單 芬 王念晨 王文清 焦培榮 陳 武* 李婉萍 彭仕明

(1.廣州動物園，廣州，510070；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)，廣州，510642)

藍(lán)鷴源H9N2亞型禽流感病毒HA和NA基因序列分析

單 芬1王念晨2王文清2焦培榮2陳 武1*李婉萍1彭仕明1

(1.廣州動物園，廣州，510070；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)，廣州，510642)

為了探查禽流感病毒H9N2在圈養(yǎng)藍(lán)鷴中的流行規(guī)律及變異情況，從圈養(yǎng)藍(lán)鷴(Lophuraswinhoii)分離1株H9N2亞型禽流感病毒，對其HA及NA基因進行PCR擴增并進行序列分析。本分離株的HA基因序列與Genbank中廣西雞源2014年分離株A/chicken/Guangxi/CLB02/2014(H9N2)(KT023046)的核苷酸序列相似性最高，為99%；而NA基因與登錄號為KM455874，2013人源分離株A/Lengshuitan/11197/2013(H9N2)的NA核苷酸序列相似性最高，為97%。HA蛋白序列分析顯示：HA的226位氨基酸殘基為亮氨酸(Leu)，具有哺乳動物SAα2-6受體結(jié)合的特性，裂解位點處的基序PSRSSR↓GL，明顯發(fā)生1個堿性氨基酸的變異。HA蛋白具有9個潛在N-糖基化位點，分別位于29、82、141、218、298、305、313、492、551位；HA受體結(jié)合位點氨基酸變異明顯。NA蛋白序列分析顯示：NA蛋白頸部63～65位氨基酸缺失，具有7個潛在的糖基化位點，分別位于69、86、146、200、234、264、368位；NA蛋白紅細(xì)胞結(jié)合位點、抗原決定簇區(qū)域氨基酸變異活躍。HA、NA基因進化樹分析顯示該分離株屬于歐亞分支中Y280-Like小進化分支，與疫苗株雖屬于同一進化分支中，但親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。藍(lán)鷴源H9N2亞型禽流感病毒(LS/GD/P29/16)HA和NA基因發(fā)生一定程度的變異，需要加強流行病學(xué)監(jiān)測。

禽流感病毒；H9N2亞型；序列分析；進化樹

H9N2亞型禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV)最早于1966年從美國威斯康辛州的一個火雞養(yǎng)殖場中被分離到(A/turkey/Wisconsin/1/1966)，雖然表現(xiàn)低致病性，但由于傳播廣泛、能造成免疫抑制并使宿主容易發(fā)生繼發(fā)感染。自20世紀(jì)90年代以后其傳播越來越廣泛，并在亞洲、中東和北非的許多國家形成地方流行[1-2]。在我國，H9N2亞型AIV從1992年開始在部分省區(qū)局部流行，并首次從人源分離到。1998年以來該亞型AIV已在全國大部分地區(qū)形成地方流行。經(jīng)歷了多年的持續(xù)進化，H9N2亞型AIV的流行特點和生物學(xué)特性均產(chǎn)生了一定的變異。同時H9N2亞型AIV還是H5N1/1997、H7N9/2013、H10N8/2013等感染人的流感病毒的內(nèi)部基因的供體[3-4]，因此，對H9N2亞型AlV 的研究工作絕不容忽視。

藍(lán)鷴(Lophuraswinhoii)又名臺灣藍(lán)腹鷴，羽毛深藍(lán)，白色羽冠，羽毛艷麗，為臺灣特有鳥種，是國家Ⅰ級保護動物，國內(nèi)外未見藍(lán)鷴感染禽流感的正式報道。本研究從1只罰沒死亡的藍(lán)鷴肺臟組織中分離到1株H9N2亞型AIV，并對分離株的HA及NA基因進行序列及進化樹分析，對加強 H9N2 亞型禽流感病毒變異株的監(jiān)測和防控措施研究具有重要的現(xiàn)實意義。

1 材料與方法

1.1 病毒毒株分離鑒定

2015年11月，廣東某執(zhí)法機構(gòu)罰沒1只藍(lán)鷴，這只藍(lán)鷴在救護過程中出現(xiàn)死亡。無菌采集死亡藍(lán)鷴肺臟組織，送華南農(nóng)業(yè)大學(xué)禽病研究室完成病料的處理、病毒的分離與鑒定，獲得禽流感病毒1株，暫命名為禽流感病毒A/Lophura swinhoii/Guangdong/P29/2016(H9N2)，下文簡稱為LS/GD/P29/16 。

