梁艷瓊 ，黃興 ，吳偉懷 ，2，李銳 ，鄭金龍 ，習(xí)金根 ，賀春萍 *，易克賢 *

（1.中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所/農(nóng)業(yè)部熱帶農(nóng)林有害生物入侵監(jiān)測(cè)與控制重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室/海南省熱帶農(nóng)業(yè)有害生物檢測(cè)監(jiān)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，?？?71101；2.農(nóng)業(yè)部橡膠樹生物學(xué)與遺傳資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地—海南省熱帶作物栽培生理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)部儋州熱帶作物科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站，海南儋州571737）

解淀粉芽孢桿菌TWC2發(fā)酵條件的優(yōu)化

梁艷瓊1，黃興1，吳偉懷1，2，李銳1，鄭金龍1，習(xí)金根1，賀春萍1*，易克賢1*

（1.中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所/農(nóng)業(yè)部熱帶農(nóng)林有害生物入侵監(jiān)測(cè)與控制重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室/海南省熱帶農(nóng)業(yè)有害生物檢測(cè)監(jiān)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，?？?71101；2.農(nóng)業(yè)部橡膠樹生物學(xué)與遺傳資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地—海南省熱帶作物栽培生理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)部儋州熱帶作物科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站，海南儋州571737）

為了提高解淀粉芽孢桿菌Bacillus amyloliquefaciens TWC2菌株活性代謝物質(zhì)的產(chǎn)量，以菌體生物量和發(fā)酵液拮抗甘蔗赤腐病菌（Colletotrichum falcatum Went.）活性為指標(biāo)，采用單因素和正交試驗(yàn)的方法對(duì)TWC2菌株發(fā)酵培養(yǎng)基成分和發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，TWC2菌株最佳發(fā)酵培養(yǎng)基組成為：5 g/L麥芽糖，10 g/L果糖，10 g/L蛋白胨，10 g/L酵母浸出粉，1 g/L CaCl2。最適發(fā)酵條件為：培養(yǎng)溫度34℃，搖床轉(zhuǎn)速200 r/min，發(fā)酵起始pH 6.0～6.5，接種量7%，裝液量40 mL/250 mL，發(fā)酵時(shí)間為48 h。在最佳發(fā)酵培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下，發(fā)酵液抑制甘蔗赤腐病菌的能力較優(yōu)化前提高了39.91%。

解淀粉芽孢桿菌；發(fā)酵條件優(yōu)化；甘蔗赤腐病菌

隨著化學(xué)藥劑的長(zhǎng)期大量使用，病原菌的抗藥性日漸突顯，給環(huán)境安全和人類健康帶來嚴(yán)重危害。因此亟待尋求環(huán)境友好、安全有效的病害防治方法。利用微生物及其代謝產(chǎn)物控制病原菌來防治植物病害日益受到人們的關(guān)注和重視。芽孢桿菌屬（Bacillus spp.）是土壤和植物微生態(tài)的優(yōu)勢(shì)種群，通過分泌抗生物質(zhì)和生長(zhǎng)競(jìng)爭(zhēng)在防治植物病害方面發(fā)揮多種有益作用[1]。解淀粉芽孢桿菌Bacillus amyloliquefaciens是一種與枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis親緣性很高的細(xì)菌，在其自身的生長(zhǎng)過程中可以產(chǎn)生一系列的代謝產(chǎn)物，這些代謝產(chǎn)物使得解淀粉芽孢桿菌具有廣泛地抑制真菌和細(xì)菌的活性作用[2]。目前對(duì)芽孢桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)基及其發(fā)酵條件的研究報(bào)道較多。不同培養(yǎng)基組分及發(fā)酵條件對(duì)微生物的生長(zhǎng)繁殖和抑菌活性物質(zhì)的產(chǎn)生有很大的影響[3]。陳敏等通過比較解淀粉芽孢桿菌SC1150菌株發(fā)酵液對(duì)香蕉枯萎病菌4號(hào)生理小種的抑菌活性，對(duì)解淀粉芽孢桿菌SC1150菌株液體發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化研究，優(yōu)化后SC1150菌株對(duì)香蕉枯萎病菌4號(hào)生理小種的抑菌圈直徑達(dá)到28.33 mm[3]。張榮勝等通過Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)及Box-Behnken設(shè)計(jì)的響應(yīng)曲面法對(duì)影響生防菌株Lx-11發(fā)酵培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化[4]。盧彩鴿等運(yùn)用Minitab軟件，通過Box-Benhnken試驗(yàn)及響應(yīng)面分析相結(jié)合的方法對(duì)解淀粉芽胞桿菌MH71產(chǎn)抗菌物質(zhì)的發(fā)酵培養(yǎng)基配方和搖瓶發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化，在最佳培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下，菌株MH71的活菌數(shù)達(dá)到了2.1×109CFU/mL，芽孢數(shù)為1.2×109CFU/mL，同時(shí)對(duì)番茄灰霉病菌的抑菌能力較優(yōu)化前提高了37.4%[5]。

