田林雙，趙玉婷，戴傳超*

（1.南京師范大學 生命科學學院 江蘇省微生物與功能基因組學重點實驗室 江蘇省微生物資源產(chǎn)業(yè)化工程技術研究中心，江蘇 南京 210023；2.江蘇財經(jīng)職業(yè)技術學院 糧食工程與食品藥品學院，江蘇 淮安 223003）

盾葉薯蕷皂苷水解酶發(fā)酵條件優(yōu)化研究

田林雙1，2，趙玉婷1，戴傳超1*

（1.南京師范大學 生命科學學院 江蘇省微生物與功能基因組學重點實驗室 江蘇省微生物資源產(chǎn)業(yè)化工程技術研究中心，江蘇 南京 210023；2.江蘇財經(jīng)職業(yè)技術學院 糧食工程與食品藥品學院，江蘇 淮安 223003）

從盾葉薯蕷根莖清洗液中，篩選出一株產(chǎn)薯蕷皂苷水解酶菌株Aspergillussp.，對該菌株產(chǎn)酶發(fā)酵條件進行優(yōu)化研究。單因素試驗結(jié)果表明，0.3%葡萄糖為碳源、0.4%蛋白胨為氮源，薯蕷皂苷水解酶活力為0.78 U/mL。正交試驗結(jié)果表明，蛋白胨含量對酶活力的影響較大，產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基最佳配方為0.5%葡萄糖，0.6%蛋白胨，0.2%薯蕷皂苷，0.1%K2HPO4，0.05%MgSO4·7H2O，0.05%KCl，0.001%FeSO4·7H2O。在此最佳培養(yǎng)基配方條件下，薯蕷皂苷水解酶活力為0.96 U/mL。0.2%麥冬、0.2%絞股藍、0.2%薯蕷三種混合皂苷作為誘導物時，薯蕷皂苷水解酶活力最高，達1.26 U/mL。

盾葉薯蕷；薯蕷皂苷水解酶；發(fā)酵條件優(yōu)化

盾葉薯蕷（Dioscorea zingiberensis）又名黃姜、火頭根，是一種常用的中藥材，為我國特有種[1]。盾葉薯蕷根莖中主要藥物活性成分為薯蕷皂苷元，含量達1.1%～16.5%，是所有薯蕷屬植物中皂苷元含量最高的種[2]。

薯蕷皂苷元是目前醫(yī)藥化工合成多種甾體激素和甾體避孕藥主要前體物質(zhì)[3]，有“激素之母”之稱[1，4]。甾體激素具有很強的抗炎、抗過敏、抗病毒、抗休克、抗腫瘤等多種藥理作用，臨床上作為治療風濕病、心血管病、淋巴白血病、細胞性腦炎、皮膚病、惡性腫瘤和搶救危重病人的重要用藥[5-7]。

盾葉薯蕷根莖中薯蕷皂苷元主要以游離型皂苷元和結(jié)合型糖苷兩種形式存在。結(jié)合型糖苷由薯蕷皂苷元（甾體母核）和小分子糖通過糖苷鍵結(jié)合[7]。為了獲得皂苷元，需要打破結(jié)合型糖苷中的糖苷鍵，工業(yè)上常用的方法是酸水解法，但該法使用大量酸[8-9]，且淀粉和纖維素等物質(zhì)未有效綜合利用，導致環(huán)境的污染和資源的浪費[1，10]。

微生物可以轉(zhuǎn)化薯蕷皂苷生成皂苷元。CHENGY等[11]利用里氏木霉（Trichoderma reesei）和煙曲霉（Aspergillus fumigatus）固體發(fā)酵薯蕷粉，提高了薯蕷皂苷元產(chǎn)量。LINL等[12]用哈茨木霉（Trichoderma harzianum）生物轉(zhuǎn)化薯蕷皂苷。微生物轉(zhuǎn)化薯蕷皂苷生成皂苷元的關鍵因素是其可以特異性分泌薯蕷皂苷水解酶，該酶水解皂苷，生成次皂苷或皂苷元[13]。與酸水解法獲得皂苷元相比，皂苷水解酶法具有高效、環(huán)境友好等優(yōu)點，受到廣泛的關注，是薯蕷皂苷元制備研究的發(fā)展方向。目前，國內(nèi)外研究者從多種微生物中分離出薯蕷皂苷水解酶，并對其酶學性質(zhì)進行研究[14-17]，但關于薯蕷皂苷水解酶發(fā)酵生產(chǎn)，鮮有文獻報道。本實驗室前期篩選一株曲霉Aspergillussp.，分泌薯蕷皂苷水解酶，可以將薯蕷皂苷上糖基分步水解，得到次級次皂苷，并最終產(chǎn)生薯蕷皂苷元。本研究采用單因素及正交試驗對該菌株產(chǎn)酶發(fā)酵條件進行優(yōu)化，以期為該菌株皂苷水解酶高效發(fā)酵生產(chǎn)提供研究基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

