劉國紅,劉 波,王階平,朱育菁,車建美,陳倩倩,陳 崢

福建省農業(yè)科學院農業(yè)生物資源研究所, 福州 350003

養(yǎng)豬微生物發(fā)酵床芽胞桿菌空間分布多樣性

劉國紅,劉 波*,王階平,朱育菁,車建美,陳倩倩,陳 崢

福建省農業(yè)科學院農業(yè)生物資源研究所, 福州 350003

了解微生物發(fā)酵床大欄養(yǎng)豬墊料中的芽胞桿菌多樣性和空間分布規(guī)律,為微生物發(fā)酵床管理、芽胞桿菌新資源挖掘及菌劑開發(fā)奠定基礎。將發(fā)酵床劃分為32個方格(4行 × 8列),采用五點取樣法獲得每個方格的樣品。采用可培養(yǎng)法從32份樣品中分離芽胞桿菌菌株,利用16S rRNA基因序列初步鑒定所分離獲得的芽胞桿菌種類。利用聚集度指標和回歸分析法,分析芽胞桿菌的樣方空間分布型。通過Shannon-Wiener多樣性指數(shù)、Simpson優(yōu)勢度指數(shù)、Hill指數(shù)及豐富度指數(shù)分析,揭示微生物發(fā)酵床中芽胞桿菌的空間分布多樣性。從32份樣品中共獲得芽胞桿菌452株,16S rRNA基因鑒定結果表明它們分別隸屬于芽胞桿菌綱的2個科、8個屬、48個種。其中,種類最多的為芽胞桿菌屬(Bacillus),30種；賴氨酸芽胞桿菌屬(Lysinibacillus),6種；類芽胞桿菌屬(Paenibacillus),5種；短芽胞桿菌屬(Brevibacillus),3種；鳥氨酸芽胞桿菌屬(Ornithinibacillus)、大洋芽胞桿菌屬(Oceanibacillus)、少鹽芽胞桿菌屬(Paucisalibacillus)和纖細芽胞桿菌屬(Gracilibacillus)各1個種。芽胞桿菌種類在發(fā)酵床空間分布差異很大,根據(jù)其空間出現(xiàn)頻次,可分為廣分布種類,如地衣芽胞桿菌(Bacilluslicheniformis)；寡分布種類,如根際芽胞桿菌(B.rhizosphaerae)；少分布種類,如彎曲芽胞桿菌(B.flexus)。依據(jù)其數(shù)量,可分為高含量組優(yōu)勢種群,如地衣芽胞桿菌(B.licheniformis)；中含量組常見種群,耐鹽賴氨酸芽胞桿菌(Lysinibacillushalotolerans)；寡含量組寡見種群,如根際芽胞桿菌(B.rhizosphaerae)；低含量組偶見種群,如土地芽胞桿菌(B.humi)?？臻g分布型聚集度和回歸分析測定表明,芽胞桿菌在微生物發(fā)酵床的分布類型為聚集分布。微生物發(fā)酵床墊料中芽胞桿菌種類總含量高達4.41×108個/g,其種類含量范圍為0.01—94.1×106個/g(均值為8.96×106個/g),豐富度指數(shù)(D)、優(yōu)勢度指數(shù)(λ)、Shannon-Wiener指數(shù)(H′)和均勻度指數(shù)(J′)分別為0.4928、0.2634、1.3589和0.9803,其中香農指數(shù)最大的單個芽胞桿菌種類為地衣芽胞桿菌(B.licheniformis)。根據(jù)芽胞桿菌種類多樣性指數(shù)聚類分析,當歐式距離λ=17時,可分為高豐富度高含量和低豐富度低含量類型。微生物發(fā)酵床的芽胞桿菌種類豐富、數(shù)量高,是一個天然的菌劑“發(fā)酵罐”,有望直接作為微生物菌劑,應用于土壤改良、作物病害防控、污染治理等領域。

芽胞桿菌；微生物發(fā)酵床；16S rRNA 基因；空間分布；多樣性

生豬養(yǎng)殖過程造成嚴重的環(huán)境污染,以福建省為例,2011年生豬存欄1297.80萬頭,按每天每頭豬排放糞尿加沖洗豬欄污水約25 kg計算,全年排污量高達11842.425萬t,成為農業(yè)面源污染的主要污染源之一[1]。近年來,微生物發(fā)酵床應用于養(yǎng)豬,采用墊料(椰糠、谷殼、菌糠、鋸末等配合)鋪墊豬舍,接入微生物菌劑,豬糞尿直排其上,通過微生物原位發(fā)酵,分解豬糞、消除臭味,從而實現(xiàn)生豬養(yǎng)殖的零排放,解決養(yǎng)豬污染的問題[2- 4]。

微生物發(fā)酵床養(yǎng)豬思路最早可以追溯到中國360年前張履祥輯補《沈氏農書》記載的豬圈墊草飼養(yǎng)方法[5]?，F(xiàn)代微生物發(fā)酵床養(yǎng)殖研究最早見于日本,1970年日本建立了第一個以木屑為墊料的發(fā)酵床[6],中國香港的Tiquia等研究了發(fā)教床墊料翻堆的作用[7],德國的Kaufmann等研究了育肥豬發(fā)酵床豬糞營養(yǎng)平衡[8]。加拿大Biotech公司于1985年推出一個以秸稈為墊料的發(fā)酵床系統(tǒng)[9],克羅地亞的Margeta等分析了本國養(yǎng)豬發(fā)酵床優(yōu)缺點及其發(fā)展前景[10],波蘭的Knecht等研究發(fā)現(xiàn)發(fā)酵床豬舍豬寄生蟲病流行低于漏縫地板豬舍[11],劉波等設計了2100m2的大欄發(fā)酵床智能化養(yǎng)豬系統(tǒng)的豬舍[12]。

