楊卓，楊歡嵐，姚泓，周曉偉，唐書澤，吳希陽*

1(暨南大學 食品科學與工程系，廣東 廣州，510632) 2(嶺南國際企業(yè)集團有限公司，廣東 廣州，510064)

基因測序結(jié)合傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)用于脹罐醬油中產(chǎn)氣菌的檢測

楊卓1，楊歡嵐1，姚泓1，周曉偉2，唐書澤1，吳希陽1*

1(暨南大學 食品科學與工程系，廣東 廣州，510632) 2(嶺南國際企業(yè)集團有限公司，廣東 廣州，510064)

以工廠脹罐醬油為研究對象，對導致醬油脹罐的產(chǎn)氣菌進行分離和鑒定。使用高鹽MRS培養(yǎng)基 (含6% NaCl)分離到一種厭氧菌，經(jīng)產(chǎn)氣實驗證明該菌是導致醬油產(chǎn)氣脹罐的原因，經(jīng)16S rDNA基因測序以及高通量測序確證該厭氧產(chǎn)氣菌為破布子乳酸桿菌 (Lactobacilluspobuzihii)；采用高鹽PDA培養(yǎng)基沒有分離到酵母菌，且用多對18S rRNA引物對提取的基因組DNA進行PCR擴增陰性，證明醬油脹罐的原因為污染了破布子乳酸菌且沒有酵母菌或其他真菌污染。該研究顯示了基因測序方法對于食品中未知、難培養(yǎng)微生物污染的檢測具有優(yōu)越性。

脹罐醬油；高通量測序；分離鑒定；破布子乳酸桿菌(Lactobacilluspobuzihii)

醬油是我國常用調(diào)味品，其中若存在腐敗微生物則會出現(xiàn)不良風味，并影響口感[1]。若是醬油出現(xiàn)產(chǎn)氣、脹罐(脹袋)、爆瓶現(xiàn)象，均可能導致醬油的營養(yǎng)成分被破壞、pH值發(fā)生改變、產(chǎn)生有毒物質(zhì)等，進而造成經(jīng)濟損失[2]。醬油中導致脹罐產(chǎn)氣的微生物主要有腸桿菌、乳酸菌、酵母以及丁酸梭菌等[3-4]。醬油的生產(chǎn)常用酵母作為發(fā)酵菌，若發(fā)酵完成后對醬油的滅菌不徹底，造成酵母菌的殘留，或者酵母的二次生長，將成為安全隱患導致醬油出現(xiàn)脹罐等不利現(xiàn)象[5-6]。在醬油發(fā)酵過程中，乳酸菌對醬油風味物質(zhì)的形成有著重要的作用[7]。在醬油生產(chǎn)過程中如果還殘留有乳酸菌，某些種的乳酸菌的產(chǎn)氣特性也會造成醬油的脹罐[8]。

傳統(tǒng)微生物分離和鑒定主要通過形態(tài)觀察、選擇性培養(yǎng)基及生化反應等，但其特異性低、周期較長[9-10]。尤其對于未知、難培養(yǎng)微生物污染的檢測極其困難，影響了食品生產(chǎn)過程中的質(zhì)量與安全的檢控?，F(xiàn)代生物技術和分子生物學的蓬勃發(fā)展，16S rRNA、18S rRNA序列測定技術、高通量測序技術等新方法出現(xiàn)，研究人員可不再完全依賴傳統(tǒng)方法來研究微生物[11]。微生物的rRNA在堿基組成、堿基的序列、生物功能及高級結(jié)構(gòu)等方面表現(xiàn)出的高度保守性以及部分可變性[12-13]，人們通常利用恒定區(qū)序列設計出通用引物從微生物標本中擴增出16S rRNA的基因片段，通過克隆測序、探針雜交、酶切片段多態(tài)性分析等方法獲得16S rRNA序列信息并與數(shù)據(jù)庫進行比對來鑒定菌種[14]。這種耗時短、更精確的特點使16S rRNA序列測定技術成為細菌分類和鑒定的一個有力工具[15]。同樣具有相同原理的18S rRNA序列測定技術，也成為真菌鑒定的有力工具[16-19]。高通量測序被稱為新一代測序，不僅通量高，而且能夠同時分析上百個不同的樣品，能解析復雜環(huán)境中微生物群落物種組成和相對豐度，包括細菌、真菌、酵母以及古菌，因而被廣泛應用在食品中微生物多樣性和群落結(jié)構(gòu)組成的研究中[20-22]。本研究以2016年廣州某醬油工廠出現(xiàn)脹罐的醬油為研究對象，分析導致脹罐的原因。在傳統(tǒng)培養(yǎng)鑒定方法的基礎上，結(jié)合16S rDNA高通量測序來分離和鑒定脹罐醬油樣品中的產(chǎn)氣菌，以及醬油的微生物組成，為醬油的安全檢測和質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料及設備