1.2 病毒RNA的提取

使用E.Z.N.A Viral RNA Kit 試劑盒(Omega公司產(chǎn)品)提取病毒RNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 cDNA 的制備

取制備的病毒RNA，參照Super-Script III(Invitrogen公司產(chǎn)品)操作說明進行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)體積為20 μl，在42℃反應(yīng)1 h，在70℃熱滅活15 min，隨后在4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 HA及NA基因片段的擴增

對基因片段進行PCR 擴增，每個體系加入2 μl前述制備的cDNA(含有100 ng RNA 的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物)，PCR 反應(yīng)體系為：10×緩沖液5 μl，dNTPs(各2.5 mmol/L)4 μl，PfuUltra II Fusion HS DNA 聚合酶1 μl(Stratagene 公司產(chǎn)品)，上游引物和下游引物各25 pmol(引物由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)禽病實驗室提供，引物序列略)，用滅菌水補足至總體積50 μl。擴增條件：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性30 s，53℃退火30 s，72℃延伸1.5 min，30個循環(huán)，72℃終延伸8 min。HA片段預(yù)期大小為1.7 kb，NA片段預(yù)期大小為1.4 kb。

1.5 基因片段的克隆及序列測定

目的片段的PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳回收后，置于加入10×Taq 緩沖液2 μl，dATP 1 μl，Taq 酶0.5 μl的20 μl 體系內(nèi)，在72℃反應(yīng)60 min，隨后與pGEM-T載體(Promega 公司產(chǎn)品)連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH 5α感受態(tài)細(xì)胞，初步鑒定正確的重組質(zhì)粒由深圳華大基因有限公司測定插入片段的序列，每個片段選擇3個陽性克隆質(zhì)粒測序。

1.6 序列分析

應(yīng)用Lasergene軟件拼接來自LS/GD/P29/16株的HA、NA擴增基因片段的序列，進行核苷酸一致性比較并推導(dǎo)編碼的氨基酸序列，應(yīng)用Clustal W 軟件比對得到的序列，并將拼接好的序列登陸NCBI進行Blast分析，下載相關(guān)H9N2亞型禽流感病毒NA、HA序列，應(yīng)用MEGA 5.1 軟件對各基因進行系統(tǒng)發(fā)生樹的繪制。

2 結(jié)果

2.1 HA及NA基因片段擴增及測序結(jié)果

NA、HA基因片段的測序結(jié)果經(jīng)拼接后，獲得LS/GD/P29/16株HA、NA的基因全長序列，其中HA 基因全長1 742 nt，預(yù)測編碼區(qū)為34 ～1 716 nt，編碼由560個氨基酸組成的多肽；NA基因全長1 467 nt，預(yù)測編碼區(qū)為21～1 430 nt，編碼由469個氨基酸組成的多肽。

2.2 LS/GD/P29/16株NA、HA序列分析

2.2.1 序列Blast分析結(jié)果

將拼接好的LS/GD/P29/16株NA、HA序列分別登陸NCBI進行核苷酸序列Blast分析，結(jié)果顯示：分離株的HA基因序列與登錄號為KT 023046，廣西雞源2014年分離株A/chicken/Guangxi/CLB02/2014(H9N2)的核苷酸序列相似性最高，達(dá)到99%；而NA基因序列則與登錄號為KM 455874，2013年湖南省疾控中心上傳的人源分離株A/Lengshuitan/11197/13(H9N2)的NA核苷酸序列相似性最高，為97%。

