劉大麗 ，馬龍彪 *，郭愛(ài)英 ，楊洪 ，魯振強(qiáng)

（1.黑龍江省高等學(xué)校甜菜遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/黑龍江大學(xué)農(nóng)作物研究院，哈爾濱150080；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北方糖料作物資源與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院甜菜研究所，哈爾濱150080；3.黑龍江省高等學(xué)校生化與分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱150080）

鎘逆境脅迫下甜菜谷胱甘肽合成酶（BvGS）基因的克隆

劉大麗1，2，馬龍彪1，2*，郭愛(ài)英1，2，楊洪1，2，魯振強(qiáng)3

（1.黑龍江省高等學(xué)校甜菜遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/黑龍江大學(xué)農(nóng)作物研究院，哈爾濱150080；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北方糖料作物資源與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院甜菜研究所，哈爾濱150080；3.黑龍江省高等學(xué)校生化與分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱150080）

利用RT-PCR技術(shù)，克隆了甜菜谷胱甘肽合成酶基因（BvGS；LOC104891052），其CDS全長(zhǎng)為1 662 bp，編碼553個(gè)氨基酸。以Beta vulgaris Actin 1為內(nèi)參基因，半定量RT-PCR的研究結(jié)果表明：與 0 mM CdCl2的對(duì)照處理相比，在 0.5、1.0、1.5、2.0 mM CdCl2的逆境脅迫下，甜菜 BvGS基因的表達(dá)量隨著處理濃度的增加而逐漸增大。這說(shuō)明BvGS基因在其轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平上受到了鎘脅迫的誘導(dǎo)，并與鎘逆境存在著一定的應(yīng)答關(guān)系。

甜菜；基因；克?。还入赘孰暮铣擅?；鎘逆境

在生物體內(nèi)的重金屬耐受性作用機(jī)制及調(diào)控規(guī)律中，重金屬逆境響應(yīng)蛋白在植物抵御重金屬離子毒害方面發(fā)揮著重要的作用。在生物細(xì)胞內(nèi)存在著很多游離的、低分子量的巰基。這些巰基主要構(gòu)成成分是谷胱甘肽（Glutathione，GSH）。GSH是一種具有重要生理功能的活性三肽，它可以作為抗氧化劑，維持細(xì)胞氧化還原狀態(tài)[1]；其次，它可以與分子發(fā)生親電結(jié)合反應(yīng)從而使進(jìn)入細(xì)胞的外源異生物脫毒[2]；再次，GSH還可以和重金屬離子絡(luò)合使這些離子更加容易被轉(zhuǎn)運(yùn)到液泡內(nèi)以降低對(duì)細(xì)胞膜的損傷；最后，在植物體內(nèi)，GSH還是合成植物螯合素PC的底物以結(jié)合更多的重金屬離子[1-3]。

因此，如何提高生物體內(nèi)GSH含量成為利用甜菜進(jìn)行重金屬污染生物修復(fù)的關(guān)鍵。谷胱甘肽合成酶（glutathione synthetase，GS，EC6.3.2.3）在這其中發(fā)揮著重要的作用。在真核細(xì)胞中，GSH在細(xì)胞內(nèi)合成是由兩步依賴于ATP的反應(yīng)催化，分別是第一步由谷氨酸（L-glutamate）、半胱氨酸（L-cysteine）在γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶 （γ-glutamylcysteine synthetase，γ-GCS，EC6.3.2.2） 催化下合成 γ-谷氨酰半胱氨酸 （γglutamylcysteine，γ-EC）；第二步在谷胱甘肽合成酶作用下，γ-谷氨酰半胱氨酸（γ-Glutamyl cysteine）和甘氨酸（Glycine）合成谷胱甘肽。GS在這其中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[4-5]。

目前，國(guó)內(nèi)外還沒(méi)有關(guān)于甜菜谷胱甘肽合成酶基因（Beta vulgaris Glutathione Synthetase,BvGS）在重金屬耐受性方面的相關(guān)研究報(bào)道，本研究從該基因的同源序列基因庫(kù)篩選入手，在甜菜體內(nèi)克隆這個(gè)重要的與重金屬的耐受性和抗性相關(guān)的功能基因，研究其在鎘（Cd）逆境下的轉(zhuǎn)錄表達(dá)規(guī)律，從而為揭示甜菜在重金屬污染環(huán)境下的耐受性分子機(jī)制和重金屬離子解毒機(jī)制打下良好的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料及試劑

甜菜94004-2，由國(guó)家甜菜種質(zhì)資源中期庫(kù)（國(guó)家甜菜種質(zhì)資源平臺(tái)）提供。RT-PCR quick Master Mix（TOYOBO）；T4 ligase（Biolabs）；Trans5α 感受態(tài)細(xì)胞（TransGen）；Taq DNA polymerase（TransGen）；限制性內(nèi)切酶（MBI）；pMD 18-T（TaKaRa）；未特殊注明試劑均為進(jìn)口分析純。

