沈博文，張 林

（1.長(zhǎng)沙市雅禮中學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410021； 2.中南林業(yè)科技大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410004）

杉木降解預(yù)處理?xiàng)l件的優(yōu)化

沈博文1，張 林2

（1.長(zhǎng)沙市雅禮中學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410021； 2.中南林業(yè)科技大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410004）

為了更好的利用杉木三剩物，從木質(zhì)原料獲得糖類及其他產(chǎn)品，通過(guò)對(duì)杉木屑進(jìn)行稀硫酸預(yù)處理?xiàng)l件的分析，主要考察了稀硫酸濃度、處理溫度、處理時(shí)間對(duì)杉木綜纖維、纖維素、半纖維、木質(zhì)素等成分及酶解糖化效果的影響，發(fā)現(xiàn)稀硫酸對(duì)杉木預(yù)處理，以半纖維素的降解為主，纖維素和木質(zhì)素降解程度不大。確定了的條件為 0.3% 稀硫酸，160 ℃，處理 50 min 是處理效果最佳，還原糖可達(dá) 38 mg/mL，為后續(xù)的杉木降解為單糖并進(jìn)行高效利用提供了支撐基礎(chǔ)。

杉木；預(yù)處理；稀硫酸；糖化

世界文明在不斷發(fā)展的同時(shí)，對(duì)化石資源的需求也越來(lái)越大，而傳統(tǒng)的化石資源的儲(chǔ)備日益減少，尋找可再生的、清潔的資源一直是全世界學(xué)者最為關(guān)注的問(wèn)題。木質(zhì)纖維資源可再生能力強(qiáng)，儲(chǔ)量非常大，如果能將木質(zhì)纖維降解可轉(zhuǎn)化為生物乙醇和丁醇、乳酸等能源或化工產(chǎn)品原料，可以在很大程度上解決化石資源危機(jī)問(wèn)題［1-3］。通過(guò)生物工程和基因工程技術(shù)的改良，纖維素酶的生產(chǎn)技術(shù)［4-8］，乙醇、丁醇、乳酸等發(fā)酵菌種的選育及馴化技術(shù)［9-12］基本趨于成熟。但是木質(zhì)纖維結(jié)構(gòu)比較緊密，纖維素、半纖維素、木質(zhì)素之間的化學(xué)鍵鍵能比較大，并且互相之間還有氫鍵作用，木質(zhì)素作為粘結(jié)劑保護(hù)纖維素和半纖維素，對(duì)生物酶是有一定的阻抗作用，纖維素酶不能很好的和纖維進(jìn)行結(jié)合而使其降解為可發(fā)酵的糖類，從而影響發(fā)酵生產(chǎn)生物乙醇，所以需對(duì)木質(zhì)纖維進(jìn)行預(yù)處理，將木質(zhì)纖維結(jié)構(gòu)打散，提高纖維素酶和纖維的可及度。杉木（Cunninghamia lanceolata（Lamb.）Hook.）是一種氣候適應(yīng)能力強(qiáng)，成材時(shí)間短的人工林優(yōu)勢(shì)樹種，在我國(guó)南方有大面積種植，每年產(chǎn)生的杉木采伐、造材、加工等三剩物的量非常大。本試驗(yàn)嘗試稀硫酸預(yù)處理杉木原料，并進(jìn)行酶解，以酶解液中的還原糖濃度作為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，研究稀硫酸濃度、處理溫度、處理時(shí)間對(duì)杉木預(yù)處理效果的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