2.2.2 LS/GD/P29/16分離株HA、NA關(guān)鍵位點分析

參照文獻[5]分析LS/GD/P29/16分離株的HA裂解位點序列，發(fā)現(xiàn)該毒株在裂解位點處的基序為PSRSSR↓GL，而其他參考序列裂解位點基序較多為PARSSR↓GL，本分離株在裂解位點明顯發(fā)生一個堿性氨基酸A-S的變異。LS/GD/P29/16分離株HA蛋白的226位氨基酸殘基為亮氨酸(Leu)，具有哺乳動物SAα2-6受體結(jié)合的特性，這與參考毒株G 9/97、Y 280/97等代表毒株特征一致。對LS/GD/P29/16分離株HA蛋白的糖基化位點分析，顯示本分離株具有9個潛在N-糖基化位點，分別位于29、82、141、218、298、305、313、492、551位，與其他參考毒株相比，因在315位發(fā)生氨基酸殘基的變異，而增加了313位的潛在糖基化位點，而其他幾個糖基化位點則相對保守。對分離株的HA蛋白受體結(jié)合位點進行分析，發(fā)現(xiàn)HA受體結(jié)合位點109、161、163、202、203位則相對保守，而位點191、198氨基酸變異較為活躍。HA蛋白關(guān)鍵位點氨基酸序列比對情況詳見表1。

對LS/GD/P29/16分離株的NA蛋白進行序列分析，發(fā)現(xiàn)其他參考株相比本分離株在頸部63～65位氨基酸缺失，沒有發(fā)生如G1/97代表毒株的38～39位氨基酸的缺失。NA蛋白潛在糖基化位點分析，發(fā)現(xiàn)本分離株具有7個潛在的糖基化位點，分別位于69、86、146、200、234、264、368位，與其他參考毒株相比因63～65位氨基酸的缺失造成了61位潛在糖基化位點丟失，而在H264N的突變，與其他毒株相比在此位點增加了1個潛在糖基化位點，其他如86、146、200、234等潛在糖基化位點則相對保守。對NA蛋白紅細(xì)胞結(jié)合位點(HB)分析，發(fā)現(xiàn)431～433、366～373、399～404位點均有不同程度的氨基酸變異。其中366～373位氨基酸序列為IKNGSRSG，主要在367～369位發(fā)生明顯變異；399～404氨基酸序列為DSDDWS，主要在400～402位發(fā)生明顯變異；而431～433位點則相對保守均為PQE氨基酸基序。研究發(fā)現(xiàn)NA蛋白含有7個抗原決定簇均位于其頭部區(qū)域，分別位于153、197～199、328～336、339～347、367～370、400～403 和431～434位氨基酸。與參考序列進行氨基酸序列比對，分析發(fā)現(xiàn)分離毒株NA蛋白抗原決定簇中的199、342、368、369、402、434等位置氨基酸殘基變異較為活躍。NA蛋白關(guān)鍵位點氨基酸序列比對情況詳見表2。

表1 HA蛋白關(guān)鍵位點氨基酸序列比較

Tab.1 Comparison of the key amino acid residues in the amino acid sequence of HA protein

表2 NA蛋白關(guān)鍵位點氨基酸序列比對

Tab.2 Comparison of the key amino acid residues in the amino acid sequence of NA protein

2.2.3 HA、NA系統(tǒng)進化樹分析

從NCBI中下載H9N2亞型AIV的HA，NA序列作為參考，進行基因進化樹分析。采用MEGA5.1軟件將本分離株的HA、NA基因與國內(nèi)外部分參考毒株及各個分支的代表毒株進行比對并繪制系統(tǒng)進化樹，結(jié)果見圖1及圖2。由圖1可知，本研究分離株的HA、NA均位于歐亞分支，屬于以Y280/97為代表的Y280亞系中的一個小的進化分支，與其他疫苗株相比在進化關(guān)系距離較遠(yuǎn)。

3 討論

HA糖蛋白是流感病毒主要表面抗原和保護性抗原，HA糖蛋白的抗原特性直接影響病毒的致病性、宿主特異性及組織嗜性。但HA基因變異頻率很高，不同位點，尤其是重要氨基酸位點的變異能導(dǎo)致禽流感病毒的抗原性和致病性變異。HA蛋白潛在的糖基化位點也是影響禽流感病毒抗原性的重要因素，流感病毒可以通過增加糖基化位點的方式來遮蔽抗原表位，從而逃避宿主免疫系統(tǒng)的識別與攻擊，對毒力產(chǎn)生一定影響[6-7]。本分離株具有9個潛在N-糖基化位點，與其他參考毒株相比，因在P315S位發(fā)生氨基酸殘基的變異，而增加了313位的潛在糖基化位點，由于該位點毗鄰受體結(jié)合區(qū)和已知的抗原表位區(qū)，該變化是否影響病毒的相關(guān)生物學(xué)特性還有待進一步研究。對分離株的HA蛋白受體結(jié)合位點氨基酸序列進行分析，發(fā)現(xiàn)H位點191、198位氨基酸變異較為活躍。

