卓實(shí)，江川，黃玉芳，潘艷琳

(福建中醫(yī)藥大學(xué) 附屬人民醫(yī)院 藥學(xué)部，福建 福州 350004)

·基礎(chǔ)研究·

黃藥子配伍甘草對LO2細(xì)胞膜通透性影響的研究

卓實(shí)，江川*，黃玉芳，潘艷琳

(福建中醫(yī)藥大學(xué) 附屬人民醫(yī)院 藥學(xué)部，福建 福州 350004)

目的研究甘草配伍能減輕黃藥子對人肝細(xì)胞(LO2)膜通透性的影響。方法激光掃描共聚焦顯微鏡(LSCM)對經(jīng)二乙酸熒光素(FDA)染色后的LO2細(xì)胞進(jìn)行實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)熒光強(qiáng)度檢測。通過比較熒光強(qiáng)度的降低率來考察黃藥子及其甘草配伍后含藥血清在短時(shí)間內(nèi)對細(xì)胞膜通透性的影響。結(jié)果LSCM記錄細(xì)胞熒光強(qiáng)度變化，在10 min掃描停止時(shí)，黃藥子各組熒光強(qiáng)度降低率與空白組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，而甘草配伍組對熒光強(qiáng)度的影響較黃藥子組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，與空白組無差異(P>0.05)。結(jié)論黃藥子含藥血清短時(shí)間內(nèi)即影響肝細(xì)胞膜通透性，甘草配伍后可明顯減弱損傷作用，黃藥子引起肝損傷的機(jī)制可能是其對肝細(xì)胞膜的直接損傷作用，甘草配伍減毒作用與此途徑有關(guān)。

黃藥子；甘草；膜通透性

黃藥子原名黃獨(dú)，又名零余薯、黃狗頭、土芋、狗嗽、土首烏，為薯蕷科薯蕷屬植物黃獨(dú)DioscoreabulbiferaL.的塊莖。黃藥子味苦、辛，性涼，具有解毒消腫、化痰散結(jié)、涼血止血的作用，用于癭疾瘤腫、喉痹、吐血、衄血、咯血等[1-2]?，F(xiàn)主要用于治療各種原因引起的甲狀腺腫、各型癌癥、銀屑病、乳腺增生等癥，應(yīng)用廣泛，療效確切[3]。歷代醫(yī)書對黃藥子毒性就有所記載，《全國中草藥匯編》明確記載“苦，辛，涼，有小毒。”為更加合理利用黃藥子藥理活性而制約其有毒成分的危害，發(fā)揮黃藥子的治療效果，筆者通過前期實(shí)驗(yàn)已明確黃藥子配伍甘草降低對肝臟的毒性[4]。本實(shí)驗(yàn)通過黃藥子及其配伍甘草含藥血清對肝細(xì)胞膜損傷實(shí)驗(yàn)，為配伍減毒增效機(jī)制的研究提供了前提，同時(shí)也為臨床合理與安全應(yīng)用中藥提供理論與實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 試劑

黃藥子飲片：產(chǎn)地廣西，經(jīng)福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥鑒定教研室盧偉教授鑒定為薯蕷科植物黃獨(dú)DioscoreabulbiferaL．的塊莖；甘草飲片：產(chǎn)地甘肅，經(jīng)福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥鑒定教研室盧偉教授鑒定為豆科植物甘草GlycyrrhizauralensisFisch.的干燥根和根莖；中藥飲片均購自福建回春醫(yī)藥連鎖有限公司。DMEM培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖液(PBS)、0.25%胰蛋白酶(HyClone生物化學(xué)制品有限公司)，胎牛血清(FBS，杭州四季青公司)。二乙酸熒光素(FDA，Solarbio公司)。

1.2 儀器及設(shè)備

LSM-710激光掃描共聚焦顯微鏡(德國ZEISS公司)，Airtech超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備有限公司)，HF212UV二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱(Thermo Forma公司)，ECLIPSE生物顯微鏡(日本OLYMPUS)等。

2 方法

2.1 樣品處理

黃藥子飲片烘干，粉碎，10倍量水浸泡30 min，煎煮1 h，倒出藥液過濾；藥渣用8倍量水二次煎煮，煎煮1 h，合并2次藥液；過濾除去藥渣，后濃縮，以3000 r·min-1離心，除去藥渣，再次濃縮至0.5 g·mL-1(以生藥量計(jì))，用時(shí)稀釋。