關于發(fā)酵床微生物特性研究報道較少,劉波等研究了發(fā)酵床微生物群落脂肪酸生物標記多樣性[13]。鄭雪芳等分析了發(fā)酵床墊料微生物亞群落的分化[14]。張學峰等揭示了不同深度發(fā)酵床墊料土著穩(wěn)定微生物菌群[15]。王迪分離鑒定了發(fā)酵床的芽胞桿菌(Bacillus)[16]。林莉莉等研究了發(fā)酵床豬舍環(huán)境與豬體表微生物分布狀況[17]。張慶寧從微生物發(fā)酵床篩選出了分解豬糞的芽胞桿菌[18]。劉讓等篩選芽胞桿菌作為發(fā)酵床發(fā)酵菌種[19]。

微生物發(fā)酵床對豬病具有一定的生防作用,鄭雪芳等研究發(fā)現(xiàn)微生物發(fā)酵床養(yǎng)豬基質墊層形成的穩(wěn)定微生物群落結構能抑制大腸桿菌特別是致病性大腸桿菌的生長[20]。畢小艷研究了豬用發(fā)酵床墊料中微生物動態(tài)變化及對豬免疫力的影響[21]。以往的研究表明,芽胞桿菌作為發(fā)酵床的優(yōu)勢菌群,具有生長優(yōu)勢強,耐發(fā)酵高熱,能夠產生多種與豬糞降解相關的酶類[18],具有降解豬糞[16]、抑制病原[22]、清除臭味[23]等的作用；隨著在發(fā)酵床飼養(yǎng)時間的延長,從對應豬分離的大腸桿菌的抗藥性逐漸降低[18]。

研究發(fā)酵床芽胞桿菌特性,了解發(fā)酵床芽胞桿菌空間分布多樣性,對于研究發(fā)酵床微生物群落功能、豬糞降解機理、豬病生防機理等具有重要意義。目前,關于微生物發(fā)酵床芽胞桿菌種類結構,數(shù)量分布,空間格局等的研究未見報道。本研究以2100 m2的微生物發(fā)酵床大欄養(yǎng)豬為研究對象,通過空間格局采樣,用可培養(yǎng)法分離芽胞桿菌方法,對發(fā)酵床芽胞桿菌種類分布、數(shù)量分布、空間分布的多樣性進行分析,利用空間分布型、多樣性指數(shù)評估養(yǎng)豬微生物發(fā)酵床中芽胞桿菌的空間分布特征,為發(fā)酵床管理、豬糞資源化利用、豬病的生防等提供研究基礎。

1 材料與方法

1.1 樣品的采集

2015年1月26日,從福建省農業(yè)科學院福清現(xiàn)代設施農業(yè)樣本工程示范基地大欄養(yǎng)豬微生物發(fā)酵床采集樣品,發(fā)酵床墊料已使用1a至1.5a左右。該大欄發(fā)酵床豬場建筑面積為2100 m2(35 m × 60 m),發(fā)酵床槽面積1910 m2,除兩個隔離欄,養(yǎng)殖面積為1600 m2,發(fā)酵床深度80 cm,發(fā)酵床墊料由70%椰糠和30%谷殼組成。發(fā)酵床飼養(yǎng)1600頭育肥豬,飼養(yǎng)密度為1頭/m2(圖1)。

圖1 大欄微生物發(fā)酵床Fig.1 The piggery bedding

采樣方法：將大欄發(fā)酵床寬度方向劃分4欄(行),長度方向劃分8欄(列),每個欄采用五點取樣方法采集0—20 cm的樣品并混合獲得欄的墊料樣品,共采集32個空間的32個樣品(圖2),裝入無菌聚氯乙烯塑料瓶,帶回實驗室,并立即進行芽胞桿菌菌株的分離與保存。

1.2 儀器與試劑

PCR儀和凝膠成像分析儀(Bio-Rad公司)；恒溫培養(yǎng)箱(BI- 250AG)購自施都凱儀器設備(上海)有限公司；2×PCR Master Mix購自上海鉑尚生物技術有限公司；引物由上海鉑尚生物技術有限公司合成。LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10.0 g,酵母提取物5.0 g,氯化鈉5.0 g,pH 7.2—7.4,瓊脂15.0 g,水1.0 L。

1.3 微生物發(fā)酵床芽胞桿菌分離與鑒定

通過梯度稀釋涂布法分離獲得微生物發(fā)酵床樣品中的芽胞桿菌,根據(jù)菌落形態(tài)特征等進行芽胞桿菌種類歸類、統(tǒng)計計數(shù)及純化,采用-80 ℃甘油冷凍法進行保存。采用Tris-飽和酚法提取芽胞桿菌基因組DNA。采用通用細菌16S rRNA引物進行擴增、測序,主要參考Liu等描述的方法[24]。16S rRNA基因擴增引物為27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG- 3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT- 3′)。檢測出有條帶的菌株PCR產物送至上海鉑尚生物技術有限公司進行測序。將測序所得16S rRNA序列在韓國網站(EZtaxon-e.ezbiocloud.net)上進行序列比對分析[25],初步判斷得出芽胞桿菌種的分類地位。根據(jù)Tindall等描述,當16S rRNA相似性>97%時可定義為同一個分類單元[26]。

