王安鳳，趙永強(qiáng)，陳勝軍*，李來(lái)好，楊賢慶，吳燕燕，楊少玲，李春生

1(中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院 南海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家水產(chǎn)品加工技術(shù)研發(fā)中心，廣東 廣州，510300)2(上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院，上海，201306)

響應(yīng)面法優(yōu)化合浦珠母貝肉水解工藝

王安鳳1,2，趙永強(qiáng)1，陳勝軍1*，李來(lái)好1，楊賢慶1，吳燕燕1，楊少玲1，李春生1

1(中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院 南海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家水產(chǎn)品加工技術(shù)研發(fā)中心，廣東 廣州，510300)2(上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院，上海，201306)

采用響應(yīng)曲面法對(duì)合浦珠母貝肉的酶解工藝進(jìn)行優(yōu)化。以水解度為評(píng)價(jià)指標(biāo)，分別考察加酶量、液料比、酶解時(shí)間和酶解溫度對(duì)水解效果的影響。結(jié)果表明，貝肉最佳水解條件為加酶量5 680 U/g、液料比2.8∶1(mL∶g)、酶解時(shí)間6.5 h、酶解溫度55 ℃，在此條件下水解度為(44.27±1.23)%，與預(yù)測(cè)值基本吻合。該工藝簡(jiǎn)單方便，水解效果好，可用于指導(dǎo)生產(chǎn)實(shí)踐。

合浦珠母貝肉；酶解；響應(yīng)曲面法；水解度

合浦珠母貝(Pinctadafucata)是在我國(guó)海水珍珠人工培育中占比高達(dá)總產(chǎn)量90%以上的貝類[1]。近年來(lái)，單海南、廣東和廣西三省每年采珠后所得的貝肉副產(chǎn)物的產(chǎn)量就約4 000 t[2]。相關(guān)研究表明，貝肉中不僅含有豐富的維生素、蛋白質(zhì)、糖原、氨基酸、牛磺酸等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，還具有鋅、硒等多種對(duì)人體健康起著積極作用的礦物質(zhì)[3-4]。合浦珠母貝肉不僅可經(jīng)調(diào)味等工藝直接制備成即食性食品[5-6]，還可用酶水解后再通過(guò)美拉德反應(yīng)、微生物發(fā)酵、物理吸附等方式對(duì)酶解液風(fēng)味進(jìn)行改良后加工成調(diào)味品[7-9]。貝肉經(jīng)酶解后，氨基酸和短肽等營(yíng)養(yǎng)成分的含量會(huì)增加，也更益于人體的吸收利用[10]和腸道健康[11-12]。本文以合浦珠母貝肉為原料，以水解度值為指標(biāo)，考察加酶量、酶解溫度、料液比和酶解時(shí)間的變化對(duì)其的影響，并運(yùn)用響應(yīng)面法進(jìn)行工藝優(yōu)化。

1 材料和方法

1.1材料與試劑

合浦珠母貝肉，購(gòu)于湛江龍之珍珠有限公司；甲醛(分析純)，廣州化學(xué)試劑廠，枯草桿菌蛋白酶(2.1×105AU/g)(食品級(jí))，丹麥諾維信公司；中性蛋白酶(≥100 U/mg)、木瓜蛋白酶(≥800 U/mg)、胰蛋白酶(≥250 U/mg)、風(fēng)味蛋白酶(≥120 U/mg)、復(fù)合蛋白酶(≥120 U/mg)(食品級(jí))，廣州市齊云生物技術(shù)有限公司。

1.2儀器與設(shè)備

電子天平，德國(guó)Sartorius公司；THZ-82水浴恒溫振蕩器，精達(dá)儀器制造有限公司；Kjeltel2300凱氏定氮儀，丹麥FOSS儀器有限公司；Delta 320精密pH計(jì)，上海梅特勒-托利多儀器有限公司；日立L-8900氨基酸分析儀，中國(guó)天美科學(xué)儀器有限公司；日立835-50型氨基酸分析儀，日本Hitachi公司；Akku-drive電位滴定儀，德國(guó)赫施曼公司；3K30型高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)Sigma公司；DS-1高速組織搗碎機(jī)，上海標(biāo)本模型廠。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 酶解