1.1.1 實驗樣品

2批次脹罐醬油以及正常醬油樣品來自廣州某醬油廠。均為發(fā)酵生抽，1 L PPV罐包裝,常溫保存，脹罐醬油與正常醬油pH平均值分別為4.83、5.03，檢測日期為生產(chǎn)日期的第35天。

1.1.2 實驗試劑

MRS固體培養(yǎng)基、MRS肉湯培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖液，廣東陸橋微生物科技有限公司；分析純NaCl，天津大茂化學試劑廠；0X TBE液、DL2000DNA maker、RR01AM TaKaRa ExTaq，大連寶生物工程有限公司；瓊脂糖，廣州英濰捷基貿(mào)易有限公司；糞便基因組DNA提取試劑盒，天根生化科技有限公司天根；Tap PCR Master Mix(2X，Blue dye)、引物，生工生物(上海)股份有限公司；PDA培養(yǎng)基，青島高科園海博生物技術有限公司。

1.1.3 實驗設備

SW-CJ-1B型單人單面凈化工作臺，蘇州凈化設備有限公司；高速冷凍離心機、冷凍高速離心機，賽默飛世爾科技(中國)有限公司；LDZX-50KBS型立式高壓蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠公司；XW-80A型渦旋混合器，其林貝爾儀器制造有限公司；AY6907型厭氧培養(yǎng)罐，美國GeneScience公司；恒溫金屬浴，上海博通化學科技有限公司；PYX-250S-A生化培養(yǎng)箱，科力實驗儀器有限公司；微量移液器、Mastercycler Pro PCR擴增儀，德國Eppendorf公司；C-22厭氧指示劑、C-1厭氧產(chǎn)氣袋，日本三菱株式會社；PL602-S電子天平，METTLER TPLEDO；Tocan/Tocan240凝膠成像儀，Bio-rad；DYCZ-24DN核酸電泳儀，北京市六一儀器廠。

1.2方法

1.2.1 培養(yǎng)基及配制

MRS培養(yǎng)基購自廣東陸橋微生物科技有限公司，高鹽MRS培養(yǎng)基在MRS培養(yǎng)基里添加6% NaCl，121 ℃滅菌15 min。

滅菌醬油：取脹罐的醬油15 mL，105 ℃滅菌15 min。

PDA培養(yǎng)基購自青島高科園海博生物技術有限公司，高鹽PDA培養(yǎng)基在PDA培養(yǎng)基里添加6% NaCl，121 ℃滅菌15 min。

1.2.2 分離培養(yǎng)

脹罐醬油樣品用磷酸鹽緩沖液(PBS，pH=7.2)進行10倍稀釋。選擇合適的稀釋倍數(shù)吸取1 mL菌懸液倒板MRS、高鹽MRS、高鹽PDA培養(yǎng)基。將MRS、高鹽MRS平板置于37 ℃厭氧與好氧培養(yǎng)3 d，高鹽PDA平板置于28 ℃生化培養(yǎng)箱中好氧培養(yǎng)5 d，觀察結(jié)果并計數(shù)得到菌落總數(shù)。

1.2.3 醬油總基因組DNA的提取

取20 mL樣品于50 mL離心管中離心(12 000 g，5 min)，棄上清液，加入6 mL PBS置于渦旋混合器中重懸，重復離心與渦旋3次得到前處理液。 取2 mL前處理液使用天根公司的糞便基因組DNA提取試劑盒提取醬油總基因組DNA。將提取得到的DNA用nanodrop確定其濃度和純度后置于-20 ℃冰箱中備用。

1.2.4 PCR擴增

使用1對細菌通用引物和3對真菌通用引物對醬油總基因組DNA進行PCR擴增。根據(jù)表1不同引物配制體系，再依據(jù)表2設置相應的程序進行擴增。擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳分離。

表1 引物序列

表2 PCR反應程序

1.2.5 DNA測序

將得出特異性條帶的產(chǎn)物和提取的DNA樣品委托廣州生工生物工程有限公司以及廣州美吉生物醫(yī)藥科技有限公司分別進行16S rRNA測序以及高通量測序。

1.2.6 產(chǎn)氣試驗

將從高鹽MRS培養(yǎng)基中分離得到的細菌接種到高鹽MRS肉湯、滅菌醬油以及正常醬油中加入杜氏小管37 ℃厭氧培養(yǎng)3 d，觀察結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1傳統(tǒng)分離培養(yǎng)