圖2 發(fā)酵床空間采集格局Fig.2 Samples information collected from fermentation bed in the piggrey

1.4 微生物發(fā)酵床樣方芽胞桿菌種類與數(shù)量空間分布

微生物發(fā)酵床劃分成橫向4個單元,縱向8個單元,共取樣32個空間樣本。統(tǒng)計各空間樣本芽胞桿菌種類數(shù)、數(shù)量總和、最大值、最小值、平均值等,比較發(fā)酵床空間樣本芽胞桿菌種類與數(shù)量的變化,繪制直方圖分析芽胞桿菌種類在微生物發(fā)酵床空間樣本中出現(xiàn)頻次和數(shù)量。

1.5 微生物發(fā)酵床芽胞桿菌空間分布型

基于微生物發(fā)酵床4行8列采集方案,構建數(shù)據(jù)矩陣,統(tǒng)計每行樣本芽胞桿菌平均值和方差,利用聚集度指標和回歸分析法,分析芽胞桿菌樣方空間分布型(表1)。

表1 微生物發(fā)酵床芽胞桿菌空間分布型指數(shù)

1.6 微生物發(fā)酵床芽胞桿菌多樣性指數(shù)

以芽胞桿菌種類為樣本,以樣本為指標,構建數(shù)據(jù)矩陣,利用生物統(tǒng)計軟件PRIMER v5(Primer-E Ltd.,Plymouth,United Kingdom [2001])進行計算、統(tǒng)計微生物發(fā)酵床芽胞桿菌種類出現(xiàn)頻次、種類數(shù)量、豐富度指數(shù)(D)、均勻度指數(shù)(J′)、優(yōu)勢度指數(shù)(λ)、Shannon-Wiener指數(shù)(H′)和Hill指數(shù)(N1)。

以芽胞桿菌為樣本,以多樣性指數(shù)為指標,構建數(shù)據(jù)矩陣,通過生物統(tǒng)計軟件SPSS 16.0,以歐氏距離為尺度,用類平均法進行微生物發(fā)酵床芽胞桿菌多樣性指數(shù)聚類分析。多樣性指數(shù)公式如下：

1)豐富度指數(shù)(D)

D=(S-1)/lg (N)

2)均勻度指數(shù)(J′)

J′=H′/lg (S)

3)優(yōu)勢度指數(shù)(λ)

4)Shannon-Wiener指數(shù)(H′)

H′=∑Pi×lgPi)

5)Hill指數(shù)(N1)

N1=exp (H′)

式中,Pi=Ni/N。Ni為第i種芽胞桿菌的數(shù)量,S為芽胞桿菌占據(jù)的單元總數(shù),N為芽胞桿菌種類個體總數(shù)。

2 結果與分析

2.1 微生物發(fā)酵床芽胞桿菌的分離與鑒定

實驗結果見表2。根據(jù)菌落形態(tài)特征區(qū)分,從32份微生物發(fā)酵床空間樣品中分離獲得了芽胞桿菌452株,通過16S rRNA基因序列比對分析,所有芽胞桿菌菌株相似性皆大于97.0%,鑒定為48個種,隸屬于芽胞桿菌綱的2個科即芽胞桿菌科(Bacillaceae)和類芽胞桿菌科(Paenibacillaceae),8個屬即芽胞桿菌屬(Bacillus)(30種)、類芽胞桿菌屬(Paenibacillus)(5種)、賴氨酸芽胞桿菌屬(Lysinibacillus)(6種)、短芽胞桿菌屬(Brevibacillus)(3種)、鳥氨酸芽胞桿菌屬(Ornithinibacillus)(1種)、大洋芽胞桿菌屬(Oceanibacillus)(1種)、少鹽芽胞桿菌屬(Paucisalibacillus)(1種)和纖細芽胞桿菌屬(Gracilibacillus)(1種)。

表2 微生物發(fā)酵床芽胞桿菌種類分離與鑒定

FJAT是FuJian Agaricultural Technology(福建農業(yè)科技)的縮寫

2.2 微生物發(fā)酵床樣本芽胞桿菌空間分布

2.2.1 微生物發(fā)酵床空間樣本芽胞桿菌種類分布

實驗結果見表3。微生物發(fā)酵床劃分成橫向4個單元、縱向8個單元,共取樣32個空間樣本,分離鑒定統(tǒng)計各空間樣本中芽胞桿菌的種類和數(shù)量,結果表明：(1)各空間樣本芽胞桿菌種類差異很大,從最多的14種(MF- 1- 3)到最少的5種(MF- 6- 3)；(2)芽胞桿菌分布在發(fā)酵床空間差異很大,有些芽胞桿菌種類分布在多個空間樣本中,如阿氏芽胞桿菌(Bacillusaryabhattai)可以分布在空間樣本MF- 1- 1、MF- 1- 2、MF- 1- 3、MF- 1- 4等19個空間樣本中,有些種類只分布在特定的空間樣本中,如?？谘堪麠U菌(Bacillushaikouensis)僅分布在空間樣本MF- 5- 3,居湖短芽胞桿菌(Brevibacilluslimnophilus)僅分布在空間樣本MF- 4- 1等；(3)芽胞桿菌單個菌株在一個空間樣本中的最大含量是環(huán)狀芽胞桿菌(Bacilluscirculans),分布數(shù)量為50.0×106個/g(MF- 1- 4)；含量最小的是印空研芽胞桿菌(Bacillusisronensis)等,分布數(shù)量為0.01×106個/g(MF- 4- 3)。