目前，微生物農(nóng)藥大多是以活菌制劑為主，發(fā)酵工藝不穩(wěn)定和活菌數(shù)不高是研究和生產(chǎn)中常見問題，因此生防菌株的發(fā)酵工藝是決定其能否被開發(fā)為生物農(nóng)藥的關(guān)鍵因子[6]。本實(shí)驗(yàn)室前期從臺(tái)灣草葉片上篩選到1株對(duì)甘蔗赤腐病菌有較強(qiáng)拮抗作用的菌株TWC2，抗菌譜測(cè)定發(fā)現(xiàn)該菌株對(duì)香蕉黑星病菌、橡膠樹炭疽病菌、柱花草炭疽病菌、芒果炭疽病菌、甘蔗環(huán)斑病菌、王草莖點(diǎn)霉葉斑病菌、西瓜枯萎病菌等均有較好的抑制效果，并通過菌落形態(tài)觀察、生理生化特性分析和16S rDNA序列鑒定，確定該菌株為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）。為了進(jìn)一步提高其生防效果、降低發(fā)酵成本、開發(fā)應(yīng)用價(jià)值，本研究以甘蔗赤腐病菌為指示菌，以提高其抗菌活性物質(zhì)產(chǎn)量為目的，優(yōu)化TWC2菌株的發(fā)酵條件，為后期的推廣應(yīng)用、抑菌物質(zhì)的提純和產(chǎn)業(yè)化提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 解淀粉芽孢桿菌（B.amyloliquefaciens）TWC2，從健康臺(tái)灣草植株葉片中分離獲得；甘蔗赤腐病菌SL120-2，由中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所鑒定保存。

1.1.2 培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，酵母浸出粉5 g，NaCl 10 g，蒸餾水1000 mL。

NA培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，葡萄糖2.5 g，牛肉浸膏3 g，pH值7.2～7.4，蒸餾水1000 mL。

BPY 培養(yǎng)基：葡萄糖 5g，蛋白胨 1 g，牛肉膏 5 g，酵母膏 5 g，NaCl 5 g，pH 7.0，蒸餾水 1000 mL。

NYBD培養(yǎng)基：牛肉浸膏8 g，酵母浸膏5 g，葡萄糖10 g，蒸餾水1000 mL。

YPG 培養(yǎng)基：酵母膏 10 g，蛋白胨 20 g，葡萄糖 20 g，pH 7.0，蒸餾水 1000 mL。

基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖 10 g，蛋白胨 10 g，KH2PO40.2 g，MgSO40.2 g，pH 7.0，蒸餾水 1000 mL。

