劉威+袁芳艷+周丹娜+劉澤文+楊克禮+段正贏+郭銳+蔡行+肖少波+田永祥

摘要：試驗(yàn)構(gòu)建豬肺炎支原體重組表達(dá)質(zhì)粒pET30a-LppT，通過快速定點(diǎn)突變?cè)噭┖袑ppT基因中513、945、1 860、2 547 bp處的A突變?yōu)镚，使改造后的LppT基因能在大腸桿菌系統(tǒng)中正確表達(dá)，IPTG誘導(dǎo)重組蛋白的表達(dá)并進(jìn)行了蛋白純化，純化的目的蛋白與佐劑混合、乳化制備免疫原，免疫新西蘭大白兔制備LppT蛋白多克隆抗體。SDS-PAGE 分析結(jié)果顯示，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后獲得1條特異性蛋白條帶，分子質(zhì)量約為110 ku，與預(yù)期蛋白大小一致?？扇苄苑治鼋Y(jié)果表明目的蛋白以可溶形式表達(dá)于上清中，純化的蛋白經(jīng)SDS-PAGE分離后，用制備的LppT多克隆抗體進(jìn)行Western Blot檢測(cè)，結(jié)果表明制備的LppT多克隆抗體具有較強(qiáng)的特異性。

關(guān)鍵詞：豬肺炎支原體；脂蛋白；LppT；多克隆抗體

中圖分類號(hào)： S858.28 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2017）19-0220-04

收稿日期：2016-05-27

基金項(xiàng)目：國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（編號(hào)：2016YFD0500906）；國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：31502069、31170160）；湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院青年科學(xué)基金（編號(hào)：2015NKYJJ14）；湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院競(jìng)爭(zhēng)性計(jì)劃項(xiàng)目（編號(hào)：2016jzxjh030）；湖北省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新中心資助項(xiàng)目（編號(hào)：2015-620-004-001）。

作者簡(jiǎn)介：劉 威（1985—），男，湖北武漢人，博士，助理研究員，主要從事動(dòng)物傳染病研究工作。E-mail：liuwei85@126.com。

通信作者：田永祥，研究員，主要從事家畜主要疫病生物制劑的研制及綜合防控技術(shù)研究。E-mail：tyxanbit@163.com。 豬支原體肺炎（mycoplasmal pneumonia of swine，MPS）是由豬肺炎支原體（Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp）引起的，以豬咳嗽和氣喘為主要癥狀的慢性呼吸道傳染病[1]，具有慢性、接觸性、高傳染性、高發(fā)病率和低死亡率的特征。該病廣泛分布于世界各地，國(guó)外常被稱為豬地方流行性肺炎，而在我國(guó)常被稱為豬氣喘?。ㄓ址Q喘氣病）[2]。

豬肺炎支原體感染導(dǎo)致豬的生長(zhǎng)率下降12%～16%，飼料轉(zhuǎn)化率降低13%～22%，體質(zhì)量相對(duì)減少10～25 kg，商品豬的出欄時(shí)間延遲10～30 d[3]；同時(shí)還破壞豬的支氣管和細(xì)支氣管纖毛，進(jìn)而損傷阻擋病原微生物入侵的物理屏障，破壞豬的巨噬細(xì)胞，降低機(jī)體的免疫清除能力，導(dǎo)致免疫抑制[4]。因此，在臨床上豬肺炎支原體常常與豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬Ⅱ型圓環(huán)病毒、豬流感病毒、胸膜肺炎放線桿菌、多殺性巴氏桿菌等病原混合感染，增加了當(dāng)前豬病診斷和預(yù)防控制的難度[5-6]。此外，由于豬肺炎支原體是缺少細(xì)胞壁的原核微生物，對(duì)常作用于細(xì)胞壁的抗生素（如β-內(nèi)酰胺酶類抗生素等）不敏感，豬群一旦被豬肺炎支原體感染，控制和凈化將十分困難[7]。據(jù)初步統(tǒng)計(jì)，全球每年因豬肺炎支原體感染造成的直接經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)2億美元。可以說，豬肺炎支原體已成為當(dāng)前嚴(yán)重影響?zhàn)B豬業(yè)經(jīng)濟(jì)效益的重大疫病，被喻為影響?zhàn)B豬業(yè)經(jīng)濟(jì)效益的“隱性殺手”。

在以前的研究中，筆者完成了Mhp168株以及體外傳代致弱株Mhp168-L的全基因組序列的測(cè)定[8]。通過Mhp強(qiáng)弱毒力菌株的比較基因組學(xué)分析，篩選出了330個(gè)遺傳變異位點(diǎn)，分布于123個(gè)基因中，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)當(dāng)前國(guó)際上報(bào)道的Mhp毒力基因（如：P97、P102、P146、P159、P216等）幾乎全包括在這123個(gè)基因中，其他基因多數(shù)功能未知，極可能還存在潛在的未知毒力基因[9]。其中MHP168_424編碼的氨基酸序列與M. conjunctivae的膜脂蛋白LppT相似度較高，且均含有1處典型的細(xì)菌脂蛋白信號(hào)肽區(qū)域。M. conjunctivae的LppT蛋白具有體外黏附羔羊關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞的能力，且抗LppT的抗體能有效阻斷M. conjunctivae與羔羊關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞的黏附[10]。因此，推測(cè)脂蛋白LppT很可能是豬肺炎支原體的一個(gè)毒力相關(guān)因子。為了進(jìn)一步研究脂蛋白LppT的功能，本試驗(yàn)擬獲得LppT的體外表達(dá)產(chǎn)物并制備抗LppT的多克隆抗體，為深入研究LppT的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、載體及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 MHP168菌株，由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所提供，筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存。原核表達(dá)質(zhì)粒pET-30a（+）、大腸桿菌DH5α和BL21（DE3），由湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所獸醫(yī)室保存。新西蘭大白兔，購(gòu)自湖北省疫病預(yù)防控制中心。

1.1.2 主要試劑 質(zhì)粒小量提取試劑盒購(gòu)自TIANGEN公司；瓊脂糖凝膠電泳回收試劑盒購(gòu)自O(shè)mega公司。DNA聚合酶、核酸內(nèi)切酶BamHⅠ和XhoⅠ、T4 DNA連接酶購(gòu)自TaKaRa公司。六聯(lián)組氨酸純化鎳柱、山羊抗兔IgG、HRP-DAB底物顯色試劑盒購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成 分別通過SignalP 4.1（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）和TMHMM（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）預(yù)測(cè)LppT基因的信號(hào)肽序列和跨膜區(qū)，結(jié)果顯示LppT不含有信號(hào)肽序列，但是存在1處跨膜區(qū)域，跨膜區(qū)域位于9～31位氨基酸?？缒^(qū)的存在可能導(dǎo)致蛋白的不表達(dá)和少量表達(dá)，因此在設(shè)計(jì)引物時(shí)去掉了前31個(gè)氨基酸的跨膜區(qū)域。引物根據(jù)Mhp168株LppT基因的核苷酸序列設(shè)計(jì)（基因登錄號(hào)：ADQ90626.1）：上游引物L(fēng)ppT-F：5′-TTTGGATCCATGTCCCAAGCCGAAAAAT-3′，下游引物L(fēng)ppT-R：5′-TTTCTCGAGTTATTCCATATATTC GCT-3′。在上、下游引物中分別引入BamHⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)。endprint