陳慶榮 林長順

（寧德市蕉城區(qū)水產(chǎn)技術推廣站，福建寧德 352100）

氮、磷對青島大扁藻生長的影響初探

陳慶榮 林長順

（寧德市蕉城區(qū)水產(chǎn)技術推廣站，福建寧德 352100）

本實驗以按綠藻培養(yǎng)液配方出的基礎培養(yǎng)液，設置2組N、P比例，通過室內(nèi)光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)青島大扁藻，探討氮、磷對青島大扁藻生長的影響。結(jié)果顯示：在25℃、5000lx的條件下，當?shù)自闯渥愕那闆r下，青島大扁藻生長的最佳氮磷比例為7．17：1；在氮磷營養(yǎng)鹽條件受到限制的情況下，13．75∶1是青島大扁藻生長較為理想的氮磷比。

青島大扁藻 氮磷比 相對增長率 生物量

引言

海洋微藻具有生化合成高不飽和脂肪酸（PUFAs）的能力，因此備受到重視。微藻可作為浮游動物（輪蟲，枝角類等）、甲殼類、雙殼類和幼齡魚類的餌料而在海水養(yǎng)殖業(yè)中占有重要地位。對許多水產(chǎn)動物來說，餌料中含有豐富的不飽和脂肪酸，尤其是魚蝦類生長所必需的脂肪酸（EFA），能夠提高其生長率和幼體的存活率，對人類心血管系統(tǒng)疾病也有防治的效果，以及在養(yǎng)殖業(yè)中作為一些浮游動物（輪蟲等）的單細胞餌料[1]。

扁藻是一種海生團藻類，能游動的單細胞綠藻。生長在沿海石沼及靜水港灣海水里，但適應范圍很廣，在鹽度8-80的水中均能生長繁殖，最適鹽度范圍為30-40之間。扁藻具有廣溫性，在7-30℃范圍內(nèi)均能生長繁殖，最適溫度范圍大約在20-28℃。

青島大扁藻屬綠藻門，綠藻綱，團藻目，衣藻科，扁藻屬。青島大扁藻的典型形狀為長圓形，扁平而又腹背之分，體長在16-30μm，一般是20-24μm，寬12-15μm，厚7-10μm，體形左右對稱，前端較寬闊，頂端全部凹陷，尾部略窄或略尖，藻體上有一背腹溝，從溝中長出四根鞭毛，每兩根一組頂分生左右。其淀粉核有極性，極向?qū)χ廾?，眼點2-3個，少數(shù)有4個。眼點位于淀粉核鄰近，細胞長15-17μm，故在一般低倍鏡下就能看得很清楚。

大扁藻可作為海產(chǎn)品幼體前期的優(yōu)質(zhì)植物性餌料，對海產(chǎn)品幼體的生長發(fā)育有著極其重要的作用。氮、磷是影響和限制藻類生長的主要限制性營養(yǎng)鹽因子，也是水體富營養(yǎng)化的重要來源。通常認為浮游植物正常生長時所需要C：N：P的原子比率為106：16：1。但由于藻類生態(tài)習性不盡相同，導致對營養(yǎng)物質(zhì)的需求也不相同，并且受所處環(huán)境條件的影響。就氮、磷濃度對大扁藻生長的影響進行研究，以期為大批量生產(chǎn)大扁藻提供參考。

1 材料和方法

1.1 主要儀器

V-1100型可見光分光光度計；恒溫光照培養(yǎng)箱、電熱恒溫鼓風干燥箱；立式壓力蒸汽滅菌器。

1.2 藻種的提純與培養(yǎng)