YSP培養(yǎng)基：酵母浸膏 5 g，蔗糖 20 g，蛋白胨 10 g，pH 7.0，蒸餾水 1000 mL。

初始發(fā)酵培養(yǎng)基：牛肉膏3 g，蛋白胨5 g，葡萄糖10 g，蒸餾水1000 mL。

1.2 方法

1.2.1 種子菌液制備 挑取一個(gè)活化的TWC2菌株單菌落于液體種子培養(yǎng)基中，30℃、180 r/min條件下培養(yǎng)12～16 h，此時(shí)菌量約為108CFU/mL，作為種子菌液。

1.2.2 菌株生長(zhǎng)曲線的測(cè)定 將種子液以1%接種量接種于LB培養(yǎng)基，在上述培養(yǎng)條件下，分別于培養(yǎng)后0～36 h取樣，采用紫外可見分光光度計(jì)在600 nm處測(cè)定OD值，以時(shí)間為橫坐標(biāo)、OD值為縱坐標(biāo)，做出在不同培養(yǎng)時(shí)間下菌株菌量變化的生長(zhǎng)曲線。

1.2.3 初始發(fā)酵培養(yǎng)基的篩選 將TWC2種子液接入LB液體培養(yǎng)基中，180 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，按照1%的接種量分別接入以下幾種培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基、NA培養(yǎng)基、BPY培養(yǎng)基、初始發(fā)酵培養(yǎng)基、NYBD培養(yǎng)基、YPG培養(yǎng)基、基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基和YSP培養(yǎng)基中，以O(shè)D600和發(fā)酵液抑菌活性為指標(biāo)，檢測(cè)菌株最適培養(yǎng)基。

1.2.4 發(fā)酵培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分的單因素篩選 選取發(fā)酵后OD600值最高和抑菌活性最強(qiáng)的發(fā)酵培養(yǎng)基作為初始發(fā)酵培養(yǎng)基，進(jìn)行培養(yǎng)基成分優(yōu)化。

最佳碳源：分別以含量為1%（W/V）的木糖、蔗糖、可溶性淀粉、果糖、甘露醇、麥芽糖、乳糖、淀粉、山梨醇9種碳源替換初始發(fā)酵培養(yǎng)基中的葡萄糖，其他成分不變，以葡萄糖和不加碳源為對(duì)照。三角瓶中的裝液量為 100 mL/250 mL，按1%的接種量接種培養(yǎng)種子液，于180 r/min、30℃條件下?lián)u培48 h。每個(gè)處理做3個(gè)重復(fù)。

最佳氮源篩選：分別以含量為1%（W/V）的酵母浸出粉、麩皮、牛肉浸膏、蛋白胨+酵母浸出粉（1∶1）、蛋白胨+酵母浸出粉+氯化銨（2∶2∶1）、蛋白胨+酵母浸出粉+硝酸銨（2∶2∶1）、尿素、氯化銨、硝酸銨 9 種氮源替換初始發(fā)酵培養(yǎng)基中的蛋白胨，以蛋白胨和不加氮源為對(duì)照。其它發(fā)酵條件同上。

無機(jī)鹽的篩選：在基礎(chǔ)培養(yǎng)液中分別添加0.5%的磷酸二氫鉀、硫酸鎂、硫酸錳、硫酸鐵、氯化鈉、氯化鈣、硫酸鋅、不加無機(jī)鹽，其他條件同上，每處理3次重復(fù)。

多因素正交試驗(yàn)：以單因子試驗(yàn)篩選出的最佳碳源、氮源、無機(jī)鹽為變異因素，采用L16（45）正交表進(jìn)行培養(yǎng)基優(yōu)化試驗(yàn)，確定培養(yǎng)基各成分的最佳配比。