1.2 逆境脅迫處理及甜菜總RNA的提取

將兩周大小的甜菜幼苗，分別置于含有0、0.5、1.0、1.5、2.0 mM CdCl2的Hogland營(yíng)養(yǎng)液中，48 h后，分別剪取不同重金屬逆境處理的甜菜幼苗，用液氮速凍，并貯存于-70℃?zhèn)溆谩?/p>

稱取1 g植物幼嫩葉片組織，利用Trizol（Invitrogen）法提取甜菜總RNA。利用紫外分光光度計(jì)，分別在OD260和OD280條件下測(cè)定RNA的含量和純度，并將樣品的濃度稀釋成1 μg/μL備用。取2 μg總RNA，經(jīng)1.0%瓊脂糖電泳，進(jìn)一步確定RNA質(zhì)量。

1.3 BvGS基因的克隆

利用RT-PCR quick Master Mix（TOYOBO）將甜菜RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)甜菜谷胱甘肽合成酶Betavulgaris Glutathione Synthetase（BvGS，LOC104891052）基因的堿基序列，利用Sequencer設(shè)計(jì)引物[Forward primer （5’-3’）：ATG GGA TGT GGA TGC TCC ACT；Reverse primer （5’-3’）：TCA ACT TAG ATA TAA GCT GTC CAA G；Tm=55℃；擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為1 162 bp]。以cDNA為模板PCR擴(kuò)增獲得BvGS基因cDNA的ORF全長(zhǎng)。將pMD 18-T載體及回收的目的基因片段按照摩爾比1∶5進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到Trans5α感受態(tài)細(xì)胞中。提取具有Amp抗性的大腸桿菌重組子的質(zhì)粒DNA，利用KpnI對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行限制性內(nèi)切酶酶切鑒定。所獲得的陽(yáng)性克隆于上海生工進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與Genbank中的序列進(jìn)行比對(duì)以進(jìn)一步確定克隆基因的正確性。

1.4 半定量RT-PCR分析

將定量后的甜菜cDNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物稀釋20倍，取1 μL進(jìn)行PCR擴(kuò)增。其中，內(nèi)參Beta vulgaris Actin 1基因 （BvActin 1，Genbank accession no.DQ866829） 的擴(kuò)增引物分別為：Forward primer （5’-3’）：CCC ACT GAA TCC CAA GGC；Reverse primer （5’-3’）：TTT CCC GTT CGG CTG ATG；Tm=58℃；擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為 399 bp[6]。取20 μL PCR產(chǎn)物，于1.2%的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，并利用GeneSnap進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 重金屬Cd逆境下BvGS基因的表達(dá)特性

谷胱甘肽合成酶 GS（Glutathione Synthetase）是 GSH（Glutathione）合成過(guò)程中的重要酶，它們的表達(dá)量與GSH含量有直接關(guān)系。為了研究甜菜Beta vulgaris Glutathione Synthetase（BvGS，LOC104891052）基因與重金屬Cd逆境脅迫之間的應(yīng)答關(guān)系，評(píng)價(jià)其在重金屬耐受性方面的作用，實(shí)驗(yàn)分別用0、0.5、1.0、1.5、2.0 mM CdCl2重金屬逆境處理兩周大小的甜菜幼苗48 h。如圖1A所示，隨著重金屬Cd逆境濃度的增加，甜菜幼苗的生長(zhǎng)也受到了越來(lái)越嚴(yán)重的影響，在2.0 mM的CdCl2的作用下，甜菜的生長(zhǎng)受到了嚴(yán)重的抑制。

提取甜菜總RNA，并以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，以 Beta vulgaris Actin 1基因（BvActin 1，Genbank accession no.DQ866829）為內(nèi)參基因，進(jìn)行Semi-quantitative RT-PCR比較分析。在未受到重金屬脅迫的甜菜植株中，可以檢測(cè)到少量BvGS基因的表達(dá)。在內(nèi)參基因表達(dá)量基本一致的基礎(chǔ)上，BvGS基因受到了Cd逆境脅迫的誘導(dǎo)，并且隨著逆境脅迫強(qiáng)度的增加，其在轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)量也逐漸增加（圖1B）。這些結(jié)果說(shuō)明甜菜BvGS基因受到了Cd逆境脅迫的誘導(dǎo)，并與其存在著一定的應(yīng)答關(guān)系。

圖 1 Cd2+逆境脅迫下，甜菜BvGS基因在轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)特性Fig.1 Detection ofBvGStranscripts under Cd2+heavy metal stress

圖2 甜菜BvGS基因的RT-PCR擴(kuò)增Fig.2 RT-PCR of BvGS gene

圖3 pMD 18-T-BvGS重組質(zhì)粒鑒定Fig.3 Identification of recombinant plasmid of pMD 18-T-BvGS

2.2 BvGS基因的克隆及序列分析

以甜菜幼嫩植株為材料提取總RNA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，提取的RNA有兩條清晰的28S和18S條帶，其中，28S條帶和18S條帶完整明顯，這表明RNA的質(zhì)量良好（圖2A）。以該RNA為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA第一鏈。利用RT-PCR技術(shù)，以cDNA第一鏈為模板，利用BvGS的CDS兩端的特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得了長(zhǎng)度為1.66 kb左右的基因片段（圖2B）。