試驗用的青島大扁藻購于連江縣良種繁育中心。

首先需要對大扁藻進行提純，瓊脂平板法對分離能夠運動的鞭毛型綠藻類最為適宜，瓊脂平板法又分為劃線接種法、噴霧接種法和小水滴擴散法。該實驗采用平板劃線法，在無菌操作臺上操作。選用配方配制培養(yǎng)基，加入1.8%的瓊脂，加熱培養(yǎng)液，不斷攪拌，使瓊脂全部熔化，加蓋，與空培養(yǎng)皿一起至于立式壓力蒸汽滅菌器中滅菌。滅菌完全后，在無菌臺上將培養(yǎng)液分裝于培養(yǎng)皿中，厚1.5cm左右，加入少量無菌蒸餾水，冷卻備用。將接種環(huán)在酒精燈上消毒徹底，待冷卻后，在高濃度的藻液里勾取少量藻液，在提前制備好的瓊脂板上劃線，加蓋，置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待藻落形成，在無菌操作臺上接種到提前配好的小量營養(yǎng)液中，反復多次就能得到“單種”微藻——青島大扁藻。

試驗時取用對數(shù)生長期的藻液。培養(yǎng)所需海水取自三都澳海區(qū)自然海水，經(jīng)煮沸24分鐘，靜置1天后配成海水營養(yǎng)鹽?；A培養(yǎng)液， 其主要成分是NaNO310mg/L，KH2PO41mg/L，Na2SiO31mg/L，F(xiàn)eC6H5O7·5H2O 0.1mg/L，維生素B1200ug，維生素B12200ng。

取藻液若干加入到高溫滅菌的錐形瓶，然后加入大成培養(yǎng)液100mL。藻液與培養(yǎng)液的體積比為1∶5，放進光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)9d，光照周期設為12L：12D，溫度設置為25℃，光照設置為5000Lx，每天搖瓶數(shù)次。并將各三角瓶隨機放置，以期減少光強對藻類生長的影響。所用的實驗器皿均先經(jīng)過121℃ 、50 min高壓滅菌，冷卻后使用。

1.3 指標測定及方法

1.3.1 藻類細胞生物量測定 本次藻細胞生物量測定采用光密度法，光密度法是利用微藻在某一波長下的光吸收值來測定細胞密度的方法，即根據(jù)藻液吸光度與細胞數(shù)的相關關系，求出它們的回歸方程。然后根據(jù)測得的藻液的吸光度，用回歸方程計算細胞數(shù)，具有操作方便的優(yōu)點。首先用細胞計數(shù)法獲得藻液的初始密度。即取一定量濃度的試驗藻種進行血球計數(shù)板計數(shù)，計數(shù)時，取一定體積的藻液，用碘液將藻細胞殺死，搖勻后，用毛細吸管吸取樣品，從蓋玻片的一側(cè)慢慢吹入計數(shù)池內(nèi)，不使有氣泡產(chǎn)生，靜置1-2分鐘，在顯微鏡下計數(shù)得到初始濃度的藻類細胞的數(shù)量級。

1.3.2 相對生長率測定 設置若干氮、磷比例，每一比例下設置2個重復，培養(yǎng)溫度為25℃、光照周期為12L： 12D的白光下進行培養(yǎng)，每天早晚各搖瓶1次，4d后取出，分別測定其相對增長率。大扁藻相對增長率按公式方法計算， 公式為：K=Lg（Nt/N0）/T式中， N0為起始細胞密度，Nt為t時刻細胞密度，T為培養(yǎng)時間。

1.3.3 試驗設計與方法 取用對數(shù)期的藻液，接種時藻種的初始密度為3.66×104cell/ml。

整個試驗以培養(yǎng)液原液為基礎，氮鹽和磷鹽濃度則根據(jù)試驗要求設計的條件下改變N 和P濃度設立不同營養(yǎng)處理組。實驗分為2組（A組和B組），A組保持磷質(zhì)量濃度不變，逐漸增加氮濃度，共設置5個不同濃度；B組保持氮質(zhì)量濃度不變， 逐漸增加磷濃度，也設置5個不同濃度。實驗溫度25℃，光暗比為12 h ∶12 h ，光照強度為5000lx。每組2個平行。培養(yǎng)液中除硝酸鹽和磷酸鹽濃度自行設置外，其它組分同培養(yǎng)液原液的濃度。本實驗設定的氮、磷濃度均在假設培養(yǎng)液中的氮、磷濃度為零的前提下。

