韓坤煌 周鵬 鄒志華 張子平 王藝磊

（1. 集美大學水產學院 農業(yè)部東海海水健康養(yǎng)殖重點實驗室，廈門 361021；2. 寧德市富發(fā)水產有限公司 大黃魚育種國家重點實驗室，寧德 352103）

大黃魚Lc-UBE2D4基因的克隆及其表達分析

韓坤煌1，2周鵬1鄒志華1張子平1王藝磊1

（1. 集美大學水產學院 農業(yè)部東海海水健康養(yǎng)殖重點實驗室，廈門 361021；2. 寧德市富發(fā)水產有限公司 大黃魚育種國家重點實驗室，寧德 352103）

泛素綴合酶E2是蛋白質泛素化系統(tǒng)中的關鍵酶，對降解的靶蛋白的特異性選擇起決定性作用，參與了細胞內80%以上的蛋白降解，對于細胞周期調控、細胞凋亡、基因轉錄及表達等生理活動具有重要的調控作用。本研究從已構建的大黃魚（Larimichthys crocea）性腺線性化cDNA文庫中篩選出泛素綴合酶（Ubiquitin-conjugating enzymes E2 D4，Lc-UBE2D4）同源基因片段，利用SMART-RACE方法克隆出其全長cDNA序列，并利用熒光定量PCR技術檢測其在大黃魚不同組織和性腺不同發(fā)育階段的差異表達情況。結果顯示，Lc-UBE2D4基因全長798 bp，其中ORF為441 bp，可編碼147個氨基酸，含有一段典型的泛素綴合酶UBC結構域及其半胱氨酸激活位點。定量PCR結果分析發(fā)現，Lc-UBE2D4在脾臟和性腺中表達量較高，在脾臟和精巢的表達水平極顯著高于其他各組織（P＜0.01），同時在卵巢中的表達亦顯著高于除脾臟和精巢外的其他各組織（P＜0.05）；通過對Lc-UBE2D4基因在性腺不同發(fā)育階段表達模式的研究發(fā)現，該基因在精巢3個時期中的表達水平顯著高于各發(fā)育階段的卵巢（P＜0.05），推測Lc-UBE2D4基因在大黃魚性腺發(fā)育過程中起著重要的調節(jié)作用，脾臟中的高表達也暗示其可能參與免疫機能。

泛素化；Lc-UBE2D4；大黃魚；組織表達；性腺發(fā)育

泛素-蛋白酶體途徑（Ubiquitin-proteasome pathway，UPP）是真核細胞內一種重要的蛋白降解途徑，細胞內80%以上的蛋白質依賴于此途徑進行降解，對于細胞內DNA修復、細胞周期調控、細胞凋亡、抗原提呈、基因轉錄調控等多種代謝活動具有重要的作用［1-2］。UPP的多種組成因子對于性腺發(fā)育與成熟、細胞分裂過程中染色質的濃縮與結構的重塑等生殖調控過程具有重要的作用［3］。泛素綴 合 酶 E2（Ubiquitin-conjugating enzymes） 是 UPP的重要組成部分，在蛋白泛素化過程中作為介導泛素活化酶E1（Ubiquitin-activating enzyme）和泛素連接酶E3（Ubiquitin ligase enzyme）之間的關鍵性酶，對靶蛋白的特異選擇性降解起決定性作用，為細胞周期蛋白的有序降解及細胞周期轉換調控所必需［1，2，4］?，F有研究表明泛素綴合酶E2基因在釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）［5］、非洲爪蟾（Xenopus laevis）［6］、人類［7，8］等不同物種的細胞周期進程中均有重要的調控作用，對其深入研究有助于我們進一步了解其生理功能和作用機理。