黃藥子與甘草(1∶2)合煎劑同法煎煮制備藥液，濃縮至0.5 g·mL-1(以黃藥子生藥量為計(jì))。

2.2 動(dòng)物分組及含藥血清制備

雄性SD大鼠，清潔級(jí)，由福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK(滬)2007000520049。體重(200±20)g，隨機(jī)分為5組，每組5只，黃藥子高、中、低劑量組(給藥劑量分別為10、5、1 g·kg-1)、配伍組(給藥劑量10 g·kg-1，以黃藥子量計(jì))和正常對照組(蒸餾水)。灌胃給藥7 d，最后一次灌胃全天量，灌胃后1 h，麻醉，腹主動(dòng)脈采血。血液室溫靜置，離心，取上清液，過濾除菌，凍存。

2.3 細(xì)胞培養(yǎng)及熒光染色

細(xì)胞株：人正常肝細(xì)胞(LO2)，購自中科院上海細(xì)胞庫。于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中正常培養(yǎng)。

精密稱取0.010 7 g二乙酸熒光素(FDA)，溶于2 mL丙酮溶液，配制成5 mg·mL-1的準(zhǔn)備液，取10 μL準(zhǔn)備液用培養(yǎng)基配制成10 mL的工作液(10 μmol·L-1)。

取貼壁生長狀況良好的細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1.5×105個(gè)·mL-1，取共焦顯微鏡培養(yǎng)皿(玻底)，每孔加入1.5 mL單細(xì)胞懸液，待細(xì)胞貼壁后吸掉原培養(yǎng)基，用PBS溶液清洗2～3次，每孔加入FDA工作液1 mL，避光孵育2 h，每組重復(fù)3次。

2.4 LSCM監(jiān)測細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度變化

激光掃描共聚焦顯微鏡選定細(xì)胞分布均勻、染色良好的視野；在開始檢測時(shí)同時(shí)加入含藥血清，獲取時(shí)間序列圖像(每隔10 s記錄1次，連續(xù)記錄10 min)。掃描停止后，每組選定6個(gè)細(xì)胞，由系統(tǒng)記錄自動(dòng)生成熒光強(qiáng)度曲線，導(dǎo)出細(xì)胞熒光強(qiáng)度數(shù)據(jù)，按公式(1)計(jì)算熒光強(qiáng)度降低率。

熒光強(qiáng)度降低率=[(初始熒光強(qiáng)度-測定時(shí)間熒光強(qiáng)度)/初始熒光強(qiáng)度]×100%

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果

各組細(xì)胞熒光染色后10 min內(nèi)熒光強(qiáng)度見圖1。每組掃描取6個(gè)細(xì)胞作為分析對象，5組細(xì)胞熒光強(qiáng)度在2、4、6、8、10 min時(shí)變化率見表1。

注：A.黃藥子高劑量組；B.黃藥子中劑量組；C.黃藥子低劑量組；D甘草配伍組；E空白血清組。圖1 各組LO2細(xì)胞熒光強(qiáng)度圖(×400)

組別FDA熒光強(qiáng)度變化率(%)2min4min6min8min10min黃藥子高劑量組1479±2552403±4023574±5004091±6774883±816黃藥子中劑量組571±3151772±3002567±5723500±6364090±843黃藥子低劑量組331±262616±4241545±5322361±7243345±870配伍組 247±196547±2821025±5791386±8281632±1008空白血清組 039±303250±408903±5481318±5631304±525

4 討論

激光掃描共焦顯微鏡(LSCM)，是在顯微鏡基礎(chǔ)上配制激光光源、掃描裝置、共軛聚焦裝置和檢測系統(tǒng)形成的新型顯微鏡。與熒光顯微鏡相比，LSCM具有高分辨率、高靈敏度的特點(diǎn)[5]。二乙酸熒光素(FDA)是一種本身并沒有熒光的酯酶底物，只有被活細(xì)胞攝取后，在細(xì)胞非特異性酯酶的催化下才生成熒光素，經(jīng)480 nm激光激發(fā)出波長為530 nm左右的綠色熒光。如果細(xì)胞膜受損而不完整，生成的熒光素很快從細(xì)胞中擴(kuò)散，細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度將減弱[6-7]。