合浦珠母貝肉經(jīng)清洗、絞碎后加入到緩沖液中，添加相應(yīng)蛋白酶后放置振蕩恒溫水浴鍋里進(jìn)行水解。達(dá)到預(yù)定時(shí)間后，將樣品置于沸水中，高溫滅酶12min，冷卻后在9 000 r/min的條件下離心20 min，取上清液測(cè)定其中的游離氨基氮含量，隨后進(jìn)一步計(jì)算水解度。

1.3.1.1 總氮含量的測(cè)定

半微量凱氏定氮法[13]。

1.3.1.2 游離氨基氮含量的測(cè)定

甲醛電位滴定法[14]。

1.3.1.3 水解度(hydrolysis degree，DH)的測(cè)定[15]

DH/%=(AN-AN0)/N×100

(1)

式中：AN，貝肉酶解液中游離氨基氮的含量(g/100g)；AN0，貝肉糜溶液酶解前氨基氮的含量(g/100g)；N，貝肉糜中總蛋白氮的含量(g/100g)。

1.3.2 不同蛋白酶對(duì)合浦珠母貝肉水解度的影響

將風(fēng)味蛋白酶、復(fù)合蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶按0.6%的比例分別添加到貝肉與緩沖液組成的勻漿中，在酶較適pH及溫度范圍內(nèi)，液料比(mL∶g)3∶1，在水浴鍋中水解8 h后測(cè)定不同貝肉酶解液的水解度及風(fēng)味。最終選取復(fù)合蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶作為混合酶進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化。

1.3.3 單因素試驗(yàn)

選取質(zhì)量比1∶1的復(fù)合蛋白酶及風(fēng)味蛋白酶混合后作為混合酶，考察混合酶在不同的酶解時(shí)間、溫度、料液比和加酶量下對(duì)合浦珠母貝肉酶解效果的影響。

1.3.3.1 酶添加量對(duì)酶解效果的影響

混合酶的加酶量分別為3 840、4 300、4 760、5 220、5 680 U/g，每個(gè)水平試驗(yàn)點(diǎn)重復(fù)3次，固定水解時(shí)間8 h，溫度45 ℃，液料比(mL∶g)3∶1，pH 6.5，按1.3.1項(xiàng)進(jìn)行操作，比較酶添加量對(duì)水解效果的影響。

1.3.3.2 液料比對(duì)酶解效果的影響

液料比分別為1∶1、2∶1、3∶1 、4∶1、5∶1，每個(gè)水平試驗(yàn)點(diǎn)重復(fù)3次，固定水解時(shí)間8 h，水解溫度45 ℃， pH 6.5，選取上述最佳加酶量，按1.3.1項(xiàng)進(jìn)行操作，比較不同液料比對(duì)水解效果的影響。

1.3.3.3 酶解時(shí)間對(duì)酶解效果的影響

水解時(shí)間分別為4、5、6、7、8 h，每個(gè)水平試驗(yàn)點(diǎn)重復(fù)3次，水解溫度45 ℃， pH 6.5，其他選取上述最佳加酶量和料液比，按1.3.1項(xiàng)進(jìn)行操作，比較不同酶解時(shí)間比對(duì)水解效果的影響。

1.3.3.4 酶解溫度對(duì)酶解效果的影響

水解溫度分別為40、45、50、55、60 ℃，每個(gè)水平試驗(yàn)點(diǎn)重復(fù)3次，固定pH 6.5，其他選取上述最佳試驗(yàn)條件，按1.3.1項(xiàng)進(jìn)行操作，比較不同酶解溫度對(duì)水解效果的影響。