表1 實驗組A氮磷濃度的設置

表2 實驗組B氮磷濃度的設置

2 結(jié)果與分析

2.1 藻細胞生物量對應吸光度線性關系的構(gòu)建

表3 藻細胞生物量對應吸光值的測定

表4 模型匯總和參數(shù)估計值

將表3的數(shù)據(jù)用進行曲線擬合，可得藻細胞生物量與吸光度的線性相關系數(shù)最高，R2為0.998，回歸系數(shù)的方差值F=2005.506，sig.=0.000<0.01，綜合線性影響差異極顯著，表明系數(shù)的誤差檢驗具有統(tǒng)計學意義。藻細胞生物量對應吸光度線性擬合方程Y = b1*X+ b0為描述藻細胞生物量與吸光度關系的最優(yōu)方程，代入待定系數(shù)所求得曲線方程可得藻細胞生物量對應吸光度線性擬合工作曲線：C（cell/ml） =36.695×A680nm-0.267，自變量即吸光度A680mm的區(qū)間在（0.034，0.200）之間，C為藻細胞濃度，單位×104cell/ml。由此得到一條標準曲線，用以快速測得青島大扁藻的生物量，如圖1。

圖1 藻細胞生物量對應吸光度線性擬合圖

2.2 氮、磷濃度對藻細胞生物量的影響

圖2 不同氮濃度對青島大扁藻生長的影響

圖3 不同磷對濃度青島大扁藻生長的影響

由圖2可以看到，在磷源充足的情況下，不額外添加氮源的情況下，大扁藻依靠海水中原有氮源不斷生長，但長速相對緩慢；額外添加氮源濃度為0.41mg/L的情況下，大扁藻在接種后的前3天長速最快，之后細胞部分死亡，再緩慢增長；額外添加氮源濃度為0.82mg/L的情況下，大扁藻的生長呈階梯式增長，在接種后第8天，由于氮源的限制，部分細胞開始死亡；額外添加氮源濃度為1.65mg/L的情況下，大扁藻的生長呈現(xiàn)更大幅度的階梯式增長，且長勢良好；額外添加氮源濃度為3.29mg/L的情況下，大扁藻在接種后前4天內(nèi)生長緩慢，之后快速增長。

由此可見，接種后6天內(nèi)給予大扁藻0.41mg/L的氮源（氮磷比值為1.78）可保持其較快的生長速度，之后再補充氮源，可使其保持較長時間的快速增長。

由圖3可以看到，在氮源充足的情況下，前3天不同磷濃度下的生長曲線比較接近，差異較小。

由此，可以判斷，在大扁藻生長的前期對磷源的要求比較高，但過高的磷濃度不能使其以較快的速度增長，后期需求較小。即前期（1-6天）施加0.12mg/L磷源（氮磷比值為13.75），后期少量增加可使大扁藻保持較長時間的快速增長。

圖4 相同氮磷比（7．17：1）對青島大扁藻生長的影響

圖5 相同氮磷比（3．57：1）對青島大扁藻生長的影響

圖5 為相同配方比例的兩條曲線，即氮磷濃度均與大成培養(yǎng)基一致，氮磷比值為7.17?？赡苡捎谌菬侩S機放置受光照影響的關系，表現(xiàn)出一定的差異，但都呈現(xiàn)同樣向上的增長趨勢。

圖5為相同氮磷比下，A組氮源不足，磷濃度與大成培養(yǎng)基一致，B組磷過量，氮濃度與原基液一致，氮磷比值為3.57。該條件下，兩者前期的波動比較一致，后期B組呈現(xiàn)出持續(xù)的增長。由圖3我們知道，磷濃度在0.12mg/L的情況下，即可滿足大扁藻的生長，由此可以判斷，出現(xiàn)這樣的情況是受氮濃度的影響，即在磷源充足的情況下，大扁藻的生長受氮濃度的限制，在前期，生物量較小，需求相對較小，差別不大，到后期，生物量達到一定程度，氮濃度成為生長的限制因素。