魚類是人類重要的優(yōu)質蛋白源之一，其養(yǎng)殖產量首先受限于苗種繁育的數量，因而對其生殖發(fā)育調控機制的研究已成為業(yè)內一個重要的研究熱點。盡管魚類的性腺發(fā)育受到外界環(huán)境影響，但其遺傳基礎仍是以不同基因的有序表達調控為主導，因此研究不同基因對性腺發(fā)育的調控機制有助于進一步豐富魚類生殖的分子遺傳學理論［9］。大黃魚（Larimichthys crocea）是我國重要的經濟養(yǎng)殖魚類，作為傳統(tǒng)四大海洋捕撈對象之首，素有“國魚”美譽，深受廣大消費者喜愛［10］。2015年全國大黃魚育苗量和養(yǎng)殖產量分別達到27.9億尾和14.79萬t，居于全國海水養(yǎng)殖魚類之首，在全國魚類養(yǎng)殖產業(yè)中占據著重要地位［11］。在大黃魚人工養(yǎng)殖產業(yè)化過程中，其性腺發(fā)育的調控是其育苗產量的關鍵調節(jié)因素，進一步從分子水平角度研究其性腺發(fā)育的調控機制從而豐富其遺傳調控理論，為后續(xù)通過生物技術手段輔助選育新品系/種提供基礎，對于大黃魚產業(yè)轉型升級具有重要意義［10］。前人的研究表明E2基因對于生物體配子細胞的發(fā)生［12-15］、性腺發(fā)育［16］以及胚胎發(fā)育［17-18］等生殖活動具有重要調控作用，但是該家族基因在大黃魚性腺發(fā)育中的研究尚未見報道。因此，本研究從前期構建的大黃魚性腺線性化cDNA文庫［19-20］中篩選出泛素綴合酶UBE2D4基因片段（命名為Lc-UBE2D4），并首次克隆出其全長cDNA序列，通過qRT-PCR技術檢測出該基因在不同組織和性腺不同發(fā)育階段中的表達水平，為進一步研究該基因的生物學功能及其參與大黃魚性腺發(fā)育的分子調控機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

所用大黃魚實驗樣品取自寧德富發(fā)公司的養(yǎng)殖網箱，其中組織差異表達實驗魚體重為約500 g［21］，雌雄各5尾，活魚抽血后剪取其卵巢、精巢、肝臟、脾臟、腎臟、腦及肌肉等組織，并立即于液氮中凍存，后置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。另解?70日齡、635日齡和1 000日齡的大黃魚雄魚和雌魚的性腺［22］，分別為T1、T2、T3期和O1、O2和O3期，各時期均選自4尾大黃魚樣品，以作性腺不同發(fā)育階段差異表達分析。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取 利用RDP試劑及 RNA 提取方法［23］提取大黃魚各組織總 RNA。

1.2.2 目的基因的獲得及其分析 從構建的大黃魚性腺cDNA文庫中篩選獲得UBE2D4基因片段［24］，用SMART-RACE方法克隆其全長 cDNA 序列，利用VecScreen、Blast、ORF Finder等軟件對其序列進行拼接和比對，采用Bioedit、MEGA 4.0 等軟件及pI、SingalP、TMHMM等在線程序分析其主要結構域和生物信息學特點；以β-actin基因為內參基因［21］，采用 qRT-PCR 技術檢測其在不同組織和性腺不同發(fā)育階段中的差異表達，其中每個組織樣品分別3次實驗重復。

1.2.3 數據分析 根據 qRT-PCR 實驗結果，利用SPSS 15.0 軟件對其進行單因素方差分析，基因表達水平用RQ值的平均值±標準誤（±s）來表示，其中P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著。

2 結果

2.1 Lc-UBE2D4基因全長cDNA序列分析

根據UBE2D4基因片段，克隆得到其全長cDNA序列，命名為Lc-UBE2D4（Genbank登錄號：FJ800568）。如圖1所示，Lc-UBE2D4全長cDNA序列共798 bp，其中5'UTR為262 bp、3'UTR為75 bp（不含polyA部分）、開放閱讀框ORF為441 bp，可編碼147個氨基酸，預測其蛋白分子量約為16.596 kD，等電點pI為6.39。根據SingalP和TMHMM等軟件分析結果可得該基因不含信號肽和跨膜區(qū)，其糖基化位點位于N81-S83區(qū)域，并包含5個絲氨酸磷酸化位點（S11、S22、S43、S91和S105）、6個蘇氨酸磷酸化位點（T36、T70、T71、T98、T126和 T142），以及 3個酪氨酸磷酸化位點（Y45、Y60和Y134）。Blastx比對結果顯示Lc-UBE2D4蛋白結構序列與大部分物種的UBE2D4蛋白有90%以上的一致性，并含有典型的泛素綴合酶UBC結構域，屬于E2基因家族成員，內含E2基因激活位點區(qū)域（Y74-L89），其N端第85位Cys（C85）殘基是E2基因特有的保守活性位點。