1.3.4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以單因素試驗(yàn)為前提，以水解度值為響應(yīng)值，考察加酶量(A)、料液比(B)、酶解時(shí)間(C)、酶解溫度(D)4個(gè)變量因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響。再根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，結(jié)合Box-Behnken分析組合進(jìn)行4因素3水平的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，最后采用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)組合試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。響應(yīng)面因素及水平見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面分析因素水平表

1.3.4 游離氨基酸含量的測(cè)定[16]

分別吸取酶解前后的溶液各2 mL，然后再分別加入2 mL的磺基水楊酸，稀釋后用日立835-50型高速氨基酸分析儀測(cè)定。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)

采用SPSS19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，在檢驗(yàn)水平為0.05的條件下進(jìn)行顯著性差異分析，且所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，各組計(jì)算數(shù)據(jù)均以(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)的形式記錄。

2 結(jié)果與分析

2.1不同蛋白酶對(duì)合浦珠母貝肉水解度的影響

表2 不同蛋白酶對(duì)合浦珠母貝肉水解度的影響

注：同列標(biāo)有不同小寫字母表示同一指標(biāo)下不同蛋白酶的貝肉水解度有顯著性差異(plt;0.05)，標(biāo)有相同字母表示同一指標(biāo)下不同蛋白酶的貝肉水解度間無(wú)顯著性差異(pgt;0.05)。

由表2可知，不同蛋白酶對(duì)貝肉的水解有著顯著的差異性(plt;0.05)，根據(jù)水解度大小可知水解效果依次為枯草桿菌中性蛋白酶gt;復(fù)合蛋白酶gt;中性蛋白酶gt;胰蛋白酶gt;風(fēng)味蛋白酶gt;木瓜蛋白酶?？莶輻U菌蛋白酶的酶解效果最好，水解度可達(dá)到(27.11±1.02)%，復(fù)合蛋白酶次之，水解度達(dá)到(25.79±1.15)%。但除經(jīng)風(fēng)味蛋白酶、木瓜蛋白酶和復(fù)合蛋白酶酶解的水解液具有較愉快的風(fēng)味外，其余3種酶的水解液都具有不良的腥臭味。復(fù)合蛋白酶具有內(nèi)切和外切蛋白酶的特性，不同酶的酶切位點(diǎn)的專一性和酶自身的特異性會(huì)導(dǎo)致水解位點(diǎn)的不一致，最終導(dǎo)致水解度值的不同。武瓊等[17]研究發(fā)現(xiàn)復(fù)合酶的酶解效果要優(yōu)于單酶，且綜合考慮水解度大小及水解液風(fēng)味兩方面的影響，可選取風(fēng)味蛋白酶及復(fù)合蛋白酶作為混合水解酶。

2.2單因素試驗(yàn)

2.2.1 酶添加量對(duì)水解效果的影響

由圖1可知，合浦珠母貝肉的水解度隨加酶量的增加呈現(xiàn)先快速上升但達(dá)到5 220 U/g后增幅逐漸平穩(wěn)的趨勢(shì)。在加酶量為5 220 U/g時(shí)水解度值達(dá)到37.78%且與加酶量為5 680 U/g時(shí)的水解度值之間差異性不顯著(pgt;0.05)。加酶量少時(shí)，底物與蛋白酶結(jié)合較少，反應(yīng)速度較慢；加酶量增多時(shí)，底物與酶的接觸率增加，反應(yīng)速度隨之加快；但當(dāng)酶與底物接觸點(diǎn)結(jié)合基本飽和后，過(guò)多的酶反而會(huì)影響體系反應(yīng)速度[18]。因此由圖1可知選取最適加酶量為5 220 U/g。

圖1 酶添加量對(duì)水解度值的影響Fig.1 Effect of enzyme amount onhydrolysis degree注：不同字母代表數(shù)據(jù)間有顯著性差異(plt;0.05)。