表3 微生物發(fā)酵床空間樣本芽胞桿菌種類含量

2.2.2 微生物發(fā)酵床芽胞桿菌空間頻次分布

基于表3統(tǒng)計,微生物發(fā)酵床芽胞桿菌種類空間出現(xiàn)頻次分析結果見圖3。芽胞桿菌種類微生物發(fā)酵床32個空間樣本中出現(xiàn)頻次差異顯著,有的種類廣泛分布在空間樣本中,有的種類分布在少數(shù)空間樣本中,其分布廣泛性可分為3類：第I類為廣分布種類,有8個種分布在14—29個空間樣本中,分別為地衣芽胞桿菌(Bacilluslicheniformis)(29樣本)、柯赫芽胞桿菌(B.kochii)(23樣本)、甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌(B.methylotrophicus)(21樣本)、高地芽胞桿菌(B.altitudidns)(18樣本)、阿氏芽胞桿菌(B.aryabhattai)(19樣本)、環(huán)狀芽胞桿菌(B.circulans)(16樣本)、耐鹽賴氨酸芽胞桿菌(Lysinibacillushalotolerans)(14樣本)和克勞氏芽胞桿菌(B.clausii)(14樣本)。第II類為寡分布種類,有8個種分布在5—10個空間樣本中,它們是特基拉芽胞桿菌(B.tequilensis)(10樣本)、根際芽胞桿菌(B.rhizosphaerae)(8樣本)、拾蛤鳥氨酸芽胞桿菌(Ornithinibacillusscapharcae)(8樣本)、嗜鹽噬糖芽胞桿菌(B.halosaccharovorans)(7樣本)、解淀粉芽胞桿菌(B.amyloliquefaciens)(6樣本)、蠟狀芽胞桿菌(B.cereus)(6樣本)、枯草芽胞桿菌(B.subtilis)(8樣本)和暹羅芽胞桿菌(B.siamensis)(5樣本)。第III類為少分布種類,其余的32個種分布在1—4個空間樣本中。特別注意地是類芽胞桿菌和短芽胞桿菌在這都屬于少分布種類,常見的蠟狀芽胞桿菌和枯草芽胞桿菌屬于寡分布類型的種類。

圖3 微生物發(fā)酵床空間樣本芽胞桿菌出現(xiàn)頻次Fig.3 Occurrence frequency of Bacillus-like in the piggery bedding

圖4 微生物發(fā)酵床芽胞桿菌數(shù)量分布多樣性Fig.4 Distribution diversity of Bacillus-like species in the piggery bedding

2.2.3 微生物發(fā)酵床芽胞桿菌數(shù)量分布

基于表3統(tǒng)計,微生物發(fā)酵床芽胞桿菌數(shù)量分布結果見圖4。微生物發(fā)酵床48種芽胞桿菌數(shù)量最大值94.11×106個/g,最小值為0.1×106個/g,平均值為8.96×106個/g。根據(jù)數(shù)量分布可將其分為4類,第I類為高含量組,優(yōu)勢種群,占比16.7%,數(shù)量分布在(17—94)×106個/g之間,屬于該類的芽胞桿菌有環(huán)狀芽胞桿菌、地衣芽胞桿菌、阿氏芽胞桿菌、甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌、人參土芽胞桿菌(Paenibacillusginsengiterrae)、柯赫芽胞桿菌、高地芽胞桿菌和嗜鹽噬糖芽胞桿菌；第II類為中含量組,常見種群,占比14.6%,數(shù)量分布在(8—13)×106個/g之間,屬于該類的芽胞桿菌包含特基拉芽胞桿菌、克勞氏芽胞桿菌、尼氏芽胞桿菌(B.nealsonii)、小球狀少鹽芽胞桿菌(Paucisalibacillusglobulus)、伊利諾伊類芽胞桿菌(Paenibacillusillinoisensis)、枯草芽胞桿菌和耐鹽賴氨酸芽胞桿菌；第III類為寡含量組,寡見種群,占比18.76%,數(shù)量分布在(3—5)×106個/g之間,屬于該類的為印空研芽胞桿菌(B.isronensis)、根際芽胞桿菌、解淀粉芽胞桿菌(B.amyloliquefaciens)、海洋纖細芽胞桿菌(Gracilibacillusmarinus)、蔬菜芽胞桿菌(Bacillusoleronius)、拾蛤鳥氨酸芽胞桿菌(Or.scapharcae)、青貯窖芽胞桿菌(Bacillussiralis)、蠟狀芽胞桿菌和堆肥賴氨酸芽胞桿菌(Lysinibacilluscomposti)；第IV類為低含量組,偶見種群,占比50%,數(shù)量分布在(2—0.1)×106個/g之間,屬于該類的芽胞桿菌有蠟狀芽胞桿菌、暹羅芽胞桿菌(Bacillussiamensis)、?？谘堪麠U菌(B.haikouensis)、霍氏芽胞桿菌(Bacillushorneckiae)、土地芽胞桿菌(Bacillushumi)、嗜常溫芽胞桿菌(Bacillusmesophilum)、越南芽胞桿菌(Bacillusvietnamensis)、清國醬賴氨酸芽胞桿菌(Lysinibacilluschungkukjangi)、波茨坦短芽胞桿菌(Brevibacillusborstelensis)、錳礦土賴氨酸芽胞桿菌(Lysinibacillusmanganicus)、煙酸芽胞桿菌(Bacillusniacini)、居湖短芽胞桿菌(Brevibacilluslimnophilus)、硝化短芽胞桿菌(Brevibacillusnitrificans)、長賴氨酸芽胞桿菌(L.macroides)、淤泥大洋芽胞桿菌(Oceanibacilluscaeni)、飼料類芽胞桿菌(Paenibacilluspabuli)、牛奶類芽胞桿菌(Paenibacilluslactis)、彎曲芽胞桿菌(B.flexus)、黃海芽胞桿菌(B.marisflavi)、海床類芽胞桿菌(B.oceanisediminis)、泰門芽胞桿菌(B.timonensis)、廈門芽胞桿菌(B.xiamenensis)、紡錘形賴氨酸芽胞桿菌(L.fusiformis)和巴倫氏類芽胞桿菌(Paenibacillusbarengoltzii)。