圖1 Lc-UBE2D4全長cDNA及其推導的氨基酸序列

2.2 Lc-UBE2D4與其他物種的多重比較分析

利用Bioedit軟件，將大黃魚Lc-UBE2D4蛋白序列與NCBI數據庫中Blast比對搜索得來的其他物種UBE2D4同源蛋白序列進行多重比較，其結果如圖2顯示，不同物種間的泛素綴合酶UBC結構域的序列（R5-K136）十分保守，其相似性達到90%以上；同時，其激活位點區(qū)域（Y74-L89）高度保守，均含有一個半胱氨酸活性位點（C85）。

2.3 Lc-UBE2D4系統(tǒng)進化樹分析

以Mega 4.0軟件的臨位相接法將不同物種間的UBE2D4同源蛋白質氨基酸序列進行多重比對，構建Lc-UBE2D4系統(tǒng)進化樹。如圖3所示，大黃魚Lc-UBE2D4與貝氏隆頭魚（Labrus bergylta）、紅鰭東方鲀（Takifugu rubripes）形成一小簇，三者與其他魚類形成一個較大的簇，人（Homo sapiens）、猩猩（Gorilla gorilla gorilla）和非洲爪蟾（Xenopus laevis）形成另一簇。同時，其他物種的UBE2D4-like蛋白形成第三簇，而北極七鰓鰻（Lethenteron camtschaticum）的UBE2D和原雞（Gallus gallus）的UB2D3形成最外緣的一簇，表明親緣關系最遠。

2.4 Lc-UBE2D4基因在大黃魚不同組織間的差異表達

利用熒光定量qRT-PCR技術檢測Lc-UBE2D4基因在大黃魚各組織器官中的表達情況。經分析發(fā)現（圖4），Lc-UBE2D4在脾臟中的表達水平最高，在精巢中的表達水平緊隨其后，二者之間具有顯著性差異（P＜0.05），且二者均極顯著高于其他各組織（P＜0.01）；同時Lc-UBE2D4在卵巢中的表達水平也顯著高于其他各組織（P＜0.05）。

2.5 Lc-UBE2D4基因在大黃魚性腺不同發(fā)育階段的表達模式

利用熒光定量qRT-PCR技術檢測Lc-UBE2D4基因在大黃魚性腺不同發(fā)育階段的表達模式（圖5），Lc-UBE2D4基因在270日齡、635日齡和1 000日齡大黃魚的精巢均顯著高于同時期卵巢的表達水平（P＜0.05），其中T1和T2期的表達水平極顯著高于卵巢3個時期（P＜0.01），而在T3期的表達水平與卵巢的差異近于極顯著水平（P=0.012）。

圖2 Lc-UBE2D4與其他物種UBE2D4 氨基酸序列的多重比較

圖3 利用鄰位相接法構建的Lc-UBE2D4系統(tǒng)進化樹

圖4 Lc-UBE2D4基因在大黃魚不同組織中的表達情況

圖5 Lc-UBE2D4基因在大黃魚性腺不同發(fā)育階段的表達模式

3 討論

泛素綴合酶E2是泛素蛋白酶體途徑（UPP）的重要組成部分，是泛素活化酶E1和泛素連接酶E3的中間介導載體，它通過硫酯鍵作用于活化的泛素形成E2-泛素化復合體，并協助特異性泛素連接酶E3將活化的泛素轉移至底物蛋白，促使底物蛋白的泛素化降解，對于細胞周期蛋白的周期性降解以及細胞分裂周期調控具有重要的作用［25-26］。本研究首次克隆得到大黃魚泛素綴合酶E2（Lc-UBE2D4）基因全長，對其功能結構域的分析顯示Lc-UBE2D4含有多個磷酸化位點，提示該蛋白是一個功能活躍的蛋白質［4］；該蛋白含有一段較長的、高度保守的、具催化活性的UBC催化結構域［27］，其中N端第74-89位區(qū)域是其E2激活位點，內含調控其活性的Cys殘基，是E2-泛素復合體硫酯鍵形成所必需的重要區(qū)域［28-30］。經系統(tǒng)進化樹與多重比較分析結果顯示，該基因與其他物種的UBE2D高度保守，其相似性達90%以上，這可能與該基因在不同物種間的相似性功能有關，與多基因家族的存在現象較為一致［25］。