回收該基因片段，并將其連接到pMD 18-T載體上。提取大腸桿菌質(zhì)粒DNA，利用限制性內(nèi)切酶KpnI對(duì)重組質(zhì)粒pMD 18-T-BvGS進(jìn)行酶切（圖3）。結(jié)果顯示，通過(guò)酶切，分別在3.2 kb和1.18 kb的位置獲得了兩條片段，由于BvGS基因內(nèi)部1 161 bp的位置上有一個(gè)KpnI酶切位點(diǎn)，并且在pMD 18-T載體的上游也有一個(gè)KpnI酶切位點(diǎn)，因此可以證明BvGS基因被順式插入到pMD 18-T載體上。測(cè)序結(jié)果也進(jìn)一步證實(shí)了所獲得的陽(yáng)性重組質(zhì)粒的正確性。該基因CDS全長(zhǎng)為1 662 bp，編碼553個(gè)氨基酸。

3 討論

從分子生物學(xué)的角度出發(fā)，挖掘和克隆甜菜體內(nèi)重要的與重金屬的耐受性和抗性相關(guān)的功能基因是揭示甜菜在重金屬污染環(huán)境下的耐受分子機(jī)制的一個(gè)關(guān)鍵部分。甜菜基因工程在我國(guó)起步較晚，關(guān)于甜菜體內(nèi)功能基因克隆的研究主要集中在改良甜菜的產(chǎn)量和含糖率方面[7]。本研究從重金屬鎘逆境脅迫出發(fā)，利用RT-PCR技術(shù)結(jié)合生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)分析，在甜菜體內(nèi)克隆獲得了抗性功能基因BvGS的全長(zhǎng)CDS序列。通過(guò)對(duì)正常條件下以及Cd逆境脅迫處理?xiàng)l件下，甜菜幼苗中該基因的差異表達(dá)情況的細(xì)致研究，發(fā)現(xiàn)該基因與重金屬鎘逆境存在著一定的應(yīng)答關(guān)系。實(shí)驗(yàn)的結(jié)果為進(jìn)一步研究甜菜在鎘逆境下的分子調(diào)控機(jī)制及基因表達(dá)規(guī)律奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)也為甜菜生物技術(shù)研究以及植物育種專家提供了有價(jià)值的抗性功能基因資源。

[1]Millar A.H.,Mittova V.,Kiddle G.,et al.Control of ascorbate synthesis by respiration and its implications for stress responses[J].Plant Physiol.,2003,133（2）:443-447.

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[3]Rausch T.,Gromes R.,Liedschulte V.,et al.Novel insight into the regulation of GSH biosynthesis in higher plants[J].Plant Biol.,2007,9（5）:565-572.

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[7]劉大麗，馬龍彪，郝慧.甜菜磷酸蔗糖合成酶的轉(zhuǎn)基因研究[J]，中國(guó)糖料，2013，35（3）：13-14.

Cloning of Beta vulgaris Glutathione Synthetase （BvGS）Gene under Cadmium Stress

LIU Da-li1,2,MA Long-biao1,2*,GUO Ai-ying1,2,YANG Hong1,2,LU Zhen-qiang3
（1.Key Laboratory of Sugarbeet Genetics and Breeding/Crop Academy of Heilongjiang University,Harbin,150080,Heilongjiang;2.Key Laboratory of North Sugar Crop Resource and Utilization,Chinese Academy of Agricultural Sciences/Sugarbeet Research Institute,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Harbin,150080,Heilongjiang;3.Key Laboratory of Biochemistry and Molecular Biology/College of Life Sciences,Heilongjiang University,Harbin 150080,Heilongjiang）

The gene of Beta vulgaris glutathione synthetase （BvGS,LOC104891052）was cloned using RT-PCR.The CDS length of BvGS was 1662 bp,encoding 553 amino acids.By using Beta vulgaris Actin 1 as a control,the results of semi-quantitative RT-PCR showed that the expression level of BvGS was enhanced when the concentration of CdCl2was increased from 0.5,1.0,1.5 to 2.0 mM,compared with the control seedlings without treatment （0 mM CdCl2）.These results exhibited that sugarbeet BvGS gene's transcript was induced by cadmium,and it was responsive to such hazardous heavy metal stress.

sugarbeet（Beta vulgaris）;gene;cloning;glutathione synthetase （GS）;cadmium stress

S566.3

A

1007－2624（2017）06－0023－03

10.13570/j.cnki.scc.2017.06.006

2017-06-15

黑龍江省教育廳資助項(xiàng)目（12541641）。

劉大麗（1981-），女，博士，副研究員，主要從事植物分子生物學(xué)研究。E-mail：daliliu2007@sina.com

馬龍彪（1965-），男，副研究員，碩士生導(dǎo)師，主要從事甜菜生物技術(shù)研究。E-mail：caasmlb@163.com