1.2.5 菌株發(fā)酵條件的優(yōu)化 以優(yōu)化后的培養(yǎng)基為發(fā)酵培養(yǎng)基，對(duì)TWC2菌株裝液量、接種量、初始pH值、發(fā)酵時(shí)間、轉(zhuǎn)速及溫度等發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。在 250 mL的三角瓶中，分別裝入 20、40、60、80、100、120、140和160 mL發(fā)酵培養(yǎng)液；接種量分別設(shè)為裝液量的1%、3%、5%、7%和9%；將培養(yǎng)基初始pH值分別設(shè)為4.0、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、9.0 和 10.0；發(fā)酵時(shí)間分別調(diào)為 12、24、36、48、60、72、96 和 120 h；轉(zhuǎn)速分別調(diào)為120、160、180、200 和 220 r/min；溫度分別調(diào)為 10、15、20、24、26、28、30、32、34、37 和 40℃。 每處理 3 次重復(fù)，其他發(fā)酵條件同1.2.4。測(cè)定OD600和抑菌活性。

1.3 測(cè)定方法[2，7]

1.3.1 菌體生物量 將菌株TWC2發(fā)酵液用0.85%生理鹽水稀釋5倍，用紫外分光光度計(jì)（波長(zhǎng)600 nm）測(cè)定發(fā)酵液，以0.85%生理鹽水為對(duì)照。以光密度值OD600為標(biāo)準(zhǔn)判斷菌體生物量，OD600值大表示菌體量多，OD600值小表示菌體量少。

1.3.2 發(fā)酵液抑菌活性 采用杯碟法檢測(cè)，刮取在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d的甘蔗赤腐病菌孢子，配制成濃度為107個(gè)孢子/mL的懸浮液。取1 mL該菌懸液加入到99 mL預(yù)冷至50℃左右的PDA培養(yǎng)基中，充分混勻后倒平板。凝結(jié)后均勻放置無菌牛津杯，加入30 μL菌株TWC2上清液。根據(jù)菌落生長(zhǎng)情況，3～5 d測(cè)量抑菌圈的直徑。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用軟件SAS 9.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性和相關(guān)性分析，用Microsoft Excel軟件作圖并進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

圖1 TWC2菌株生長(zhǎng)曲線

2.1 TWC2菌株生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

每隔1 h取TWC2培養(yǎng)液，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其OD600，連續(xù)測(cè)定36 h得出一系列的OD數(shù)值，將這些數(shù)值做成細(xì)菌生長(zhǎng)曲線圖（圖1）。在0～24 h處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，菌體生長(zhǎng)力旺盛，菌體濃度迅速增大，這個(gè)時(shí)期TWC2以幾何級(jí)數(shù)極快增長(zhǎng)，24 h時(shí)OD600最大值為2.335；24～36 h TWC2進(jìn)入穩(wěn)定期，生長(zhǎng)菌群總數(shù)處于平坦階段，OD600值在2.100～2.400之間波動(dòng)?？紤]到菌體濃度和發(fā)酵成本，選取培養(yǎng)24 h的TWC2菌液作為最佳接種時(shí)間的種子液。

2.2 最佳初始發(fā)酵培養(yǎng)基的篩選

對(duì)8種培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，結(jié)果表明基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基效果較好，OD600及抑菌圈直徑高于其他培養(yǎng)基，菌體生物量達(dá)到0.265，抑菌圈直徑為3.249 cm（見圖2），因此選擇基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基為最佳初始發(fā)酵培養(yǎng)基。

圖2 不同培養(yǎng)基對(duì)TWC2菌株發(fā)酵的影響

圖3 不同碳源對(duì)TWC2菌株發(fā)酵的影響

2.3 發(fā)酵培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分的單因素篩選

2.3.1 碳源的篩選 碳源的單因素篩選結(jié)果如圖3所示，當(dāng)碳源為麥芽糖時(shí)，菌株發(fā)酵液菌體生物量最大，為0.812，其后菌量大小依次為葡萄糖＞乳糖＞山梨醇＞木糖＞淀粉＞甘露醇＞果糖＞可溶性淀粉＞蔗糖；從抑菌圈直徑上來看，果糖的抑菌圈直徑為4.373cm，其次分別是葡萄糖＞蔗糖＞可溶性淀粉＞乳糖＞山梨醇＞甘露醇＞木糖＞淀粉。綜合菌體生物量和抑菌圈直徑，選擇麥芽糖和果糖為復(fù)合碳源。