脾臟是真骨魚類唯一的淋巴結樣器官，含有許多先天免疫功能因子，具有一定免疫調節(jié)作用［31］。研究表明魚類脾臟的許多內在因子參與了免疫反應，如經鰻弧菌刺激后的鯉魚Akirin2基因在脾臟中的表達會顯著提升［32］；大黃魚受到 poly I-C［33］和溶藻弧菌［34-35］的刺激，其脾臟內Mx蛋白基因、beta2微球蛋白、胎盤特異8基因、Cyba、Rab11和IL-10等免疫功能基因均顯著上調，表明大黃魚脾臟內存在多種免疫調節(jié)因子以應對各種不同應激物的刺激。泛素綴合酶E2家族基因參與機體內一些重要的免疫調節(jié)反應已有相關研究報道，如人UBE2W基因對于TNFα誘導的核轉錄因子NF-κB的轉錄活性具有顯著抑制作用，并與NF-κB相關的炎癥反應和腫瘤形成有關［36］；酵母UBE2參與了DNA復制后的修復與蛋白質的降解［37］；松江鱸（Trachidermus fasciatus）在鰻弧菌刺激下，其UBE2D2基因在脾臟的表達迅速提升了約40倍，推測UBE2D2基因可能與松江鱸的先天免疫防御有關［38］。大黃魚作為一種常年在開放海區(qū)養(yǎng)殖的魚類，其養(yǎng)殖過程中受到不同微生物、寄生蟲等病害威脅，其機體內存在多種細胞因子參與免疫調節(jié)反應［10，33］。本研究中Lc-UBE2D4基因與松江鱸UBE2D2基因同屬于UBE2D家族，其作用機理可能接近，qRT-PCR結果中顯示Lc-UBE2D4在脾臟中的表達水平最高，推測該基因可能參與免疫機能，至于如何參與大黃魚免疫調節(jié)有待進一步驗證。

泛素綴合酶E2家族基因在生殖系統(tǒng)中具有重要的調節(jié)作用［39］。例如，果蠅泛素綴合酶UbcD1基因對細胞有絲分裂和減數分裂過程中染色體的準確定位具有重要的調節(jié)作用［40］；在甲殼動物中，泛素結合酶UBE2基因對于日本囊對蝦（Marsupenaeus japonicus）［13］、克氏原鰲蝦（Procambarus clarkia）［15］、 斑 節(jié) 對 蝦（Penaeus monodon）［16］的性腺發(fā)育、配子發(fā)生等生殖活動具有重要調節(jié)作用；在哺乳動物的配子發(fā)生過程中，泛素綴合酶E2基因亦有重要的調節(jié)作用［41］，如小鼠泛素綴合酶HR6B基因的突變可導致其雄性不育［42，43］；敲除小鼠UBE2B基因，其精母細胞和精子細胞的結構發(fā)生異常，成熟精子數量顯著減少且活力降低，其畸形率也會顯著提高，繼而引發(fā)雄性不育［44］；改變人類UBE2B的mRNA水平會導致男性不育［45］。本研究中Lc-UBE2D4基因在性腺中的表達顯著高于脾臟外的其他組織，可能是由于大黃魚性腺中細胞分裂比其他組織旺盛的多，需要更多的蛋白質進行周期性的合成與降解，因此需要更多的泛素系統(tǒng)相關因子參與細胞周期蛋白的降解以完成細胞分裂，這與已報道的大黃魚細胞周期調節(jié)因子cdc2和cyclinB1［46］以及E3底物受體LcDCAF17［47］在性腺中的表達顯著高于其他各組織的結論相一致，表明該基因與大黃魚的性腺發(fā)育密切相關。在大黃魚性腺發(fā)育過程中，其卵巢自8月齡起卵原細胞已發(fā)育至第Ⅱ卵母細胞，至2.5年齡時大部分卵母細胞仍處于該時期，卵母細胞內卵原蛋白不斷合成，細胞體積不斷增大，而精巢自8月齡起精原細胞增殖旺盛，至2年齡起精巢內即已產生大量的成熟精子［47，48］。本研究中Lc-UBE2D4在精巢3個不同發(fā)育時期中的表達水平顯著高于同期卵巢，說明該基因的表達與細胞分裂程度顯著相關，暗示Lc-UBE2D4對精巢發(fā)育的調節(jié)作用更強，對精巢發(fā)育和精子成熟具有重要的調控作用。