在免疫壓力和自然選擇下，H9N2 亞型禽流感有可能發(fā)生遺傳變異而進化出致病力更強的毒株，HA蛋白基因?qū)τ诓《镜闹虏⌒云鹬鴽Q定性的作用，一般高致病力的毒株在裂解位點附近都有連續(xù)4個以上堿性氨基酸(R-E-R-R-R-K-K-R)，而低致病力的毒株在裂解位點處一般只有單個的堿性氨基酸(Arg)，裂解位點處的氨基酸序列和附近糖基化位點的變化決定了致病性的差異[8-10]。本研究毒株在裂解位點處的基序為PSRSSR↓GL，雖然堿性氨基酸的數(shù)目未達(dá)到4個，而其他參考序列裂解位點基序較多為PARSSR↓GL，本分離株在裂解位點明顯發(fā)生1個堿性氨基酸A-S的變異，這也符合文獻中報道的中國大陸2005年以后此類型切割位點氨基酸序列的毒株逐漸增多的特點。

圖1 HA基因進化樹Fig.1 HA gene evolutionary tree 注：本研究毒株用△標(biāo)記；H9N2亞型疫苗株用▲標(biāo)記；歐亞分支亞系內(nèi)代表毒株用●標(biāo)記 Note：The strain in this study was noted by △；H9N2 subtype AIV vaccine strain was noted by ▲；and the representative strains of Eurasian clade were noted by ●

圖2 NA基因進化樹Fig.2 NA gene evolutionary tree 注：本研究毒株用△標(biāo)記；H9N2亞型疫苗株用▲標(biāo)記；歐亞分支亞系內(nèi)代表毒株用●標(biāo)記 Note：The strain in this study was noted by △；H9N2 subtype AIV vaccine strain was noted by ▲；and the representative strains of Eurasian clade were noted by ●

早期的H9N2亞型分離株中HA蛋白的L226與Q226并存，而近年來國內(nèi)的H9N2病毒幾乎均突變?yōu)長226，并且多數(shù)具有與SAα2-6Gal 結(jié)合的能力[11]。此外，有研究證實含L226的H9N2亞型AIV能夠在人的氣管上皮細(xì)胞中進行有效的復(fù)制。本研究的毒株也具有L226的特點，因此，有必要對此類病毒引起大流行的潛力進行評估。

NA蛋白作為AIV病毒粒子表面的一種重要糖蛋白，能幫助成熟的病毒粒子脫離宿主細(xì)胞并感染新的細(xì)胞。NA蛋白還能協(xié)助病毒穿透宿主呼吸道表面黏膜層，具有較高的變異性，易發(fā)生抗原漂移以及產(chǎn)生耐神經(jīng)氨酸酶抑制劑的毒株，同時抗原決定簇的變異可能與抗體選擇有關(guān)。不同亞型AIV之間NA頸部氨基酸序列差異明顯，NA蛋白長度變化影響NA的活性，引起病毒復(fù)制能力的差異[12-13]。研究中Y280-like分支的分離株在頸部63～65缺失3個氨基酸殘基，而G1-like分支的毒株則在38、39位缺失2個氨基酸，本研究分離株也符合Y280-like分支的特點，在63～65位缺失3個氨基酸。

NA蛋白潛在糖基化位點分析，發(fā)現(xiàn)本分離株NA蛋白具有7個潛在的糖基化位點，與其他參考毒株相比因63～65位氨基酸的缺失造成了61位潛在糖基化位點丟失，而在H264N的突變，與其他毒株相比在此位點增加了一個潛在糖基化位點。對NA蛋白紅細(xì)胞結(jié)合位點(HB)分析，與其他參考毒株相比主要在367～369位、400～402位發(fā)生明顯變異，而431～433位點則相對保守均為PQE氨基酸基序。對NA蛋白7個抗原決定簇進行氨基酸序列比對，分析抗原決定簇中的199、342、368、369、402、434等位置氨基酸殘基變異較為活躍，這些糖基化位點、受體結(jié)合位點、抗原決定簇氨基酸的變異究竟是否與毒株的毒力直接相關(guān)還有待進一步的研究證明。