杉木屑：切片，粉碎，約 20 目（833μm）。

纖維素酶：由湖南華泰生物有限公司提供，依據(jù) QB 2583-2003 測(cè)得其濾紙酶活為 100 IU/mL。

實(shí)驗(yàn)藥品：所需主要藥品見表 1。

表1 主要實(shí)驗(yàn)藥品列表Tab.1 Chemicals for the experiment

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

簡(jiǎn)易反應(yīng)釜：不銹鋼釜體，聚四氟乙烯釜膽，最高反應(yīng)溫度為 200 ℃，山東省煙臺(tái)科立自控設(shè)備研究所。

1.3 方法

1.3.1 杉木纖維化學(xué)成分分析 杉木原料和杉木稀硫酸降解殘?jiān)?jīng)微型植物粉碎機(jī)粉碎后，取40 ～ 60 目木粉進(jìn)行原料化學(xué)成分分析。纖維素含量的測(cè)定參照硝酸-乙醇法［13］；綜纖維素含量的測(cè)定參照 GB/T 2677.10-1995；Klason 木素含量的測(cè)定參照 GB/T 2677.8-1994；半纖維素的含量為綜纖維素與纖維素含量之差。

1.3.2 還原糖濃度的測(cè)定 還原糖濃度測(cè)定采用3,5-硝基水楊酸法（DNS 法）。

1.3.3 杉木稀硫酸預(yù)處理 在 100 ml 反應(yīng)釜中，按照表 2 要求，加入 10 g 的杉木屑，再加入相應(yīng)濃度的硫酸 60 ml，攪拌均勻。將反應(yīng)釜放入已達(dá)預(yù)定溫度的干燥箱內(nèi)，重新達(dá)到預(yù)定溫度后計(jì)時(shí)，加熱相應(yīng)時(shí)間。取出冷卻，60 ℃ 烘干至絕重，備用。預(yù)處理工藝條件見表 2。

表2 杉木纖維預(yù)處理工藝條件Tab.2 The pretreatment conditions of Chinese fir fiber

1.3.4 預(yù)處理樣品酶解實(shí)驗(yàn) 對(duì)于每一個(gè)條件的任一水平，平行稱取絕干重 3 g 的杉木纖維酸處理渣三組置于 50 ml 搖瓶中，用稀檸檬酸溶液和稀氫氧化鈉溶液準(zhǔn)確調(diào)節(jié)酶解體系 pH 至 4.8，然后將搖瓶置于高溫滅菌鍋滅菌 30 min，防止微生物對(duì)纖維素酶的酶解造成影響，冷卻后加入纖維素酶液，纖維素酶的載入量為 30 IU/g（1 g 杉木預(yù)處理渣加入 30 IU 酶活力的纖維素酶），最終維持酶解體系固液比為 1 : 10，搖瓶封口后置于 50 ℃ 恒溫?fù)u床內(nèi)，在轉(zhuǎn)速 120 r/min 下酶解 48 h 后離心，取上層清液測(cè)酶解液中的還原糖濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 稀硫酸濃度對(duì)預(yù)處理的影響

在溫度為 150 ℃，處理時(shí)間為 60 min 不變情況下，不同稀硫酸濃度處理對(duì)杉木纖維化學(xué)成分的影響見圖 1，由圖可知，稀硫預(yù)處理對(duì)杉木進(jìn)行預(yù)處理，綜纖維素的降解程度不大，纖維素和半纖維素在預(yù)處理過(guò)程中均會(huì)降解，由于半纖維素的降解顯著，所以纖維素的含量升高，濃度低于0.4% 時(shí)，隨著稀硫酸濃度的增大，半纖維素降解程度越來(lái)越大，纖維素含量逐漸升高。綜纖維素的降解，使得木質(zhì)素的含量升高。

圖1 不同稀硫酸濃度對(duì)杉木纖維化學(xué)成分的影響Fig.1Effects of different concentration of dilute sulfuric acid on chemical composition of Chinese fir fiber

不同稀硫酸濃度對(duì)酶解液還原糖濃度的影響見圖 2，當(dāng)稀硫酸濃度低于 0.3% 時(shí)，酶解液還原糖濃度隨著硫酸濃度的增大而增大。而當(dāng)濃度高于 0.3%，酶解液還原糖隨著硫酸濃度的增大而減小，稀硫酸濃度為 0.3% 時(shí)，酶解液還原糖濃度最大為 36.71 mg/mL，酶解效果最好。

