以本實(shí)驗(yàn)選擇T3柱進(jìn)行葉酸的分析色譜柱。

2.2流動(dòng)相體系的影響

在選擇T3柱作為葉酸的分析色譜柱的前提下，參考相關(guān)文獻(xiàn)[19-23]，本實(shí)驗(yàn)對(duì)甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸以及10%甲醇-0.1%甲酸等3種流動(dòng)相進(jìn)行比較，來考察對(duì)葉酸分析結(jié)果的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)10%甲醇-0.1%甲酸作為流動(dòng)相，葉酸的分離效果最好，目標(biāo)峰的分離度高，峰形尖銳，基線溫度。

2.3質(zhì)譜條件的優(yōu)化

采用針泵連續(xù)進(jìn)樣的方式，在正離子模式(ESI+)下，對(duì)濃度為100 ng/mL的葉酸的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行母離子全掃描，確定其分子離子，優(yōu)化各母離子的錐孔電壓。再在上述母離子的基礎(chǔ)上，對(duì)其子離子進(jìn)行全掃描，選擇2組豐度最高的離子，較高的作為定量離子，次之的為定性離子，并對(duì)噴霧電壓、離子源溫度、碰撞氣、掃描停滯時(shí)間、去簇電壓及碰撞電壓等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。

優(yōu)化后的質(zhì)譜參數(shù)為：噴霧電壓3 000 V、離子源溫度500 ℃、氮?dú)饬髁?5 L/min、掃描停滯時(shí)間40 ms，其他質(zhì)譜參數(shù)見表2。

表2 葉酸的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)掃描模式的質(zhì)譜參數(shù)

注: *定量離子(quantitative ion)。

依照表2所設(shè)定質(zhì)譜的條件，以及超高效液相色譜的條件，選擇多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM)進(jìn)行檢測(cè)，葉酸與其他成分能在5 min內(nèi)快速分離，葉酸及其同位素的MRM圖如圖1所示，子離子掃描圖如圖2所示。

圖1 葉酸及其同位素的MRM圖Fig.1 MRM chromatogram of folic acid, folic acid-13C5

A-葉酸離子掃描圖；B-葉酸-13C5離子掃描圖圖2 葉酸及其同位素的離子掃描質(zhì)譜圖Fig.2 Ion scan of folic acid and folic acid-13C5

2.4標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

為了驗(yàn)證葉酸成分在優(yōu)化好的儀器條件中的線性關(guān)系，配制了濃度為1.0、10.0、20.0、100.0、200.0 ng/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液上機(jī)進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，葉酸成分在1.0～200.0 ng/mL內(nèi)均具有良好的線性關(guān)系(r2gt;0.999)，并得到目標(biāo)組分的檢出限為0.4 μg/kg，定量限為1.5 μg/kg，結(jié)果見表3。

2.5提取溶劑的選擇

在對(duì)葉酸目標(biāo)物提取的過程中，目標(biāo)成分易被破壞以及樣品中沉淀所吸附，所以在前處理過程中既要考慮要保護(hù)好目標(biāo)成分也要避免目標(biāo)物被沉淀所吸附。本實(shí)驗(yàn)參考相關(guān)文獻(xiàn)[24-28]，結(jié)合葉酸物質(zhì)是水溶性物質(zhì)的特性以及樣品為運(yùn)動(dòng)飲料的特性，比較了甲醇、體積分?jǐn)?shù)10%甲醇、10%乙醇、10%乙腈等4種提取溶劑對(duì)目標(biāo)物的提取效果。

表3 葉酸的保留時(shí)間、標(biāo)準(zhǔn)曲線、相關(guān)系數(shù)、檢出限與定量限

圖3 提取液對(duì)葉酸的平均回收率的影響Fig.3 The effect of extract solution on the average recovery rate for folic acid

結(jié)果如圖3所示，4種提取溶劑中，10%乙腈為提取溶劑時(shí)，運(yùn)動(dòng)飲料中的葉酸回收率最高，其次為10%乙醇、10%甲醇；甲醇為提取溶劑時(shí)，雖然樣品中的基質(zhì)沉淀效果明顯，但是葉酸的回收率不高，可能是混合液對(duì)運(yùn)動(dòng)飲料中的葉酸有破壞作用；其中10%乙醇提取率雖不及10%乙腈的提取效果好，但是考慮到乙腈的毒性比乙醇大，以及成本問題，所以本實(shí)驗(yàn)還是選擇10%乙醇作為運(yùn)動(dòng)飲料葉酸成分的提取溶劑。