2.3.2 氮源的篩選 氮源篩選試驗(yàn)表明，當(dāng)?shù)礊榈鞍纂?酵母浸出粉（1∶1）時(shí)，TWC2菌株的OD600值和抑菌圈直徑均最高，分別達(dá)到0.433，4.730cm。其次氮源為蛋白胨+酵母浸出粉+氯化銨（2∶2∶1）、麩皮、牛肉浸膏、蛋白胨+酵母浸出粉+硝酸銨（2∶2∶1）、酵母浸出粉和蛋白胨時(shí)，TWC2菌株的OD600值和抑菌圈直徑也較高，但當(dāng)?shù)礊槟蛩?、氯化銨、硝酸銨時(shí)，OD600值和抑菌圈直徑最低，均為0（結(jié)果見圖4）。因此，選用蛋白胨+酵母浸出粉（1∶1）作為優(yōu)化培養(yǎng)基的氮源。

圖4 不同氮源對(duì)TWC2菌株發(fā)酵的影響

圖5 不同無機(jī)鹽對(duì)TWC2菌株發(fā)酵的影響

2.3.3 無機(jī)鹽的篩選 與對(duì)照不添加無機(jī)鹽的培養(yǎng)基相比，當(dāng)添加CaCl2培養(yǎng)基的菌體生物量和抑菌圈直徑均顯著增加，分別為2.224和3.586 cm。當(dāng)無機(jī)鹽為硫酸鎂、硫酸錳、氯化鈉時(shí)，其抑菌圈直徑與對(duì)照相比較，差異不顯著；而OD600值差異顯著，其大小依次為：硫酸錳＞硫酸鎂＞不添加無機(jī)鹽（對(duì)照）＞氯化鈉。當(dāng)無機(jī)鹽為磷酸二氫鉀時(shí)，抑菌圈直徑和OD600值較對(duì)照降低，且差異顯著。添加 FeSO4和ZnSO4的培養(yǎng)基，TWC2菌株不生長(zhǎng)，說明這兩種無機(jī)鹽強(qiáng)烈抑制TWC2的生長(zhǎng)。因此選用CaCl2作為優(yōu)化培養(yǎng)基的最佳無機(jī)鹽。

2.3.4 正交試驗(yàn)優(yōu)化培養(yǎng)基配比 根據(jù)上述碳源、氮源和無機(jī)鹽的篩選結(jié)果，通過正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，選用5因素4水平L16（45）正交表確定各組分的最佳配比，以確定適宜TWC2菌株生長(zhǎng)和產(chǎn)抗菌物質(zhì)的優(yōu)化培養(yǎng)基的最佳組合。通過正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)篩選到的最佳碳源、氮源和無機(jī)鹽進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)合TWC2抑菌活性，最終確定TWC2的最優(yōu)培養(yǎng)基。其組分含量為：0.5%麥芽糖，1%果糖，1%蛋白胨，1% 酵母浸出粉，0.1%CaCl2。

2.4 培養(yǎng)條件的優(yōu)化

2.4.1 初始pH值對(duì)TWC2菌株發(fā)酵的影響 TWC2菌株在pH 5.0～9.0時(shí)均可生長(zhǎng)，其中在pH 6.0～8.0時(shí)菌株生長(zhǎng)量較高，pH 7.0～9.0時(shí)，菌株生長(zhǎng)量略微降低。發(fā)酵液活性方面，在pH值6.0～6.5活性最高。在pH值小于4.0或者大于10.0均不利于菌株的生長(zhǎng)及抑菌物質(zhì)的產(chǎn)生。在pH 6.0～6.5時(shí)菌體生長(zhǎng)量和發(fā)酵液活性均達(dá)到最佳值。因此，發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH值以6.0～6.5為宜（見圖6）。