本研究初期為了分離導致醬油脹罐的產(chǎn)氣菌，采用傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)法將醬油樣品接種到常規(guī)的細菌營養(yǎng)培養(yǎng)基和MRS培養(yǎng)基，在好氧和厭氧條件下均無菌落生長。表明該未知的產(chǎn)氣菌無法在普通的培養(yǎng)基上生長。鑒于醬油是一種高鹽含量的調(diào)味品，能在這種高鹽環(huán)境中生長判斷該菌是一種嗜鹽菌。將脹罐醬油樣品接種到高鹽MRS培養(yǎng)基，好氧培養(yǎng)結(jié)果為陰性，厭氧培養(yǎng)3 d后有菌落長出，2批脹罐醬油菌落平均數(shù)分別為370 CFU/mL和610 CFU/mL，菌落形態(tài)均一，而正常醬油樣品中未檢測出菌落。2004年吳瑞華等、2006年歐陽友生等在脹罐的醬油中發(fā)現(xiàn)產(chǎn)氣酵母[5-6]，因此為了探究是否存在產(chǎn)氣的酵母，使用高鹽PDA培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，在28 ℃下培養(yǎng)5 d未觀察到菌落。

2.2分子生物學鑒定

2.2.1 PCR擴增

挑取高鹽MRS培養(yǎng)基上的菌落進行細菌DNA提取，與脹罐醬油中提取得到的DNA分別進行PCR擴增，采用細菌通用引物27F/1492R在1 500 bp左右有目標條帶出現(xiàn)，這表明脹罐醬油中有細菌的污染。使用3對真菌通用引物未得到PCR產(chǎn)物，表明脹罐醬油中沒有真菌的污染。未脹罐的正常醬油中無法提取到細菌基因組DNA。

2.2.2 BLAST比對結(jié)果

為了鑒定該細菌，將PCR擴增產(chǎn)物委托廣州生工生物工程有限公司進行DNA測序。將得到的序列在NCBI上進行比對，結(jié)果顯示相似度最高的菌種名稱為破布子乳酸菌(Lactobacilluspobuzihii)(見表3)。

2.2.3 高通量測序

為了探究脹罐醬油中微生物群落結(jié)構(gòu)，將其中3瓶脹罐的醬油提取得到的DNA(編號為1、4、4-3)送至廣州美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進行宏基因組測序，得到微生物群落結(jié)構(gòu)圖(圖1)。顯示4-3號脹罐醬油中主要污染了破布子乳酸菌，而其他2個樣品中除了含有破布子乳酸菌，還存在普雷沃菌屬(Prevotella)、糞球菌屬(Faecalibacterium)、小桿菌屬(Dialister)、假丁酸弧菌屬(Pseudobutyrivibrio)。3個樣品中破布子乳酸菌的豐度各不相同，且4號樣品中普雷沃菌屬的豐度超過了破布子乳酸菌?；?-3號樣品的生產(chǎn)日期最早，1號樣品次之，4號最末，結(jié)合正常醬油中沒有提取到微生物的DNA，可能原因是作為優(yōu)勢菌群的破布子乳酸菌在脹罐醬油中不斷增殖，也與醬油中的其他菌群存在競爭，隨著時間推移，最終在脹罐醬油中占主導地位。對比1號樣品與4號樣品可以發(fā)現(xiàn)，破布子乳酸菌對普雷沃菌屬的抑制相較于其他細菌更加明顯，具體原因有待探究。

表3 目標菌株的16S rDNA序列BLAST比對結(jié)果

圖1 微生物群落組分圖Fig.1 Microbial community composition map

2.3產(chǎn)氣檢驗

為了驗證破布子乳酸菌是導致醬油脹罐的原因，將該分離菌接種到高鹽MRS肉湯中厭氧培養(yǎng)3 d，杜氏小管里沒有觀測到氣泡，在管底部僅有菌體沉淀生成。陰性對照管中沒有菌體沉淀表明不存在其他細菌的污染，這說明破布子乳酸菌不能在高鹽MRS肉湯中產(chǎn)氣。本研究所用脹罐醬油樣品均在工廠生產(chǎn)過程經(jīng)過巴氏殺菌后發(fā)現(xiàn)脹罐現(xiàn)象，因此為了盡可能在殺滅細菌的同時維持醬油的營養(yǎng)成分不受干擾，將脹罐醬油在105 ℃下滅菌作為液體培養(yǎng)基，雖然有部分美拉德反應，但是大部分的營養(yǎng)成分保留能夠提供破布子乳酸菌的生長需要，同時將正常醬油作為補充參照組。而將該分離菌接種到正常醬油以及滅菌的醬油中厭氧培養(yǎng)3 d后，接種了破布子乳酸菌的滅菌醬油和正常醬油中的杜氏小管里觀測到氣泡，陰性對照管中杜氏小管里沒有觀測到氣泡。表明破布子乳酸菌導致了醬油的脹罐，同時破布子乳酸菌需要處于醬油的理化與營養(yǎng)環(huán)境中才能產(chǎn)氣，在高鹽MRS肉湯中不能產(chǎn)氣。