2.2.2 液料比對(duì)水解效果的影響

由圖2可知，隨著液料比的增加貝肉酶解液的水解度也逐漸增大，但在達(dá)到3∶1后，酶解液的水解度卻隨著液料比的增加而逐漸降低，且液料比對(duì)水解效果的整體影響較為顯著(plt;0.05)。這是因?yàn)樵谝毫媳容^低時(shí)，溶液濃度較高，流動(dòng)性受阻，導(dǎo)致酶不易擴(kuò)散與底物結(jié)合，因此反應(yīng)速度變慢最終導(dǎo)致水解度值降低[19]；但液料比太大時(shí)，酶濃度被稀釋，單位體積內(nèi)的酶含量降低，底物與酶的結(jié)合位點(diǎn)變少，且酶解效果受抑制[20]。因此選取液料比為3∶1，此時(shí)貝肉水解度值最高。

圖2 不同液料比對(duì)水解效果的影響Fig.2 Effect of liquid-material ratio on hydrolysis degree注：不同字母代表各組數(shù)據(jù)間有顯著性差異(plt;0.05)。

2.2.3 酶解時(shí)間對(duì)水解效果的影響

由圖3可知，隨著酶解時(shí)間的增加酶解液的水解度值呈現(xiàn)出先快速增加后逐漸平緩的趨勢(shì)，在酶解時(shí)間達(dá)到6 h后，酶解液的水解度的增幅不再隨著時(shí)間的增加而大幅增長(zhǎng)，且在酶解時(shí)間未達(dá)到6 h前時(shí)間的變化對(duì)水解效果的影響較為顯著(plt;0.05)。這是因?yàn)榍捌陔S著時(shí)間的增加，酶與底物接觸的機(jī)會(huì)增大，所以水解度值會(huì)先快速增長(zhǎng)，一定時(shí)間后，隨著底物的減少，可水解的特定部位也隨之減少，因此水解度的漲幅也逐漸降低。因此選取酶解時(shí)間為6 h，此時(shí)水解度值為33.67%。

圖3 不同酶解時(shí)間對(duì)水解效果的影響Fig.3 Effect ofenzymolysis time on hydrolysis degree注：不同字母代表數(shù)據(jù)間有顯著性差異(plt;0.05)。

2.2.4 酶解溫度對(duì)水解效果的影響

由圖4可知，隨著酶解溫度的增加水解度呈現(xiàn)先快速增加后逐漸下降的趨勢(shì)，在酶解溫度達(dá)到50 ℃后，酶解液的水解度的增幅不再隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而增大，而是呈逐漸降低的趨勢(shì)。這可能因?yàn)闇囟扔绊懥嗣傅姆€(wěn)定性，從而影響了酶活力值[21]。在低于酶最適溫度時(shí)，酶未達(dá)到最佳的催化狀態(tài)，因此升高溫度可以提高水解度值；但溫度高于最適溫度時(shí)酶結(jié)構(gòu)受溫度影響，酶活力減小，酶解效果受影響，因此水解度會(huì)隨之下降。且在45、50和55 ℃三個(gè)溫度點(diǎn)時(shí)水解度值差異不顯著(pgt;0.05)，而在50 ℃時(shí)水解度值達(dá)到最大為36.01%。因此選取水解溫度為50 ℃。

圖4 不同酶解溫度對(duì)水解效果的影響Fig.4 Effect ofenzymolysis temperature on hydrolysis degree注：不同字母代表數(shù)據(jù)間有顯著性差異(plt;0.05)。

2.3響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.3.1 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

在單因素試驗(yàn)的結(jié)果前提上(表2)，以水解度為響應(yīng)值，結(jié)合Design Expert 8.0.6軟件對(duì)水解試驗(yàn)進(jìn)行了4因素3水平的響應(yīng)設(shè)計(jì)，試驗(yàn)共有29組，里面含有24個(gè)析因點(diǎn)和5個(gè)零點(diǎn)，其中零點(diǎn)試驗(yàn)作為誤差估計(jì)。每個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)重復(fù)3次，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果優(yōu)化酶解工藝。