曲霉（Aspergillussp.）：篩選自盾葉薯蕷根莖清洗液，產(chǎn)薯蕷皂苷水解酶[17]，保藏于南京師范大學微生物與生物技術研究所。

1.1.2 化學試劑

NaNO3、K2HPO4、MgSO4·7H2O、KCl、FeSO4·7H2O、3,5-二硝基水楊酸（dinitrosalicylicacid，DNS）（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；水溶性薯蕷總皂苷：按照文獻[17]的方法，提取自盾葉薯蕷根莖；薯蕷皂苷元標準品（純度＞99.0%）：江蘇省中科院植物研究所制備。

1.1.3 培養(yǎng)基

保藏斜面培養(yǎng)基采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potatodextrose agar，PDA）培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，自然pH。

種子培養(yǎng)基：NaNO32 g/L，K2HPO41 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，KCl 0.5 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g/L，葡萄糖3 g/L，水溶性薯蕷總皂苷2 g/L，自然pH。

產(chǎn)酶基礎培養(yǎng)基：葡萄糖3 g/L，NaNO32 g/L，K2HPO41g/L，MgSO4·7H2O0.5g/L，KCl0.5g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O0.01g/L，水溶性薯蕷總皂苷2 g/L，自然pH。

培養(yǎng)基滅菌條件：121℃高壓蒸氣滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

HVE-50高壓滅菌器：日本HIRAYAMA公司；CA-1390-1垂直層流潔凈工作臺：上海上凈凈化設備有限公司；GNP-9160型隔水式恒溫培養(yǎng)箱：上海精宏實驗設備有限公司；HZQ-311C振蕩器：上海一恒科學儀器有限公司；2802S UV/VIS型分光光度計：尤尼柯（上海）儀器有限公司；DGF30/7-IA型電熱鼓風干燥箱：南京實驗儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 發(fā)酵種子液制備

取一環(huán)活化曲霉Aspergillussp.斜面，接入種子培養(yǎng)基（裝液量100 mL/250 mL錐形瓶），28℃、140 r/min搖瓶培養(yǎng)3 d，作為發(fā)酵種子液。

1.3.2 培養(yǎng)基配方優(yōu)化單因素試驗

準確量取5mL種子液，加入產(chǎn)酶基礎培養(yǎng)基，裝液量為50mL/150 mL，28℃、140 r/min培養(yǎng)6 d。分別考察碳源種類（葡萄糖、淀粉、纖維素鈉、鼠李糖、蔗糖）、葡萄糖添加量（0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、0.9%）、氮源種類（硝酸銨、硝酸鈉、硫酸銨、尿素、蛋白胨、豆粕）、蛋白胨添加量（0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%）、薯蕷皂苷添加量（0.05%、0.1%、0.2%、0.4%、0.8%）對酶活力影響。

1.3.3 培養(yǎng)基配方優(yōu)化正交試驗

在單因素試驗基礎上，以薯蕷皂苷水解酶活力為評價指標，設計L9（33）正交試驗，因素與水平見表1。

表1 培養(yǎng)基配方優(yōu)化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for medium formula optimization

1.3.4 薯蕷皂苷水解酶活力測定方法

液體發(fā)酵培養(yǎng)基經(jīng)濾紙過濾，獲得粗酶液，以薯蕷皂苷為底物，DNS法測定酶水解產(chǎn)物還原糖的量，間接定量酶活力。酶活力測定方法參見文獻[10]。

薯蕷皂苷水解酶活定義：每小時水解薯蕷皂苷產(chǎn)生1 mg還原糖的酶量，定義為一個酶活力單位（U）。

1.3.5 生物量的測定

取一定體積的培養(yǎng)液，用已烘至恒質(zhì)量的定量濾紙過濾，菌體和濾紙一同置于干燥箱中，105℃條件下烘干至恒質(zhì)量，總質(zhì)量與濾紙質(zhì)量之差為菌體干質(zhì)量，計算單位體積培養(yǎng)液的菌體干質(zhì)量。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

所有試驗設計3個重復，實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 曲霉種子生長曲線

圖1 曲霉種子生長曲線Fig.1 Growth curve ofAspergillussp.seed

由圖1可知，在0～1 d，曲霉（Aspergillussp.）菌株處于生長延滯期，在1～3 d，曲霉生物量快速增加，處于對數(shù)生長期，在3～5 d，曲霉菌株處于生長穩(wěn)定期，5 d以后，曲霉菌株開始進入衰老期。因此，選用培養(yǎng)3 d的曲霉種子液進行接種發(fā)酵。