2.3 微生物發(fā)酵床芽胞桿菌空間分布型

基于表3,將4橫8縱分割的32個空間樣本單元內的各芽胞桿菌數(shù)量按單元分別作總和統(tǒng)計,考察芽胞桿菌作為一個種群在發(fā)酵床的空間分布型,統(tǒng)計結果見表4。結果表明：微生物發(fā)酵床空間樣本單元芽胞桿菌數(shù)量分布差異很大,其中樣本中數(shù)量最高的是97.6×106個/g,位于空間樣本M- 4- 1,最低的是0.800×106個/g,位于空間樣本M- 7- 4,平均值為13.77×106個/g。利用表3數(shù)據(jù)統(tǒng)計空間分布型指數(shù)見表5。空間分布型的聚集度測定結果表明,芽胞桿菌I指標=22.6183>0,為聚集分布；平均擁擠度(m*/m)指標=2.4212>1,為聚集分布；CA指標=1.4212>0,為聚集分布；擴散系數(shù)(C)=23.6183>1,為聚集分布；負二項分布K指標=1.0778>0,為聚集分布,表明芽胞桿菌在發(fā)酵床中分布為聚集分布。

研究擁擠度(m*)與平均值(m)之間的關系,用m*-m回歸分析,建立m*-m回歸式m*=a+bm,結果表明,m*-m回歸方程(IWAO)為m*=-47.1208+5.9076m,r=0.7795；a=-47.1208<0,表明芽胞桿菌微生物個體群之間相互排斥,b=5.9076>1,表明芽胞桿菌空間分布型為聚集分布。運用冪法則分析表明,Taylor冪法則方程為lg(s)=-1.2876+3.1966lg(x),r=0.8233,b=3.1966>1,為聚集分布。

綜上所述,養(yǎng)豬微生物發(fā)酵床芽胞桿菌空間分布為聚集分布。

2.4 微生物發(fā)酵床芽胞桿菌多樣性指數(shù)

2.4.1 微生物發(fā)酵床芽胞桿菌空間分布多樣性

基于表4統(tǒng)計,芽胞桿菌總體多樣性指數(shù)結果見表6。芽胞桿菌含量范圍為(0.01—9.411)×107個/g；48種芽胞桿菌總含量達4.41×108個/g；豐富度指數(shù)(D)、優(yōu)勢度指數(shù)(λ)、Shannon-Wiener指數(shù)(H′)、均勻度指數(shù)(J′)分別為10.49276、0.26342、1.3589、0.98027。芽胞桿菌數(shù)量達1.5×107個/g以上的種類有環(huán)狀芽胞桿菌(9.411×107個/g)、地衣芽胞桿菌(7.566×107個/g)、阿氏芽胞桿菌(5.4223×107個/g)、甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌(2.271×107個/g)、人參土芽胞桿菌(2.000×107個/g)、柯赫芽胞桿菌(1.972×107個/g)、嗜鹽噬糖芽胞桿菌(1.710×107個/g)。

表4 微生物發(fā)酵床空間樣本芽胞桿菌含量

表5 微生物發(fā)酵床芽胞桿菌空間分布型指數(shù)

表6 微生物發(fā)酵床芽胞桿菌群落多樣性指數(shù)