2.4.2 溫度對(duì)TWC2菌株發(fā)酵的影響 分別在不同溫度下進(jìn)行發(fā)酵，結(jié)果表明該菌株在10～40℃均能生長(zhǎng)，差異顯著，其中在溫度范圍為30～37℃，菌株菌體生長(zhǎng)量較高，在發(fā)酵液活性方面，34℃時(shí)發(fā)酵液顯示出較強(qiáng)的抑菌活性，抑菌圈直徑達(dá)到4.745 cm（見圖7）。綜合上述因素，最佳發(fā)酵溫度為34℃。

圖6 不同初始pH值對(duì)TWC2菌株發(fā)酵的影響

圖7 不同溫度對(duì)TWC2菌株發(fā)酵的影響

2.4.3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)TWC2菌株發(fā)酵的影響 發(fā)酵時(shí)間對(duì)TWC2菌株發(fā)酵試驗(yàn)表明，在培養(yǎng)12～48 h時(shí)，菌體生長(zhǎng)量呈上增的趨勢(shì)；在48～72 h，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，菌體生長(zhǎng)量呈下降趨勢(shì)，在60～96 h，菌體生長(zhǎng)量維持在一個(gè)穩(wěn)定并且較高的水平，在96～120 h，菌體生長(zhǎng)量呈下降趨勢(shì)。在發(fā)酵液活性方面，在12～48 h，隨著時(shí)間的增加，發(fā)酵液活性逐漸增強(qiáng)，并在48 h時(shí)到達(dá)最大值；在48～96 h時(shí)，發(fā)酵液活性降低并維持在一個(gè)水平上，在96～120 h，發(fā)酵液活性降低（見圖8）。綜合以上結(jié)果，48 h為TWC2菌株最佳發(fā)酵時(shí)間。

2.4.4 接種量對(duì)TWC2菌株發(fā)酵的影響 不同接種量對(duì)菌株發(fā)酵影響的試驗(yàn)結(jié)果表明（見圖9），接種量在1%～9%范圍內(nèi)菌株TWC2的發(fā)酵液均具有一定的抑菌活性，且差異不顯著；而菌體生物量隨著接種量增加呈先增加后降低的趨勢(shì)，當(dāng)接種量為7%時(shí)，菌體生物量達(dá)到最大，接種量超過7%后，菌體生物量降低，可能是由于發(fā)酵液中營(yíng)養(yǎng)成分被過度消耗而形成的，因此，選用7%為最佳接種量。

圖8 不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)TWC2菌株發(fā)酵的影響

圖9 不同接種量對(duì)TWC2菌株發(fā)酵的影響

2.4.5 轉(zhuǎn)速對(duì)TWC2菌株發(fā)酵的影響 在轉(zhuǎn)速為120～200 r/min，菌體生物量和發(fā)酵液抑菌活性隨著轉(zhuǎn)速的增加而逐漸增加，并且在轉(zhuǎn)速為200 r/min時(shí)達(dá)到最大值，而轉(zhuǎn)速超過200 r/min時(shí)菌體生物量和活性物質(zhì)均降低。轉(zhuǎn)速較高或者較低都會(huì)影響TWC2菌體生長(zhǎng)和抑菌活性物質(zhì)的產(chǎn)生，可能是TWC2屬于好氧菌，而好氧菌通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速?gòu)亩_(dá)到溶氧的目的，進(jìn)而會(huì)提高抑菌活性物質(zhì)產(chǎn)量；轉(zhuǎn)速太低，不利于菌體生長(zhǎng)；而轉(zhuǎn)速過高時(shí)，會(huì)破壞菌體的結(jié)構(gòu)，進(jìn)而抑制了活性物質(zhì)的產(chǎn)生。因此，選用200 r/min為最佳轉(zhuǎn)速（見圖10）。