2.2 碳源對水解酶活力影響

碳源是構(gòu)成微生物細胞結(jié)構(gòu)和代謝物中碳架的重要物質(zhì)，也是微生物生長的能量來源。本研究以0.2%NaNO3為氮源，考察添加量均為0.3%的葡萄糖（CK）、淀粉、纖維素鈉、鼠李糖、蔗糖對水解酶酶活的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 不同碳源對水解酶酶活影響Fig.2 Effects of different carbon sources on hydrolase activity

由圖2可知，葡萄糖、纖維素鈉和鼠李糖作為碳源時，有利于曲霉（Aspergillussp.）菌株分泌薯蕷皂苷水解酶，水解酶活力分別為0.517 U/mL、0.500 U/mL和0.483 U/mL。淀粉作為碳源時，不利于該菌株分泌薯蕷皂苷水解酶，水解酶活力為0.181 U/mL。因此，選擇葡萄糖作為產(chǎn)酶培養(yǎng)基最適碳源。

2.3 葡萄糖添加量對水解酶活力影響

以0.2%NaNO3為氮源，考察葡萄糖添加量分別為0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、0.9%時對水解酶酶活的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 葡萄糖添加量對水解酶酶活的影響Fig.3 Effects of glucose addition on hydrolase activity

由圖3可知，以0.5%葡萄糖為碳源時，薯蕷皂苷水解酶活力最高，達0.617 U/mL。當葡萄糖添加量＞0.5%時，酶活力隨著葡萄糖添加量的增大而呈現(xiàn)降低的趨勢，高濃度葡萄糖抑制該菌株分泌薯蕷皂苷水解酶。因此，選擇葡萄糖添加量為0.5%。

2.4 氮源種類對水解酶活力影響

固定0.5%葡萄糖為碳源，選用6種常見無機氮源（硝酸銨、硝酸鈉（CK）、硫酸銨）和有機氮源（尿素、蛋白胨、豆粕）進行產(chǎn)酶試驗，氮源添加量均為0.2%，不同氮源對水解酶酶活的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 不同氮源對水解酶酶活影響Fig.4 Effects of different nitrogenous sources on hydrolase activity

由圖4可知，以硝酸銨為氮源時，有利于該菌株分泌薯蕷皂苷水解酶，酶活為0.612 U/mL。以蛋白胨為氮源時，酶活力最高，達0.651 U/mL。硫酸銨作為氮源，該菌株產(chǎn)薯蕷皂苷水解酶活力最低，為0.216 U/mL。以硝酸鈉、尿素、豆粕作為氮源，酶活力均較低。因此，選擇蛋白胨作為產(chǎn)酶培養(yǎng)基最適氮源。

2.5 蛋白胨添加量對水解酶活力影響

以0.5%葡萄糖為碳源，蛋白胨為氮源，考察蛋白胨添加量分別為0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%時對水解酶酶活的影響，結(jié)果見圖5。

圖5 蛋白胨添加量對水解酶酶活的影響Fig.5 Effects of peptone addition on hydrolase activity

由圖5可知，以0.4%蛋白胨為氮源時，薯蕷皂苷水解酶活力最高，達0.782 U/mL。當?shù)鞍纂颂砑恿浚?.4%時，酶活力隨著蛋白胨添加量的增大而呈現(xiàn)降低的趨勢，可能的原因是該菌株分泌薯蕷皂苷水解酶需要高C/N培養(yǎng)條件，增加蛋白胨添加量，降低了C/N，薯蕷皂苷水解酶活力隨之降低。因此，選擇蛋白胨添加量為0.4%。

2.6 薯蕷皂苷添加量對水解酶活力影響

以0.5%葡萄糖為碳源，0.4%蛋白胨為氮源，考察薯蕷皂苷添加量分別為0.05%、0.1%、0.2%、0.4%、0.8%時對水解酶酶活的影響，結(jié)果見圖6。

圖6 薯蕷皂苷添加量對酶活影響Fig.6 Effects of saponin addition on hydrolase activity

由圖6可知，薯蕷皂苷添加量從0.05%升高至0.1%，薯蕷皂苷水解酶活力有較大幅度提高，從0.623 U/mL提高至0.785 U/mL，當薯蕷皂苷添加量＞0.2%時，皂苷添加量對酶活力影響較小?？赡艿脑蚴钱斒硎氃碥仗砑恿枯^低時，誘導該菌株表達薯蕷皂苷水解酶，當薯蕷皂苷添加量為0.2%時，該菌株表達薯蕷皂苷水解酶達到峰值，當薯蕷皂苷添加量＞0.2%時，并不能誘導該菌株表達更多薯蕷皂苷水解酶。因此，選擇薯蕷皂苷添加量為0.2%。