圖2 不同稀硫酸濃度對(duì)酶解還原糖濃度的影響Fig.2Effect of different dilute sulfuric acid concentration on the concentration of enzymatic hydrolysis reducing sugar

2.2 處理溫度對(duì)預(yù)處理的影響

在硫酸濃度為 0.3%，處理時(shí)間為 60 min 不變情況下，不同處理溫度對(duì)杉木纖維化學(xué)成分的影響見圖 3，預(yù)處理對(duì)綜纖維素的降解程度不大，纖維素和半纖維素在預(yù)處理過(guò)程中均會(huì)降解，由于半纖維素的降解顯著，所以纖維素的含量升高。隨著處理溫度的逐漸增大，綜纖維素的降解程度增大，纖維素、半纖維素、木質(zhì)素的降解程度都有所增大，為了獲得更高的纖維素和半纖維素收率，為酶解提供原料，應(yīng)盡量在較低溫度下對(duì)杉木進(jìn)行預(yù)處理。

圖3 不同處理溫度對(duì)杉木纖維化學(xué)成分的影響Fig.3Effects of different treatment temperature on the chemical composition of Chinese fir fiber

不同處理溫度對(duì)酶解液還原糖濃度的影響見圖 4，由圖可知，酶解液中的還原糖濃度隨著溫度的升高而增大，從 140 ℃ 到 160 ℃，隨著溫度的升高還原糖濃度增幅比較大，160 ℃ 后還原糖濃度增幅比較小，在 180 ℃ 時(shí)，還原糖濃度達(dá)到最大 38.63 mg/mL，由于溫度越高，會(huì)產(chǎn)生大量的發(fā)酵抑制物，不利于后續(xù)的酶解發(fā)酵生產(chǎn)生物乙醇，在預(yù)處理效果接近時(shí)，應(yīng)盡量選擇較低溫度對(duì)杉木纖維進(jìn)行預(yù)處理。

圖4 不同處理溫度對(duì)酶解還原糖濃度的影響Fig.4Effect of different treatment temperature on the concentration of enzymatic hydrolysis reducing sugar

由不同溫度對(duì)杉木纖維化學(xué)成分的影響和不同溫度對(duì)酶解液中還原糖濃度的影響可知，溫度的升高，預(yù)處理樣品的酶解效果越好，升高溫度會(huì)使得預(yù)處理樣品中綜纖維素收率越低，但且還會(huì)產(chǎn)生大量的發(fā)酵抑制物，從而不利于酶解發(fā)酵，因此溫度 160 ℃ 為最佳。

2.3 處理時(shí)間對(duì)預(yù)處理的影響

在硫酸濃度為 0.3%，溫度為 150 ℃ 不變情況下，不同保溫時(shí)間對(duì)杉木纖維化學(xué)成分的影響見圖 5，杉木綜纖維素的降解程度不大，纖維素和半纖維素在預(yù)處理過(guò)程中均會(huì)降解，由于半纖維素的降解顯著，所以纖維素的含量升高。隨著保溫時(shí)間的逐漸延長(zhǎng)，半纖維素的降解程度越來(lái)越大，纖維素的降解不明顯，說(shuō)明保溫時(shí)間的延長(zhǎng)能促進(jìn)半纖維素的降解，對(duì)纖維素的降解影響不大。在酸性環(huán)境下，高溫高壓處理時(shí)間越長(zhǎng)，木質(zhì)素的未出現(xiàn)明顯的降解。

圖5 不同處理時(shí)間對(duì)杉木纖維化學(xué)成分的影響Fig.5Effects of di fferent treatment time on c hemical composition of Chinese fir fiber