2.3.2 回歸方程的建立與方差分析

根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果以水解度值為響應(yīng)指標(biāo)利用軟件對(duì)表3進(jìn)行分析，得到的二次多元回歸擬合方程如下：

響應(yīng)值=40.55+3.10A+1.06B+2.73C+1.77D+0.045AB-2.36BD+0.12A2-2.31B2-1.45C2-1.01D2

(2)

式中：A、B、C、D分別代表加酶量、液料比、酶解時(shí)間、酶解溫度。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表4 回歸模型的方差分析

2.3.3 響應(yīng)面交互作用分析

由回歸分析結(jié)果可知，液料比和酶解溫度、加酶量和酶解時(shí)間的交互作用顯著影響了合浦珠母貝肉水解度值的變化。

2.3.3.1 加酶量和酶解時(shí)間對(duì)水解度值的影響

由圖5-a可以看出，當(dāng)液料比和酶解溫度固定不變時(shí)，隨著加酶量和酶解時(shí)間的增加，水解度的增長(zhǎng)趨勢(shì)為先大幅增加，達(dá)到一定程度后增長(zhǎng)速度減慢；由圖5-b可知等高線呈密集的橢圓形，說(shuō)明加酶量和酶解時(shí)間的交互作用對(duì)水解度的影響顯著。在加酶量5 220 U/g，酶解時(shí)間6 h前，水解度值增加較快，隨之增幅不再大幅變化趨于平穩(wěn)。這是因?yàn)榇藭r(shí)底物的酶解程度以接近最大限度，再增加加酶量或酶解時(shí)間水解度的增幅都不會(huì)有明顯增大。

圖5 加酶量、酶解時(shí)間的交互作用對(duì)水解度的影響的響應(yīng)面和等高線Fig.5 Response surface diagram and contour plot of enzyme amount andenzymolysis time on hydrolysis degree

2.3.3.2 液料比和酶解溫度對(duì)水解度值的影響

由圖6-a可以看出，當(dāng)加酶量和酶解時(shí)間固定不變時(shí)，隨著液料比和酶解溫度的增加，水解度先是逐漸增大后又緩慢減??；圖6-b可知等高線呈線性密集且為橢圓形，說(shuō)明液料比和酶解溫度對(duì)水解度值的變化極顯著。但后期隨著料液比和酶解溫度的增加，水解度降低，這是因?yàn)橐毫媳鹊脑黾酉♂屃嗣傅臐舛?，且溫度過(guò)高也會(huì)降低酶的活性。因此水解度并不隨液料比和酶解溫度的一味增加而增大。

圖6 液料比、酶解溫度以及其交互作用對(duì)水解度的影響的響應(yīng)面和等高線Fig.6 Response surface diagram and contour plot of enzyme amount andenzymolysis time on degree hydrolysis

2.3.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

運(yùn)用Design Expert 8.0.6數(shù)據(jù)分析軟件，結(jié)合模型顯示得出最佳酶解工藝條件組合為加酶量5 680 U/g、液料比2.76∶1、酶解時(shí)間6.47 h、酶解溫度55 ℃，在該酶解工藝下，預(yù)測(cè)水解度可達(dá)到45.00%?？紤]到實(shí)際操作，可將條件修改為：加酶量5 680 U/g、液料比2.8∶1、酶解時(shí)間6.5 h、酶解溫度55 ℃。采用上述優(yōu)化條件進(jìn)行3 次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，合浦珠母貝肉水解度值為(44.27±1.23)%，與理論值相對(duì)誤差僅1.65%。表明水解度值與預(yù)測(cè)值基本吻合，該模型能較好的預(yù)測(cè)合浦珠母貝肉的水解度值，因此試驗(yàn)條件可用于指導(dǎo)生產(chǎn)實(shí)踐。