2.4.2 微生物發(fā)酵床芽胞桿菌種類分布多樣性

芽胞桿菌種類多樣性指數(shù)基于表3計算,結果見表7。芽胞桿菌Shannon-Wiener指數(shù)范圍0—2.88,最大的種類為地衣芽胞桿菌(2.88),最小的種類為?？谘堪麠U菌、黃海芽胞桿菌、海洋芽胞桿菌等22種芽胞桿菌；優(yōu)勢度指數(shù)范圍0.08—1,最大的種類是黃海芽胞桿菌、海洋芽胞桿菌等22種芽胞桿菌,最小的種類是地衣芽胞桿菌(0.08)；Hill指數(shù)范圍1—17.75,最大的種類是地衣芽胞桿菌(17.75),最小的種類是?？谘堪麠U菌、黃海芽胞桿菌、海洋芽胞桿菌等22種芽胞桿菌；芽胞桿菌豐富度指數(shù)范圍0—7.71,最大的種類是,最小的種類為?？谘堪麠U菌、黃海芽胞桿菌、海洋芽胞桿菌等22種芽胞桿菌；均勻度指數(shù)范圍0—1,最大的種類是長賴氨酸芽胞桿菌和波茨坦短芽胞桿菌,最小的種類是黃海芽胞桿菌、海洋芽胞桿菌等22種芽胞桿菌。

2.4.3 微生物發(fā)酵床芽胞桿菌多樣性指數(shù)聚類分析

芽胞桿菌多樣性指數(shù)聚類分析,根據(jù)表7數(shù)據(jù),以歐式距離為尺度,用類平均法進行系統(tǒng)聚類,作圖5。當λ=17時,可將其分為2類：

第I類為高豐富度高含量類型,包括了7個種,即甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌、耐鹽賴氨酸芽胞桿菌、高地芽胞桿菌、克勞氏芽胞桿菌、阿氏芽胞桿菌、科赫芽胞桿菌、地衣芽胞桿菌。

表7 發(fā)酵床芽胞桿菌種類空間分布多樣性

第II類為較低豐富度較低含量類型,該類分為2個亞類,第一亞類為中等豐富度中等含量的類型,包括了10個種,即彎曲芽胞桿菌、蠟狀芽胞桿菌、暹羅芽胞桿菌、環(huán)狀芽胞桿菌、枯草芽胞桿菌、嗜鹽噬糖芽胞桿菌、解淀粉芽胞桿菌、拾蛤鳥氨酸芽胞桿菌、根際芽胞桿菌、特基拉芽胞桿菌。第二亞類為低豐富度低含量的類型,其余的31個種。

圖5 芽胞桿菌種類分布聚類分析Fig.5 Distribution analysis of Bacillus-like speceis

3 討論

微生物發(fā)酵床養(yǎng)豬是近幾年發(fā)展起來的一種現(xiàn)代化生態(tài)養(yǎng)豬模式和技術體系,目前在我國各地得到了廣泛應用。微生物發(fā)酵床能高效分解豬糞、消除惡臭,并最終將豬糞轉化形成人工腐殖質,而后者又可以進一步研制成微生物肥料、生物農藥、生物育苗與栽培基質等高值產品,因此,同時實現(xiàn)了養(yǎng)豬污染的原位微生物治理和豬糞的資源化利用。在此過程中,微生物起到了關鍵作用。前期,作者所在課題組利用高通量宏基因組學技術分析了發(fā)酵床墊料中的微生物多樣性,發(fā)現(xiàn)發(fā)酵床墊料中的微生物多樣性極其豐富,而且存在著種類多樣的芽胞桿菌(Bacillus-like)(數(shù)據(jù)待發(fā)表)。

芽胞桿菌是一類重要的微生物資源,種類繁多,可以產生多種具有抑菌功能物質,如I和II類羊毛硫抗生素(lantibiotics)[27]。因此,芽胞桿菌對豬群具有抗菌防病功能,具有作為益生菌開發(fā)的潛力。Manhar等研究發(fā)現(xiàn)枯草芽胞桿菌AMS6具有耐強酸(pH 2.0)和膽汁(0.3%)、高抗菌活性、抗病原菌黏附和較強的纖維素降解能力等益生菌特性,作為飼料添加劑可以增強動物纖維素消化和腸道健康[28]。Lopetuso等綜述了益生克勞氏芽胞桿菌的臨床應用效果、益生菌與腸道屏障相互作用、重建腸道平衡的可能作用機理[29]。大量研究表明,芽胞桿菌還具有高效降解豬糞中的有機物、抗生素、藥物等及除臭、減少氨氣排放等功能[30-34]。

為了進一步分析微生物發(fā)酵床墊料中可培養(yǎng)芽胞桿菌種群及其空間分布規(guī)律,本文通過稀釋涂布平板和16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育結合法研究墊料中的可培養(yǎng)芽胞桿菌空間分布多樣性。結果表明：1)微生物發(fā)酵床墊料中的可培養(yǎng)芽胞桿菌種類極其多樣,從32份微生物發(fā)酵床樣品共分離獲得芽胞桿菌452株,隸屬于芽胞桿菌科和類芽胞桿菌科8個屬的48個種；2)發(fā)酵床墊料中的芽胞桿菌呈現(xiàn)出非常高的豐度,其中,豐度最高的達到94.11×106個/g,最低的也達到了0.1×106個/g,平均豐度高達8.96×106個/g；3)優(yōu)勢芽胞桿菌種群分別為地衣芽胞桿菌、阿氏芽胞桿菌、環(huán)狀芽胞桿菌、柯赫芽胞桿菌、甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌、高地芽胞桿菌等；4)微生物發(fā)酵床不同空間的芽胞桿菌數(shù)量分布差異很大,表現(xiàn)為聚集分布型。這些結果表明,芽胞桿菌是發(fā)酵床墊料中的重要微生物種群,也提示：豬糞對芽胞桿菌的富集起到了一定作用。