不同保溫時(shí)間對(duì)酶解液中還原糖濃度的影響見圖 6，酶解液中的還原糖濃度隨著保溫時(shí)間的延長(zhǎng)而先增大后減小，從 40 min 到 50 min，酶解液中還原糖濃度從 24.56 mg/mL 增大到最大值 34.81 mg/mL，保溫時(shí)間從 50 min 到 60 min 時(shí)，還原糖濃度減小，再延長(zhǎng)保溫時(shí)間，酶解液中的還原糖濃度變化幅度不大。

圖6 不同處理時(shí)間對(duì)酶解還原糖濃度的影響Fig.6Effect of different treatment time on the concentration of enzyme hydrolysis reducing sugar

由不同保溫時(shí)間對(duì)杉木纖維化學(xué)成分的影響和不同保溫時(shí)間對(duì)酶解液中還原糖濃度的影響可知，保溫時(shí)間的延長(zhǎng)，纖維素和半纖維素的收率降低，木質(zhì)素降解程度增大，在 50 min 時(shí)預(yù)處理效果最好，酶解還原糖濃度最高。

根據(jù)以上單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，稀硫酸濃度、處理溫度、保溫時(shí)間等對(duì)稀硫酸預(yù)處理杉木屑均具有不同程度的影響。其中溫度影響最明顯，其次是處理時(shí)間，硫酸濃度在考察范圍內(nèi)有一定影響，但不明顯。

木質(zhì)纖維原料生產(chǎn)乙醇，主要包括原料預(yù)處理、纖維素酶水解糖化和 C 5/C 6 糖發(fā)酵等工藝［14］。稀酸處理是常見的一種預(yù)處理方法［15］。原料經(jīng)稀酸預(yù)處理和纖維素酶水解后，水解糖液中除糖分外，還存在一些對(duì)微生物的生理特性和發(fā)酵特性有抑制作用的物質(zhì)，包括糠醛、乙酸、單寧等，可通過(guò)萃取、中和、蒸發(fā)、吸附等方式可去除［16］，但成本較高。本試驗(yàn)只是針對(duì)杉木屑預(yù)處理效果進(jìn)行的，如果要綜合考慮能耗，發(fā)酵抑制物的產(chǎn)生和其他操作費(fèi)用等因素，最佳預(yù)處理?xiàng)l件可能須作出適當(dāng)調(diào)整。

3 結(jié)論

（1）通過(guò)對(duì)杉木原料、預(yù)處理后樣品的化學(xué)成分進(jìn)行測(cè)定分析可知，稀硫酸對(duì)杉木纖維進(jìn)行預(yù)處理，半纖維素降解明顯，說(shuō)明稀硫酸預(yù)處理，主要以半纖維素的降解為主，纖維素和木質(zhì)素降解程度不大。

（2）通過(guò)條件優(yōu)化，探討了不同預(yù)處理?xiàng)l件對(duì)預(yù)處理樣酶解液中還原糖濃度的影響，得出每個(gè)預(yù)處理?xiàng)l件各水平對(duì)酶解液中還原糖濃度的影響變化曲線圖，初步確定最佳工藝條件，為后續(xù)的杉木講解為降解單糖，并進(jìn)行高效利用具有一定借鑒作用。

［1］王 聞，莊新姝，袁振宏，等.纖維素燃料乙醇產(chǎn)業(yè)發(fā)展現(xiàn)狀與展望［J］.林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè)，2014，34（4）：144-150.

［2］靳勝英，張禮安，張福琴.纖維質(zhì)原料制乙醇的關(guān)鍵技術(shù)［J］.化學(xué)工業(yè)與工程技術(shù)，2009，30（2）：32-37.

［3］盛曉曉，周如金，唐玉斌.纖維素原料制取燃料乙醇的研究概述［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2012，38（1）：138-142.

［4］楊明明，陳玉林.纖維素酶及纖維素酶多酶復(fù)合體的研究進(jìn)展［J］.家禽生態(tài)學(xué)報(bào)，2013（5）：1-5.

［5］朱順妮，王 聞，亓 偉，等.纖維素酶的研究進(jìn)展［J］.新能源進(jìn)展，2013，1（1）：45-52.