2.4.6 裝液量對(duì)TWC2菌株發(fā)酵的影響 對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基裝液量進(jìn)行試驗(yàn)（見圖11），結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)裝液量為40 mL/250 mL時(shí)菌體生物量和抑菌活性物質(zhì)產(chǎn)量最大，而當(dāng)裝液量超過40 mL/250 mL時(shí)，菌體生物量和活性物質(zhì)產(chǎn)量均降低，可能隨著裝液量的增加，發(fā)酵過程中溶氧量不足，不利于菌體生長(zhǎng)，從而影響活性物質(zhì)的產(chǎn)量。因此選用40 mL/250 mL為最佳裝液量。

圖10 不同轉(zhuǎn)速對(duì)TWC2菌株發(fā)酵的影響

圖11 不同裝液量對(duì)TWC2菌株發(fā)酵的影響

2.5 優(yōu)化前后活性比較

優(yōu)化前后試驗(yàn)對(duì)比發(fā)現(xiàn)，基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基菌株發(fā)酵液的抑菌圈直徑為2.23 cm、OD600為0.979，優(yōu)化后分別提高到了3.12 cm，OD600達(dá)到1.422，即抑菌活性和菌體生物量較優(yōu)化前分別提高了39.91%和45.25%。

3 討論

發(fā)酵培養(yǎng)液不僅是生防菌株生長(zhǎng)繁殖所需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的基本條件，而且也是其合成代謝產(chǎn)物的基礎(chǔ)。它既要滿足生防菌株能夠快速生長(zhǎng)繁殖至一定的菌體濃度，又要使菌株迅速合成代謝產(chǎn)物。因此發(fā)酵培養(yǎng)液的組分（碳源、氮源、無機(jī)鹽等營(yíng)養(yǎng)成分）和培養(yǎng)條件（如溫度，培養(yǎng)液的酸堿度，培養(yǎng)時(shí)間，通氣量和接種量等）對(duì)菌株生長(zhǎng)及活性物質(zhì)產(chǎn)生是至關(guān)重要的，這些因素既相互促進(jìn)亦相互制約[8-13]。郭龍濤[6]等采用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，確定內(nèi)生解淀粉芽孢桿菌TB2最佳培養(yǎng)基組分為：玉米淀粉1.0%、豆粉1.0%、（NH4）2SO40.5%、MgSO4·7H2O 0.1%、FeSO4·7H2O 0.03%、K2HPO4·3H2O 0.02%、KH2PO40.01%；培養(yǎng)條件為初始 pH 值為 7.5，溫度35℃，接種量3%，裝液量50 mL/250 mL三角瓶，搖床轉(zhuǎn)速200 r/min，發(fā)酵周期22～26 h。魏嬌洋[14]等發(fā)現(xiàn)內(nèi)生解淀粉芽孢桿菌X-278培養(yǎng)基各組分的最佳配比為：葡萄糖1.5%、花生餅粉2%、硫酸銨0.5%、碳酸鈣0.1%、硫酸鎂0.5%、氯化鈉0.5%；最佳發(fā)酵培養(yǎng)條件為初始pH7.0，培養(yǎng)溫度34℃，轉(zhuǎn)速180 r/min，種齡為24h，裝液量150mL/500 mL三角瓶，接種量2%，發(fā)酵時(shí)間為72h。上述報(bào)道表明了不同來源的同種菌株對(duì)營(yíng)養(yǎng)需求不同，每個(gè)菌株都有其自身獨(dú)特的營(yíng)養(yǎng)需求。因此，對(duì)微生物發(fā)酵培養(yǎng)基組成和發(fā)酵條件的優(yōu)化是獲得最佳生產(chǎn)效率和經(jīng)濟(jì)效益的基礎(chǔ)。