盡管發(fā)酵床墊料芽胞桿菌種群及其空間分布的研究較少報道,但國內外研究者在其他含有豬糞環(huán)境(如豬糞耗氧、厭氧堆肥)開展的相關研究也發(fā)現(xiàn)了類似結果。如,Yi等利用可培養(yǎng)、限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)和變性劑梯度凝膠電泳(PCR-DGGE)法分析發(fā)現(xiàn)豬糞堆肥過程中可培養(yǎng)芽胞桿菌的數(shù)量和時空分布特性隨著溫度的改變發(fā)生了顯著地變化,枯草芽胞桿菌和蠟樣芽胞桿菌為優(yōu)勢種,在各階段,芽胞桿菌的多樣性均較低；在高溫階段堆肥各層的芽胞桿菌含量最高,而在各階段的堆肥中間層含量均最低[35]。Guo等采用PCR-RFLP法研究發(fā)現(xiàn)豬糞堆肥降溫階段堆肥中間層芽胞桿菌屬是優(yōu)勢種群,底層優(yōu)勢種群則為梭菌屬[36]。Li等分析發(fā)現(xiàn)牛糞高溫堆肥階段芽胞桿菌屬、地芽胞桿菌屬(Geobacillus)和尿素芽胞桿菌屬(Ureibacillus)是優(yōu)勢屬,熱脫氮地芽胞桿菌(G.thermodenitrificans)是優(yōu)勢種；在高溫后期,就地堆肥地芽胞桿菌(G.toebii)和領地尿素芽胞桿菌(U.terrenus)是優(yōu)勢種[37]。Guo等也發(fā)現(xiàn)豬糞高溫堆肥過程中芽胞桿菌屬是各層最常見種群[38]。He等研究表明芽胞桿菌種類在雞糞堆肥各個階段均有較高的含量[39]。本文研究結果與上述不完全一致,發(fā)酵床墊料的優(yōu)勢屬與上述相同亦為芽胞桿菌屬,但優(yōu)勢種群不一致。本研究亦獲得了豬糞堆肥過程中的優(yōu)勢種枯草芽胞桿菌和蠟質芽胞桿菌,但該2種芽胞桿菌非發(fā)酵床的優(yōu)勢種群。牛糞高溫堆肥的優(yōu)勢種未在養(yǎng)豬發(fā)酵床墊料中發(fā)現(xiàn),其種群結構與豬糞的差異很大。本研究發(fā)現(xiàn)養(yǎng)豬發(fā)酵床中僅次于芽胞桿菌屬的種群為賴氨酸芽胞桿菌屬,而該屬在豬糞和牛糞堆肥過程皆不為優(yōu)勢屬。微生物發(fā)酵床芽胞桿菌種類分布多樣性指數(shù)不均一,可能與發(fā)酵床的發(fā)酵等級和芽胞桿菌種類對發(fā)酵床成分的適應性和利用有關。有些芽胞桿菌種類出現(xiàn)富集成為優(yōu)勢種,幾乎存在于整個發(fā)酵床,如地衣芽胞桿菌,但有些適應力弱導致其數(shù)量少,僅在某些位置存在。這說明墊料發(fā)酵程度對微生物種類分布有很大的影響。薛超等發(fā)現(xiàn)連作會造成土壤微生物的選擇適應性,出現(xiàn)一些種群富集,而一些種群數(shù)量降低的現(xiàn)象[40],進而導致不同茬次營養(yǎng)基質中微生物對碳源數(shù)量的利用能力出現(xiàn)顯著差異[41]。微生物發(fā)酵床主要成分為椰糠和谷殼等高纖維材料,所構建出的生存環(huán)境適合于能降解纖維的微生物生存。葉少文等分析了微生物發(fā)酵床墊料不同深度酶活,發(fā)現(xiàn)墊料中纖維素酶活和半纖維素酶活性很高,揭示了一類微生物的生存空間[42]。

在養(yǎng)豬微生物發(fā)酵床芽胞桿菌優(yōu)勢種群中,地衣芽胞桿菌能夠產生纖維素酶、果膠酶、淀粉酶、蛋白酶等[43-44],這些酶作用能為地衣芽胞桿菌的生存提供碳源和氮源能量來源,Mc Carthy等發(fā)現(xiàn)地衣芽胞桿菌是豬糞固體堆肥過程的優(yōu)勢可培養(yǎng)微生物,這就印證了本研究中地衣芽胞桿菌是養(yǎng)豬發(fā)酵床墊料中優(yōu)勢種群結果的可靠性[45]。Islas-Espinoza等發(fā)現(xiàn)地衣芽胞桿菌能降解豬糞中難降解的合成抗生素磺胺類藥物,表明養(yǎng)豬微生物發(fā)酵床中大量地衣芽胞桿菌的存在在豬糞降解過程扮演著重要角色[32]。阿氏芽胞桿菌具有堅強的生命力,分布范圍廣。優(yōu)勢種高地芽胞桿菌是一種多功能芽胞桿菌,能產生堿性蛋白酶[46],可以用于固體發(fā)酵的添加菌劑[47]。優(yōu)勢種阿氏芽胞桿菌和高地芽胞桿菌的強大存在可能與發(fā)酵床的發(fā)酵健康程度密切相關。環(huán)狀芽胞桿菌在微生物發(fā)酵床的廣泛存在與發(fā)酵床具有生防抗病作用有一定的相關性。環(huán)狀芽胞桿菌作為發(fā)酵床的優(yōu)勢種群是一種重要的動物益生菌,它不僅能產生抑制豬病原菌的物質和表面活性劑[48],同時,還可以作為堆肥發(fā)酵程度檢測指標[49]。優(yōu)勢種嗜鹽噬糖芽胞桿菌源于鹽堿土壤分離,關于此菌報道甚少,屬于芽胞桿菌脂肪酸群III,特性就是可以在偏鹽堿性環(huán)境生存[50]。藍江林等發(fā)現(xiàn)微生物發(fā)酵床墊料含鹽量很高,且pH普遍在8.0—9.0之間,隨著發(fā)酵時間的增加,墊料中的鹽濃度和pH皆呈上升狀態(tài)[51]。因此,發(fā)酵床墊料的高鹽堿度很可能是導致耐(嗜)鹽堿芽胞桿菌種類存在的主要原因。優(yōu)勢種科赫芽胞桿菌文獻報道較少,該菌最初是從乳制品分離獲得,有著非常寬廣的生長條件,如溫度范圍10—40 ℃、酸堿度范圍pH 6.0—10.5、鹽度范圍0%—10% NaCl[52],該菌的生長特性適應微生物發(fā)酵床發(fā)酵過程生長條件極端變化而廣泛分布。