［6］屈海峰，白殿國(guó)，于占春，等.中心組合響應(yīng)面優(yōu)化里氏木霉 B4 菌產(chǎn)纖維素酶培養(yǎng)基組成研究［J］.化工科技，2016（6）：29-33.

［7］涂宗財(cái)，江國(guó)忠，劉益東，等.枯草芽孢桿菌 BS-05 產(chǎn)纖維素酶條件的研究［J］.食品工業(yè)科技，2010（5）：181-183.

［8］孟凡輝，蔣緒愷，劉 琳，等.纖維素酶解速度的可視化表征與限制因素分析［J］.生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，2015，42（3）：201-210.

［9］張 強(qiáng)，冀 偉，王一東.五碳糖和六碳糖共發(fā)酵生產(chǎn)乙醇菌株選育的研究進(jìn)展［J］.化工進(jìn)展，2013，32（1）：151-157.

［10］趙鵬翔.玉米秸稈纖維乙醇聯(lián)產(chǎn)轉(zhuǎn)化過(guò)程及機(jī)理研究［D］.北京：北京林業(yè)大學(xué)，2016.

［11］顧 陽(yáng)，蔣 宇，吳 輝，等.生物丁醇制造技術(shù)現(xiàn)狀和展望［J］.生物工程學(xué)報(bào)，2010，26（7）：914-923.

［12］唐 勇，蘇肇秦，趙丹青，等.木質(zhì)纖維素生物煉制及乳酸制備研究進(jìn)展［J］.綠色科技，2011（1）：169-173.

［13］王林風(fēng)，程遠(yuǎn)超.硝酸乙醇法測(cè)定纖維素含量［J］.化學(xué)研究，2011，22（4）：52-55.

［14］?hgren，K，Vehmaanper? J，Siikaaho M，et al.H igh temperature enzymatic prehydrolysis prior to simultaneous saccharification and fermentation of steam pretreated corn stover for ethanol production.［J］.Enzyme & Microbial Technology，2007，40（4）：607-613.

［15］馬德勇，張愛聯(lián)，高建明，等.稀硫酸預(yù)處理王草的研究［J］.草業(yè)學(xué)報(bào)，2011，20（5）：288-293.

［16］Gong C S，Cao N J，Du J，et al.Ethanol production from renewable resources.［J］.Adv Biochem Eng Biotechnol.1999（65）：207-241.

（文字編校：楊 駿）

Optimization of Chinese fir degradation pretreatment conditions

SHEN Bowen1，ZHANG Lin2
（1.Yali High School，Changsha 410021，China；2.Central South University of Forestry and Technology，Changsha 410004，China）

In order to effectively improve the utilization for the residues of Chinese fir，and get the sugars or other products form lignocellulose.The experiment of dilute sulphuric acid pretreatment condition to the fir chips were analyzed，mainly study on the dilute sulphuric acid density，the processing temperature and the process time effected on degeneration of the

holocellulose，the cellulose，hemicellulose，the lignin equi component and the saccharification results.It was discovered that the dilute sulphuric acid pretreatment to the fir chips，mainly by the hemicellulose degeneration， the cellulose and the lignin degeneration was not obviously.Under the pretreatment technological condition is that 0.3% sulphuric acid，160 ℃，pretreat 50 min，and the best effects of reducing sugar reached is 38 mg/mL.It will provided technical date for Chinese fir

degradation to the monosaccharide and effective utilization.

Chinese fir；pretreatment；dilute sulphuric acid；saccharification

S 781.7

A

1003-5710（2017）02-0060-04

10.3969/j.issn.1003-5710.2017.02.012

2016-12-12

國(guó)家國(guó)際科技合作專項(xiàng)（NO.2015DFA01120）

沈博文（1999-），男，河南省鄲城縣人，高三年級(jí)學(xué)生，研究方向：生物質(zhì)資源利用；E-mail：68759753@qq.com