2.7 正交試驗與方差分析

在單因素試驗基礎上，以薯蕷皂苷水解酶活力為評價指標，設計L9（33）正交試驗，結(jié)果與分析見表2，正交試驗結(jié)果方差分析見表3。

表2 培養(yǎng)基配方優(yōu)化正交試驗結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for medium formula optimization

由表2可知，影響薯蕷皂苷水解酶活力的主次順序為B＞C＞A，即蛋白胨添加量對酶活影響最大，其次是皂苷添加量，影響最小為葡萄糖添加量。最佳組合為A2B3C2，即0.5%葡萄糖，0.6%蛋白胨，0.2%皂苷。驗證試驗結(jié)果表明，最佳組合條件下，酶活力為0.960 U/mL。由表3可知，蛋白胨、皂苷和葡萄糖添加量對結(jié)果影響均不顯著（P＞0.05）。

表3 正交試驗結(jié)果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiments results

2.8 薯蕷皂苷水解酶誘導發(fā)酵

為了研究曲霉Aspergillussp.產(chǎn)皂苷水解酶是組成型酶還是誘導型酶，在正交試驗最佳配方條件下，分別以0.2%麥冬皂苷、0.2%薯蕷皂苷、0.2%絞股藍皂苷及其組合為該菌株產(chǎn)酶誘導物，考察上述誘導物對水解酶活力的影響，結(jié)果見圖7。

圖7 不同誘導物對酶活影響Fig.7 Effects of different inducers on hydrolase activity

由圖7可知，無誘導物時，皂苷水解酶活力為0，生物量也最低，說明該菌株產(chǎn)皂苷水解酶需要底物皂苷或皂苷類似物誘導才能產(chǎn)生，屬于誘導型酶。0.2%麥冬、0.2%絞股藍、0.2%薯蕷三種混合皂苷作為誘導物時，皂苷水解酶酶活力高達1.26U/mL，此條件下，生物量也最大，說明皂苷既可以作為皂苷水解酶誘導物，又可以作為菌株Aspergillussp.的碳源。

3 結(jié)論

曲霉Aspergillussp.產(chǎn)薯蕷皂苷水解酶最佳配方為0.5%葡萄糖，0.6%蛋白胨，0.2%薯蕷皂苷，0.1%K2HPO4，0.05%MgSO4·7H2O，0.05%KCl，0.001%FeSO4·7H2O，此條件下薯蕷皂苷水解酶活力為0.96 U/mL。

曲霉Aspergillussp.產(chǎn)皂苷水解酶需要皂苷或皂苷類似物誘導才能產(chǎn)生，屬于誘導型酶，皂苷兼作為碳源，被菌株利用。麥冬、絞股藍、薯蕷3種混合皂苷作為誘導物時，薯蕷皂苷水解酶活力為1.26 U/mL。

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Optimization of fermentation conditions forDioscorea zingiberensisdioscin hydrolase production

TIAN Linshuang1,2,ZHAO Yuting1,DAI Chuanchao1*
(1.College of Life Sciences,Nanjing Normal University,Jiangsu Key Laboratory for Microbes and Functional Genomics Jiangsu Engineering and Technology Research Center for Industrialization of Microbial Resources,Nanjing 210023,China;2.Department of Food&Pharmaceutical,Jiangsu Polytechnic of Finance&Economics,Huaian 223003,China)

Aspergillussp.with dioscin hydrolase activity was isolated from the rhizosphere ofDioscorea zingiberensis.The optimization of fermentation conditions for the dioscin hydrolase production byAspergillussp.was studied in this paper.Single factor experiments results showed that dioscin hydrolase activity was 0.78 U/ml with glucose 0.3%as carbon source and peptone 0.4%as nitrogen source.The orthogonal experiments results showed that peptone concentration was the primary factor affecting dioscin hydrolase activity.The optimum formula of fermentation medium was glucose 0.5%,peptone 0.6%,dioscin 0.2%,K2HPO40.1% ，MgSO4·7H2O 0.05%,KCl 0.05%,FeSO4·7H2O 0.001%.The strain producing dioscin hydrolase was greatly induced by the mixed dioscin,and the activity reaching 1.26 U/ml.

Dioscorea zingiberensis;dioscin hydrolase;fermentation conditions optimization

Q939.97

0254-5071（2017）10-0092-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.10.020

2017-07-25

南京市科委開放實驗室建設項目（201302015）

田林雙（1982-），男，講師，博士研究生，研究方向為食品微生物。

*通訊作者：戴傳超（1970-），男，教授，博士，研究方向為微生物。