微生物發(fā)酵床含有豐富的微生物資源,通過微生物發(fā)酵床芽胞桿菌種群多樣性分析,獲得了大量的芽胞桿菌資源,這為進一步挖掘新功能和新物種提供了重要來源。關于芽胞桿菌種群變化與微生物發(fā)酵床生態(tài)功能的關聯(lián)有待于進一步探討和研究。

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SpatialdistributionpatternandcommunitydiversityoftheBacillus-likespeciesinafermentationbedsystemforpigrearing

LIU Guohong, LIU Bo*, WANG Jieping, ZHU Yujing, CHE Jianmei, CHEN Qianqian, CHEN Zheng

AgriculturalBio-ResourcesResearchInstitute,FujianAcademyofAgriculturalSciences,Fuzhou350003,China

To provide a foundation for the management of microbial fermentation beds, new resource mining ofBacillus-like species, and development of microbial agents, we investigated the spatial distribution pattern and community diversity ofBacillus-like species in the litters of a pig-on-litter system. The microbial fermentation bed was divided into 32 square areas of 4 rows × 8 columns. A sample from each area was obtained using a five-point sampling mode.Bacillus-like bacteria were isolated from the 32 samples using a culture method and preliminarily identified based on 16S rRNA gene sequences. The spatial distribution pattern of theBacillus-like bacteria was analyzed using a concentration index and regression analysis. Moreover, the Shannon-Wiener diversity index, Simpson dominance index, Hill index, and richness were separately calculated to reveal the community structure and diversity of theBacillus-like bacteria in the microbial fermentation bed. A total of 452Bacillus-like isolates were obtained from the 32 litter samples, and identified as 48 species belonging to eight genera and two Families (Bacillaceae and Paenibacillaceae) within the Bacilli by 16S rRNA gene sequences. The species numbers for the genera were as follows: 30 forBacillus, six forLysinibacillus, five forPaenibacillus, three forBrevibacillus, and one for each ofOrnithinibacillus,Oceanobacillus,Paucisalibacillus, andGracilibacillus. There was a large difference in the distribution ofBacillus-like species in the fermentation bed. On the basis of their occurrence frequency, theBacillus-like species could be discriminated as the widespread species, includingBacilluslicheniformis; sparsely distributed species, includingB.rhizosphaerae; and rare species, includingB.flexus. According to the abundance of each species, theBacillus-like species could be classified into the high-content dominant populations, includingB.licheniformis; medium-content common populations, includingLysinibacillushalotolerans; oligocontent oligo populations, includingB.rhizosphaerae, and low-content occasional populations, includingB.humi. The concentration class and regression analysis results indicated that the spatial distribution pattern of theBacillus-like species in the microbial fermentation bed was an aggregated distribution. In the litters, the content range, total content, richness, Simpson index, Shannon-Wiener index, and Pielou′s evenness index of theBacillus-like species were 0.01—94.1 × 106cfu/g, 4.41 × 108cfu/g, 0.4928, 0.2634, 1.3589, and 0.9803, respectively. Moreover,B.licheniformisappeared to have the highest Shannon-Wiener index value. On the basis of the diversity index cluster analysis, all theBacillus-like species could be divided into a high richness high content group and a low richness low content group. TheBacillus-like bacteria can actively inhabit microbial fermentation beds and have rich species and abundant contents. Thus, the microbial fermentation bed can be considered as a natural bacterial “fermentation tank,” which is expected to be directly used as a microbial inoculum and applied in the fields for purposes including soil improvement, crop disease prevention and control, and pollution management.

Bacillus-like species; piggery bedding; 16S rRNA gene; spatial distribution; diversity

國家自然科學基金(31370059)；福建省自然科學基金(2016J01129)；福建省公益項目(2015R1018- 7)；農業(yè)部948項目(2016-X21)

2016- 07- 26; < class="emphasis_bold">網絡出版日期

日期:2017- 06- 01

*通訊作者Corresponding author.E-mail: fzliubo@163.com

10.5846/stxb201607261528

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