2.4酶解對(duì)游離氨基酸含量的影響

經(jīng)酶解后貝肉水解液里游離氨基酸含量也由1.50 g/L增加到17.67 g/L。其中賴氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、蛋氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸和組氨酸這8種必需氨基酸含量分別增加了122.0、50.5、6.0、43.0、34.0、22.0、17.1和34.0倍。呈鮮味的谷氨酸和天冬氨酸的含量也各增加了8.2、13.4倍。因此經(jīng)酶解后游離氨基酸含量明顯增多，鮮味增強(qiáng)。

3 結(jié)論

本文以響應(yīng)曲面法優(yōu)化合浦珠母貝肉的水解工藝條件，以水解度為響應(yīng)值，考察了加酶量、料液比、酶解時(shí)間和酶解溫度對(duì)水解效果的影響。結(jié)合單因素的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)模型對(duì)貝肉水解進(jìn)行4因素3水平設(shè)計(jì)，并用Design Expert 8.0.6對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析處理。結(jié)果表明，加酶量、液料比、酶解溫度和酶解時(shí)間對(duì)貝肉水解度均有顯著影響；加酶量和酶解時(shí)間、液料比和酶解溫度的交互作用對(duì)水解度的影響顯著；最佳優(yōu)化水解工藝條件：加酶量5 680 U/g、液料比2.8∶1、酶解時(shí)間6.5 h、酶解溫度55 ℃。3次平行實(shí)驗(yàn)證結(jié)果為水解度值(44.27±1.23)%，水解度與預(yù)測(cè)值大體吻合，因此該模型能較好的預(yù)測(cè)貝肉的水解度。與現(xiàn)有貝肉酶解方式相比較[22-25]，此方法所選酶的價(jià)格較低，酶解過(guò)程不用分段或需超聲波輔助等，因此生產(chǎn)成本較低， 操作簡(jiǎn)單，實(shí)用應(yīng)用價(jià)值高。且條件下貝肉酶解液氨基酸總量可高達(dá)17.67 g/L，可作為基料進(jìn)一步生產(chǎn)高檔的海鮮調(diào)味料。

表4 合浦珠母貝肉酶解前后游離氨基酸含量的變化

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Optimizationofhydrolysisprocessofpinctadafucatabyresponsesurfacemethod

WANG An-feng1,2,ZHAO Yong-qiang1,CHEN Sheng-jun1*,LI Lai-hao1, YANG Xian-qing1,WU Yan-yan1,YANG Shao-ling1,LI Chun-sheng1

1(Key Laboratory of Aquatic Product Processing, Ministry of Agriculture; National Ramp;D Center for Aquatic Product Processing; South China Sea Fisheries Research Institute, CAFS, Guangzhou 510300, China) 2(College of Food Science and Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China)

Response surface method was used to optimize the hydroiysis conditions ofPinctadafucata. The effects of the dose of protease, liquid-material ratio, enzymolysis time and enzymolysis temperature were investigated by hydrolysis degree. The results showed that the optimized conditions were as follows: 5 680 U/g of the amount of enzyme, liquid-material ratio 2.8∶1(mL∶g), enzymolysis for 6.5 h at 55 ℃. Under the above optimized conditions, the degree of hydrolysis was (44.27±1.23)%, which was almost the same with the theoretical value. The hydrolysis process was simple, reliable, with high hydrolysis rate. It can guide industrial production.

Pinctadafucata；enzymatic hydrolysis；response surface method； hydrolysis degree

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.014525

碩士研究生(陳勝軍博士為通訊作者,E-mail：Chensjun@hotmail.com)。

廣東省海洋漁業(yè)科技與產(chǎn)業(yè)發(fā)展專項(xiàng)(Z2014001，Z2015007，Z2015008，A201501C08)；廣東省公益研究與能力建設(shè)專項(xiàng)(2014A020217009)；廣東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2016A030313144)；中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金項(xiàng)目(2014TS25)

2017-04-14，改回日期：2017-05-08