本實(shí)驗(yàn)采用LSCM對經(jīng)過FDA熒光染色的細(xì)胞進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)測，通過持續(xù)記錄加藥前后較短時(shí)間內(nèi)細(xì)胞熒光強(qiáng)度的變化，直觀監(jiān)測黃藥子在配伍甘草后對細(xì)胞影響狀況的變化。經(jīng)過前期預(yù)試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)長時(shí)間的激光掃描損傷細(xì)胞，出現(xiàn)熒光強(qiáng)度減弱的情況；后期會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞漂移的現(xiàn)象，從而影響結(jié)果分析，綜合考慮設(shè)定激光掃描時(shí)長為10 min。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與空白血清組對比，黃藥子各組對細(xì)胞的熒光強(qiáng)度均有較大的影響，隨著掃描時(shí)間增長，各組細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度降低率增大；10 min掃描停止時(shí)，黃藥子高、中、低劑量組熒光強(qiáng)度分別降低了(48.83±8.16)%、(40.90±8.43)%、(33.45±8.70)%，與空白組熒光強(qiáng)度降低率相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)；配伍組熒光強(qiáng)度降低了(16.32±10.08)%，與黃藥子各組熒光降低率相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)，與空白血清組熒光強(qiáng)度降低率沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。黃藥子高劑量組細(xì)胞熒光強(qiáng)度降低明顯，與配伍組及空白對照組均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)；中劑量組細(xì)胞熒光強(qiáng)度較空白組差異顯著，較配伍組顯著升高(P<0.01)；低劑量組在8 min時(shí)，與配伍組及空白組相比熒光強(qiáng)度降低率有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，而黃藥子配伍甘草組細(xì)胞熒光強(qiáng)度降低率與黃藥子高、中劑量組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，在后期其與黃藥子低劑量組也出現(xiàn)明顯差異，與空白血清組沒有明顯差異。另外，空白血清組的熒光降低率隨著掃描時(shí)間的延長而降低，這一結(jié)果考慮LSCM掃描會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度減弱，與激光掃描導(dǎo)致熒光淬滅有一定的關(guān)系。

通過黃藥子在10 min內(nèi)導(dǎo)致熒光外泄引起細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度減弱的結(jié)果可以推斷，短時(shí)間內(nèi)黃藥子影響細(xì)胞膜通透性，在細(xì)胞膜上形成孔洞，孔洞的大小至少可以通過該熒光分子，說明黃藥子引起肝毒性早期機(jī)制可能與其增加肝細(xì)胞膜通透性、影響細(xì)胞膜的完整性有關(guān)；而配伍組含藥血清對細(xì)胞的熒光強(qiáng)度的影響與空白血清組沒有差別，說明甘草配伍黃藥子后保護(hù)肝細(xì)胞膜的作用與此機(jī)制有關(guān)。

[1] 國家中醫(yī)藥管理局《中華本草》編委會(huì).中華本草：下冊[M].精選本.上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1998：2103-2107.

[2] 《全國中草藥匯編》編寫組.全國中草藥匯編：上冊[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，1996：796-798.

[3] 杜麗霞，羅明媚，劉樹民.黃藥子現(xiàn)代毒理學(xué)研究進(jìn)展[J].遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，9(3)：71-72.

[4] 華碧春，卓實(shí)，史道華.等.甘草減輕黃藥子肝毒性的研究[J].福建中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，23(1)：23-25.

[5] 陳文列，吳錦忠.中西醫(yī)結(jié)合科研實(shí)驗(yàn)方法學(xué)導(dǎo)讀[M].北京：科學(xué)出版社，2011：111.

[6] 管增偉，王盛蘭，李勇，等.凋亡細(xì)胞細(xì)胞膜和線粒體的動(dòng)態(tài)變化[J].衛(wèi)生研究，2000，129(2)：83-86.

[7] 高新起，任秋萍，王轉(zhuǎn)斌.保衛(wèi)細(xì)胞液泡活體標(biāo)記方法的比較[J].細(xì)胞生物學(xué)雜志，2008，30(3)：41-44.

StudyonEffectofSynergyofGlycyrrhizauralensisandDioscoreabulbiferaonLO2CellsMembranePermeability

ZHUO Shi，JIANG Chuan*，HUANG Yufang，PAN Yanlin

(DepartmentofPharmacy，People'sHospitalAffiliatedtoFujianUniversityofTraditionalChineseMedicine，F(xiàn)uzhou350004，China)

Objective：To study the synergic effect ofGlycyrrhizauralensisandDioscoreabulbiferaon LO2 Cells Membrane Permeability.MethodsThe real-time dynamic detection method LSCM was applied to monitor the fluorescence intensity of the LO2 cells staining by fluoesceim diacetate with the laser scanning confocal microscope，then the synergic effect ofD.bulbiferaandG.uralensison LO2 cells membrane permeability was observed by comparing the reduced rate of fluorescence intensity.ResultsWhen scanning was stopped at the tenth minutes，there was a significant difference between the blank group andD.bulbiferagroups in reducing the fluorescence intensity of cells (P<0.05)，while theG.uralensisgroups had no obvious influence on the fluorescence intensity of cells.The changes of fluorescence intensity of cells were recorded by LSCM.ConclusionD.bulbiferacontaining serum has an effect on the hepatocyte membrane permeability in a short time after administration，while its compatibility group ofG.uralensisand the serum group have no significant effects on it.The hepatic injuries caused byD.bulbiferamay be via a coup injury mechanism，but this injury can be weaken by synergy ofG.uralensis.

DioscoreabulbiferaL．；GlycyrrhizauralensisFisch.；membrane permeability

*

江川,副主任中藥師,研究方向：藥事管理；E-mail：jc0591@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.10.009

2017-02-27)