本研究結(jié)果表明，最適該菌株菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)生抑菌物質(zhì)的發(fā)酵培養(yǎng)基配方為：5 g/L麥芽糖，10 g/L果糖，10 g/L蛋白胨，10 g/L酵母浸出粉，1 g/L CaCl2；最適發(fā)酵條件為：培養(yǎng)溫度34℃，搖床轉(zhuǎn)速200 r/min，發(fā)酵初始pH 6.0～6.5，接種量7%，裝液量40 mL/250 mL，發(fā)酵時(shí)間為48 h。在不同培養(yǎng)基組分和培養(yǎng)條件下，TWC2菌株生長(zhǎng)量和產(chǎn)生抑菌物質(zhì)產(chǎn)量的變化不完全一致。在發(fā)酵過程中，TWC2菌株在初始pH 4、pH 11的培養(yǎng)基中無法生長(zhǎng)，在pH 6.0～6.5生長(zhǎng)和抑菌效果均最佳，表明了TWC2菌株適宜在偏酸性的環(huán)境中生長(zhǎng)，過酸過堿均不利其生長(zhǎng)，這與Zhao[15]等、李娟[16]等研究一致。轉(zhuǎn)速、裝液量與菌體生物量、抑菌效果呈相關(guān)性，不同轉(zhuǎn)速、不同的裝液量導(dǎo)致不同溶氧條件，通過提高溶解氧可以加速TWC2的生長(zhǎng)，從而縮短時(shí)間，加快、加大產(chǎn)生抑菌物質(zhì)。

本研究只在搖床條件下對(duì)TWC2菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基組成和發(fā)酵條件進(jìn)行了初步研究，這些參數(shù)有待于在產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)過程中進(jìn)一步驗(yàn)證，從而為該菌株應(yīng)用于甘蔗赤腐病的生物防治提供理論依據(jù)。

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Optimizing Fermentation Condition for Bacillus amyloliquefaciens TWC2

LIANG Yan-qiong1,HUANG xing1,WU Wei-huai1,2,LI Rui1,ZHENG Jin-long1,XI Jin-gen1,HE Chun-ping1*,YI Ke-xian1*
（1.Environment and Plant Protection Institute,CATAS/Key Laboratory for Monitoring and Control of Tropical Agricultural and Forest Invasive Alien Pests,Ministry of Agriculture/Hainan Key Laboratory for Detection and Control of Tropical Agricultural Pests,Haikou 571101,Hainan;2.Opening Project Fund of Key Laboratory of Rubber Biology and Genetic Resource Utilization,Ministry of Agriculture/State Key Laboratory Breeding Base of Cultivation＆Physiology for Tropical Crops/Danzhou Investigation＆Experiment Station of Tropical Crops,Ministry of Agriculture,Danzhou 571737,Hainan）

To investigate the best condition of biomass of fermentation broth of Bacillus amyloliquefaciens strain TWC2 and increase the antagonistic substance productivity against Colletotrichum falcatum,the single factor experiments and orthogonal experiments were adopted to optimize the liquid fermentation medium and fermentation condition.The results showed that the optimum medium was maltose 5 g/L,fructose 10 g/L,peptone 10 g/L,yeast extract 10 g/L and CaCl21 g/L.The optimum fermentation conditions were temperature 34℃,rotation speed 200 r/min,initial pH value 6.0～6.5,inoculation rate 7%,medium capacity 40 mL/250 mL and fermentation for 48 h.Inhibitory activity of strain TWC2 fermentation solution increased 39.91%under the best optimal medium and culture conditions.

Bacillus amyloliquefaciens;fermentation condition optimization;Colletotrichum falcatum

S435.661

A

1007－2624（2017）06－0017－06

10.13570/j.cnki.scc.2017.06.005

2017-06-06

資金項(xiàng)目：國(guó)家天然橡膠產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系病蟲害防控專家崗位項(xiàng)目（CARS-34-GW8）；中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資助項(xiàng)目（2014hzs1J013；2015hzs1J014）；中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所省部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站開放課題（RRI-KLOF201506）。

梁艷瓊（1985-），女，助理研究員，研究方向：植物病理學(xué)。

賀春萍，E-mail：hechunppp@163.com；易克賢，E-mail：yikexian@126.com