2.6加標(biāo)回收與樣品測(cè)定

在上述優(yōu)化后的前處理?xiàng)l件儀器條件下，利用已測(cè)定葉酸含量的運(yùn)動(dòng)飲料進(jìn)行加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)，在分別添加50、100、200 μg/100g等3個(gè)梯度濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)濃度平行測(cè)定5次，測(cè)定結(jié)果見表4。

表4 方法的回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=5)

由表4可見，葉酸的加標(biāo)回收率為91.0%～98.6%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為2.1%～3.7%，表明本實(shí)驗(yàn)所建立的方法具有可靠的準(zhǔn)確度和精密度。

本研究在市場(chǎng)上隨機(jī)抽取了10個(gè)批次的運(yùn)動(dòng)飲料，依據(jù)以上所建立的方法測(cè)定。測(cè)定結(jié)果顯示，所測(cè)定的運(yùn)動(dòng)飲料中都含有一定量的葉酸，但是所測(cè)品種之間葉酸的含量差別較大，10個(gè)批次的運(yùn)動(dòng)飲料的葉酸含量為46.4～260.9 μg/100g。

3 結(jié)論

本文建立了一種超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)運(yùn)動(dòng)飲料中葉酸含量的分析方法。結(jié)果表明，通過優(yōu)化后的質(zhì)譜條件，在MRM掃描模式下，葉酸組分能在5 min實(shí)現(xiàn)快速分離檢測(cè)。樣品經(jīng)過10%乙醇提取后，可有效去除運(yùn)動(dòng)飲料中的復(fù)雜基質(zhì)，可實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)物質(zhì)的凈化，能準(zhǔn)確快速有效地檢測(cè)運(yùn)動(dòng)飲料中的葉酸成分，對(duì)市場(chǎng)上隨機(jī)收取的10個(gè)批次的運(yùn)動(dòng)飲料進(jìn)行檢測(cè)，其含量為46.4～260.9 μg/100g。本方法具有快速、簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、靈敏等特點(diǎn)，可對(duì)較寬濃度范圍內(nèi)的葉酸含量進(jìn)行分析，有助于提高食品檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室的分析效率，降低成本，為運(yùn)動(dòng)飲料中葉酸的測(cè)定提供營養(yǎng)價(jià)值參考。

[1] 蔣俊樹,趙彬.高效液相色譜法測(cè)定能量飲料中多種水溶性維生素[J].食品科學(xué),2008, 29 (12): 635-637.

[2] 王榮艷,賈麗,錢春燕.HPLC-PDA法同時(shí)測(cè)定功能性飲料中9種水溶性維生素[J].現(xiàn)代科學(xué)儀器,2010, 8(4): 98-101.

[3] 蒲明清,戴舒春,張連龍，等.超高效液相色譜法測(cè)定保健食品中的多種水溶性維生素[J].現(xiàn)代食品科技,2012,28(7): 886-889.

[4] ASLAM J, KHAN S H, KHAN S A. Quantification of water soluble vitamins in six date palm (PhoenixdactyliferaL.) cultivar’s fruits growing in Dubai, United Arab Emirates, through high performance liquid chromatography[J]. Journal of Saudi Chemical Society, 2013,17(1): 9-16.

[5] BEITANE I, CIPROVICA I. The study of added prebiotics on B group vitamins concentration during milk fermentation[J]. AC Romanian Biotechnology Letters, 2011, 16(6): 92-96.

[6] 中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局，中國國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì).GB/T 15266—2008 運(yùn)動(dòng)飲料[S]. 北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社,2008

[7] 國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局. GB/T 5009.211—2008 食品中葉酸的測(cè)定[S]. 北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2008.

[8] 國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局.GB 5413.16—2010 嬰幼兒食品和乳品中葉酸的測(cè)定[S]. 北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2010.

[9] 劉莉治,羅曉燕,周洪偉，等.高效液相色譜柱后衍生法測(cè)定嬰幼兒食品中的葉酸[J]. 中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志,2007,17(7):1 179-1 180.

[10] 聶啟興,馮蕾,張媛媛，等.高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定發(fā)酵前后果蔬中4種水溶性維生素[J].食品科學(xué),2015,36(20):101-104

[11] 陳新,張風(fēng),李健.反相離子對(duì)高效液相色譜法測(cè)定啤酒中的B族維生素[J].釀酒科技, 2015(12): 119-121.

[12] 葉翠平,譚兆平,區(qū)碩俊.反相離子色譜法同時(shí)檢測(cè)皮炎軟膏中的6種水溶性維生素成分含量[J].當(dāng)代化工,2016,8:2 050-2 053.