H9N2亞型AIV分為北美系和歐亞系兩大分支，其中歐亞系進一步衍生出G1-like、F/98-like、Y439-like、Y280-like、BJ/94-like等小分支[14]，對本研究分離株的HA和NA進行進化樹分析發(fā)現(xiàn)本分離株屬于歐亞系分支中的Y280-like，這與文獻中報道的大陸近年流行株的進化分支特點一致，但是進化樹分析也發(fā)現(xiàn)，雖然隸屬Y280-like小分支中，但是與目前使用的一些疫苗株相比親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，除了病毒抗原漂移和漂變造成的變異之外，高強度的疫苗免疫壓力，也是越來越多的免疫逃避病毒株出現(xiàn)的重要原因。

世界范圍內(nèi)發(fā)生了多次H9N2亞型AIV突破種間屏障感染人的事件，由于基因組本身的特點增加了自身基因的突變和與其他亞型流感病毒基因重組的機會，極有可能出現(xiàn)可以人際間傳播的重組病毒株。WHO已經(jīng)發(fā)出預(yù)警，認(rèn)為H9N2亞型經(jīng)過抗原漂移和抗原轉(zhuǎn)變，是潛在可能引起全球范圍內(nèi)下一輪新流感爆發(fā)的病原[15]。本研究毒株的NA基因序列與湖南省上傳的人源分離株的NA核苷酸序列一致性高達(dá)97%，隨著病毒的持續(xù)變異與不斷重組，致病力增強的毒株還不定期地出現(xiàn)，因此要加強流行病學(xué)監(jiān)測和平時的預(yù)防接種，建立良好的生物安全體系就顯得尤為重要。

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Sequence Analysis of the Neuraminidase Gene and the Hemagglutinin Gene of H9N2 Subtype Avian Influenza Viruses from Swinhoe’s Pheasant(Lophuraswinhoii)

Shan Fen1Wang Nianchen2Wang Wenqing2Jiao Peirong2Chen Wu1*Li Wanping1Peng Shiming1

(1.Guangzhou Zoo，Guangzhou，510070，China；2.South China Agricultural University，Guangzhou，510642，China)

We studied genetic mutations of the genes for neuraminidase and hemagglutinin and the molecular epidemiology of H9N2 subtype Avian Influenza Virus(AIV)in captive swinhoe’s pheasant(Lophuraswinhoii).H9N2 AIV strain was isolated from captive swinhoe’s pheasant in Guangdong province.The entire NA and HA gene fragments of the strain were amplified by PCR and sequences were analyzed.The similarity of the strain HA gene was 99% compared with H9N2 AIV A/chicken/Guangxi/CLB02/2014(H9N2)(KT023046)which was the most similar sequence in Genbank.The similarity of the strain NA gene was 97% compared with H9N2 AIV A/Lengshuitan/11197/2013(H9N2)(KM455874)which was the most similar sequence in Genbank.The sequence analysis of the strain HA protein showed that the amino residue at site 226 was leucine.It had the characteristics of the mammal SAα2-6 receptor binding，namely one basic amino had obvious variation in the cleavage site motif PSRSSR↓GL.The HA protein contained 9 potential glycosylation sites at sites 29，82，141，218，298，305，313，492，and 551.The amino acids at the HA receptor binding sites varied widely.The sequence analysis of the strain NA protein showed that the NA neck protein lost amino acids at site 63-65，and contained 7 potential glycosylation sites at sites 69，86，146，200，234，264 and 368.It showed，amino acid residues at hemadsorbing sites and antigenic determinants of NA protein varied.The HA and NA phylogeny analysis showed the isolated strain belonging to a small evolutionary branch of Y280-Like in the Eurasian clade which was in the same branch with the AIV vaccine strain but had a distant genetic relationship with it.The HA and NA genes of the H9N2 AIV strain(LS/GD/P29/16)from swinhoe’s pheasant showed some variation and attention should be paid to strengthen epidemiological surveillance.

Avian influenza virus；H9N2 subtype；Sequence analysis；Evolutionary tree

稿件運行過程

2016-11-28

修回日期：2017-01-22

發(fā)表日期：2017-08-10

S852.65 Q7

A

2310-1490(2017)03-441-06

單芬，女，34歲，獸醫(yī)師；主要從事圈養(yǎng)野生動物保育與疾病防控工作。

*通訊作者：陳武，E-mail：guangzhouchenwu@sina.com