3 討論

在對廣州某醬油廠的脹罐醬油進行產(chǎn)氣菌研究時，因為不了解未知產(chǎn)氣菌的營養(yǎng)要求，導致使用傳統(tǒng)培養(yǎng)方法無法分離到目標菌。經(jīng)提取脹罐醬油的總DNA并通過細菌16S rDNA測序分析發(fā)現(xiàn)該產(chǎn)氣菌為破布子乳酸菌。該細菌的首次報道是從臺灣高鹽發(fā)酵食品破布子中用6%NaCl的鹽度分離出來的一種耐高鹽厭氧乳酸菌[32]，本實驗據(jù)此改用含6% NaCl的MRS培養(yǎng)基形成高鹽環(huán)境，在厭氧環(huán)境培養(yǎng)成功，從脹罐醬油中分離得到破布子乳酸菌。在對該菌進行產(chǎn)氣驗證時，發(fā)現(xiàn)該細菌僅能在醬油中產(chǎn)氣，在高鹽MRS肉湯中僅能生長而不產(chǎn)氣，具體原因有待進一步探究。

2004年吳瑞華等，2006年歐陽友生等在脹氣的醬油中發(fā)現(xiàn)產(chǎn)氣酵母[5-6]，說明酵母污染的可能性。本實驗結(jié)合18S rRNA測序以及傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法排除了酵母或其他產(chǎn)氣真菌的存在，最終確認導致醬油脹氣的產(chǎn)氣菌為破布子乳酸菌。顯示DNA測序分析技術能快速、準確地鑒定細菌的特性，結(jié)合傳統(tǒng)培養(yǎng)方法，能極大地便利未知食品腐敗菌的檢測。

破布子乳酸菌主要用于食品破布子的發(fā)酵[32]，這是國內(nèi)第1次在脹罐醬油中發(fā)現(xiàn)。破布子乳酸菌雖然不是致病菌，但其本身具有產(chǎn)氣性，大量存在于醬油中，導致醬油脹罐，影響醬油的外形美觀及質(zhì)量。在微生物群落結(jié)構(gòu)分析中發(fā)現(xiàn)，脹罐醬油中除了存在大量破布子乳酸菌外，還有其他細菌的存在，很可能是灌裝醬油滅菌不徹底的原因。因此在醬油的生產(chǎn)中，應當嚴格把控滅菌環(huán)節(jié)，同時嚴格區(qū)分無菌區(qū)和有菌區(qū)，避免交叉污染，導致不合格產(chǎn)品的出現(xiàn)。

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Genesequencingandtraditionalmicrobialcultureforthedetectionofaerogeninswelledpackingsoysauce

YANG Zhuo1, YANG Huan-lan1, YAO Hong1, ZHOU Xiao-wei2, TANG Shu-ze1, WU Xi-yang1*

1(Department of Food Science amp; Engineering, Jinan University, Guangzhou 510632,China) 2(Lingnan International Enterprise Group Co., Ltd, Guangzhou 510064,China)

In order to identify the aerogen which causes the packing soy sauce swelled, two swelled packing soy sauce from a factory in Guangzhou were analyzed. Using MRS medium with 6% NaCl to cultivate the bacteria in swelled soy sauce, an anaerobic bacteria was isolated. It was further identified asLactobacilluspobuzihiiby using 16S sequencing and high-throughput sequencing. Yeast or fungus contamination was not detected in the swelled packing soy sauce by using high-salt PDA medium cultivation and PCR amplification with 18S rRNA primers. Therefore,Lactobacilluspobuzihiicontamination was validated as the reason causing the packing soy sauce swelled. Result of this study showed the superiority of gene sequencing method in detecting the unknown and hard-cultivated microorganism in food contamination.

Swelled packing soy sauce; high-throughput sequencing; isolation and identification;Lactobacilluspobuzihii

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.015065

碩士(吳希陽教授為通訊作者,E-mail：tkentwu@jnu.edu.cn)。

廣東省科技計劃項目(2015A050502030，2016A050503031)

2017-06-29，改回日期：2017-07-12