[13] CHAMPAGNE C P, TOMPKINS T A, BUCKLEY N D, et al.Effect of fermentation by pure and mixed cultures of Streptococcus thermophilus and Lactobacillus helveticus on isoflavone and B-vitamin content of a fermented soy beverage[J]. Food Microbiology, 2010, 27(7): 968-972..

[14] 任丹丹,謝云峰,劉佳佳，等.高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定食品中9種水溶性維生素[J].食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào)，2014(3): 899-903.

[15] 張志清,白琦,湛珺雯. RP-HPLC法測(cè)定功能性飲料水溶性維生素含量[J]. 食品科學(xué), 2010, 31(14): 212-215.

[16] 周圍,王波,劉倩倩，等.超高效合相色譜法同時(shí)測(cè)定復(fù)合維生素片中11種脂溶性維生素及其衍生物[J].分析化學(xué), 2015,43(1): 115-120.

[17] 張榕杰,蘇永恒,王愛月.超高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定維生素強(qiáng)化食品中多種水溶性維生素[J].中國衛(wèi)生工程學(xué), 2008,7(1): 34-36.

[18] 賀利民,呂岱竹,蘇貽娟.高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定多種水溶性維生素[J].海南大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2004, 22(1): 54-60.

[19] 郭玉華,郁有祝.高效液相色譜法測(cè)定茶葉中五種水溶性維生素[J].食品研究與開發(fā), 2012(8): 138-140.

[20] 李克,王華娟,潘朝暉，等. 離子對(duì)反相高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定復(fù)合維生素片中4種水溶性維生素[J].色譜, 2013, 21(1): 66-68.

[21] 黃力,張寶川.HPLC法測(cè)定多維片中的水溶性維生素[J].中國藥事,2007, 21(4): 255-257.

[22] 高旭,李淑娟,安娟，等.高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定食品中8種水溶性維生素[J].中國醫(yī)藥指南, 2008, 6(19): 36-38.

[23] 張曉娜,校瑞,牛家華，等. HPLC同時(shí)測(cè)定維生素B片中4種水溶性維生素的含量[J].河南大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版, 2016(9):583-586

[24] 榮琳,邵麗華,王淑娥，等. HPLC-二極管陣列檢測(cè)器同時(shí)測(cè)定保健品中7 種水溶性維生素[J].衛(wèi)生研究, 2009, 38(5): 541-542.

[25] 白靖,向柏,申磊，等. HPLC法同時(shí)測(cè)定復(fù)合維生素口服液中4種水溶性維生素的含量[J]. 中國藥房, 2011, 22(29): 2 747-2 749.

[26] 李強(qiáng),李揮, 龐坤，等.功能性飲料中11種水溶性維生素的高通量檢測(cè)技術(shù)研究[J].河北省科學(xué)院學(xué)報(bào), 2012, 29(3): 44-48.

[27] 宋萍萍,劉書慧.反相高效液相色譜法測(cè)定果醋中的8種維生素[J].食品科學(xué),2012,33(12): 181-184.

[28] 華晶忠,劉笑笑,武巍，等.苜蓿中維生素C含量測(cè)定及變化規(guī)律[J]. 食品研究與開發(fā), 2016(1): 45-47.

DeterminationoffolicacidinsportsdrinkbyUPLC-MS/MS

CAI Jian

(Physical Education College of Zhengzhou University, Zhengzhou 450000, China)

Ultra high performance liquid chromatography mass spectrometry analysis method was used in the analysis of folic acid in sports drink. After treated with 10% ethanol precipitating, Waters Atalantis T3chromatographic column (2.1mm×150mm, 3μm) was used in separation, 0.1% formic acid-10.0% methanol was the mobile phase in gradient elution mode. The linear range of folic acid was in the range of 1.0-200.0ng/mL with a correlation coefficient of 0.999 5. The detection limit was 0.4 μg/kg and the quantitative limit was 1.5 μg/kg. The recovery rate was 91.0 %-98.6 %, and the relative standard deviation (RSD) was 2.6%-3.2 %. The method has the advantages of simple pretreatment, high sensitivity and fast detection rate. It is suitable for folic acid determination in a wide range of concentration in sports drinks. The study also provides a reference for nutritional value of folic acid.

UPLC-MS/MS；sports drink；folic acid

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.014420

學(xué)士，講師(本文通訊作者，E-mail:chwhg2016@sina.com)。

2017-03-31，改回日期：2017-05-18