4 結論

本研究從大黃魚性腺cDNA文庫中篩選出Lc-UBE2D4基因片段，并首次克隆出其全長cDNA序列，該基因具有典型的UBC結構域，屬于泛素綴合酶E2家族。同時，該基因在進化過程中十分保守，可能與其不同物種間的相似功能有關。組織差異表達結果顯示，Lc-UBE2D4在脾臟的表達水平最高，而在精巢和卵巢的表達亦顯著高于除脾臟外的其他各組織器官；在性腺的不同發(fā)育階段，Lc-UBE2D4在精巢3個時期的表達均顯著高于卵巢。本研究結果顯示Lc-UBE2D4基因對大黃魚性腺發(fā)育和配子細胞的成熟具有重要的調節(jié)作用，脾臟中的高表達也暗示其可能參與免疫機能。

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Cloning and Expression Profiles of Lc-UBE2D4 Gene from Large Yellow Croaker Larimichthys crocea

HAN Kun-huang1，2ZHOU Peng1ZOU Zhi-hua1ZHANG Zi-ping1WANG Yi-lei1
（1. Key Laboratory of Healthy Mariculture for the East China Sea，Ministry of Agriculture，Fisheries College，Jimei University，Xiamen 361021；2. State Key Laboratory of Large Yellow Croaker Breeding，Ningde Fufa Fisheries Company Limited，Ningde 352103）

Protein ubiquitination is a fundamental post-translational modification event that serves as a signaling function in diverse biological processes，including cell-cycle progression，cell apoptosis，gene transcriptional regulation and expression，etc. In these processes of ubiquitin-proteasome pathway，ubiquitin-conjugating enzyme E2 is of pivotal importance that mediates more than 80 percent of protein degradation of eukaryotic cells，and it plays a key role on the specific selection of degraded of target protein. In this study，a homologous gene fragment of ubiquitin-conjugating enzymes E2 D4（Lc-UBE2D4）was screened from previous constructed normalized gonad cDNA library of large yellow croaker Larimichthys crocea was obtained，and its full length cDNA was cloned by using SMART-RACE technology，and then the differential expression profiles in different tissues and different gonadal development stages were analyzed using quantitative real time PCR（qRT-PCR）. The full length cDNA of Lc-UBE2D4 gene was of 798 bp，with 441 bp of ORF encoding a protein of 147 amino acids，and it contained the highly conserved ubiquitin-conjugating enzymes UBC domain and an active site cysteine. The qRT-PCR results revealed that the highest expression level of Lc-UBE2D4 presented in spleen and testis which were extremely higher than those in other tissues（P ＜ 0.01），and its expression level in ovary was significantly higher than other organs（excluding spleen and testis）（P ＜ 0.05）. Moreover，its expression levels in three stages of testis were higher than in the same growth stages of ovary（P ＜ 0.05）. These results suggested that Lc-UBE2D4 playedessential roles in the gonad development，especially in testis development. Meanwhile，Lc-UBE2D4 may be involved in immune function due to highest expression in spleen.

ubiquitination；Lc-UBE2D4；large yellow croaker；tissue expression；gonad development

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0451

2017-06-01

福建省自然科學基金項目（2015J06019），福建省STS項目（2016T3041），福建省海洋生物資源開發(fā)利用協同創(chuàng)新中心產學研基金（FJMBIO1502），大黃魚育種國家重點實驗室開放課題基金（LYC2016RS02），廈門南方海洋研究中心資助項目（14GZP75NF39）

韓坤煌，男，博士研究生，研究方向：水產動物增養(yǎng)殖技術、功能基因組學等；E-mail：hankunhuang@foxmail.com

王藝磊，女，教授，博導，研究方向：水產動物功能基因組學；E-mail：ylwang@jmu.edu.cn

（責任編輯 狄艷紅）