表5 第四天不同氮濃度下的相對增長率

表6 第四天不同磷濃度下的相對增長率

表5、表6為第四天，不同氮磷濃度下大扁藻的相對增長率。由表可知，在磷源充足的情況下，當?shù)獫舛葹?.041mg/L，大扁藻第四天的相對增長率最大；在氮源充足的情況下，當磷濃度為0.12mg/L，大扁藻第四天的相對增長率最大，與上述結(jié)果一致。

本實驗數(shù)據(jù)表明當磷源受到限制的情況下大扁藻最佳氮磷比例為1.78：1，而當磷源充足的情況下，大扁藻生長的最佳比例為13.75：1。

3 討論

3.1 氮、磷營養(yǎng)鹽濃度對青島大扁藻生長的影響

氮是構(gòu)成蛋白質(zhì)的主要元素，而蛋白質(zhì)是一切生物的物質(zhì)基礎，所以氮對大扁藻具有特別重要的意義。磷主要存在于微藻細胞的原生質(zhì)和細胞和中，也是構(gòu)成蛋白質(zhì)不可缺少的元素之一。

由以上實驗結(jié)果可知，當添加的氮濃度在較低水平時，即TN<1.65mg/L時，大扁藻生長前期，生物量小，對氮的需求不高，此情況下，氮濃度的增加對其生長的影響不大，后期大扁藻生物量達到一定程度，對氮的需求較大，此時，其生物量隨著氮濃度增加而增加。

當添加的磷濃度較低時，即TP<0.23mg/L時，由于自然海水中存在一定濃度的磷源，且扁藻剛開始生物量小，對磷的需求同樣不高，此情況下，磷濃度的增加對其生長的影響不大，后期大扁藻生物量達到一定程度，對磷的需求相對有所增加，此時，總的趨勢是大扁藻的生物量隨著磷濃度的增加而增加。實驗指出，在不同磷質(zhì)量濃度條件下，藻類生長的最佳條件是磷濃度等于0.07 mg/L，且在磷濃度大于0.07 mg/L時，藻類生長狀況要優(yōu)于磷濃度小于0.07 mg/L時。本實驗最適合青島大扁藻生長的磷濃度為0.12mg/L，且在濃度大于0.12mg/L時，大扁藻的生長狀況要優(yōu)于磷濃度小于0.12mg/L時，與上述研究相似。

4 結(jié)論

實驗表明當?shù)自闯渥愕那闆r下，青島大扁藻生長的最佳比例為7.17：1；在氮磷營養(yǎng)鹽條件受到限制的情況下，13.75是大扁藻生長較為理想的氮磷比值。

這表明大扁藻的生長狀況，不僅決定于氮、磷等營養(yǎng)鹽初始濃度，而且也與氮磷營養(yǎng)鹽之間的比例關系密切相關。

[1]曹春暉，孫世春，麥康森等．氮濃度對四株海洋綠藻總脂含量和脂肪酸組成的影響[J]．海洋湖沼通報，2006（3）：79-84．

[2]廣西壯族自治區(qū)東興各族自治縣珍珠場試驗組．扁藻培養(yǎng)的一些問題及其處理[J]．水產(chǎn)科技情報，1977（5）：42-43．

[3]單細胞藻類之--扁藻[EB/OL]．2007-6-2/2012-4-25．http：//baike．baidu．com/view/776011．htm．

[4]張學超，楊立平，劉纘延等．對蝦育苗中常用海洋微藻抑菌作用的研究[J]．水產(chǎn)科學，2010，29（2） ：112-114．

S917

A

1003-1650(2017)04-0063-02

陳慶榮（1969-），男，工程師，從事水產(chǎn)養(yǎng)殖研究，E-mail：973785055@qq．com