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外源性氧化脅迫對(duì)釀酒酵母突變株Y518合成谷胱甘肽的影響

2017-11-16 13:38:12鄭麗雪王立梅
食品與機(jī)械 2017年9期
關(guān)鍵詞:外源性谷胱甘肽過氧化氫

鄭麗雪 - 齊 斌 孫 姜 王立梅 -

(1. 常熟理工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院,江蘇 常熟 215500;2. 中海海洋無錫海洋工程裝備有限公司,江蘇 無錫 214000) (1. College of Biological and Food Engineering, Changshu Institute of Technology, Changshu, Jiangsu 215500, China; 2. Wuxi Ocean Engineering Equipment Co. Ltd. of Zhonghai Ocean, Wuxi, Jiangsu 214000, China)

外源性氧化脅迫對(duì)釀酒酵母突變株Y518合成谷胱甘肽的影響

鄭麗雪1ZHENGLi-xue1齊 斌1QIBin1孫 姜2SUNJiang2王立梅1WANGLi-mei1

(1. 常熟理工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院,江蘇 常熟 215500;2. 中海海洋無錫海洋工程裝備有限公司,江蘇 無錫 214000) (1.CollegeofBiologicalandFoodEngineering,ChangshuInstituteofTechnology,Changshu,Jiangsu215500,China; 2.WuxiOceanEngineeringEquipmentCo.Ltd.ofZhonghaiOcean,Wuxi,Jiangsu214000,China)

利用外源過氧化氫對(duì)釀酒酵母突變株Y518進(jìn)行氧化脅迫來研究外源性氧化脅迫對(duì)Y518合成谷胱甘肽的影響。結(jié)果表明:添加過氧化氫會(huì)抑制Y518細(xì)胞生長(zhǎng),但會(huì)促進(jìn)其合成谷胱甘肽;當(dāng)過氧化氫的添加時(shí)間為24 h,添加量為0.6 mmol/L時(shí),Y518胞內(nèi)谷胱甘肽含量達(dá)到(13.69±0.28) mg/g,比未添加過氧化氫時(shí)提高了約14%;在24 h時(shí)添加0.6 mmol/L 過氧化氫會(huì)對(duì)Y518產(chǎn)生外源性氧化脅迫,激活轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子YAP1和SKN7調(diào)控γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶和谷胱甘肽合成酶編碼基因GSHI和GSHII的表達(dá),提高γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶和谷胱甘肽合成酶的活力,以促進(jìn)Y518合成谷胱甘肽。因此,添加外源過氧化氫能夠使釀酒酵母突變株Y518產(chǎn)生外源性氧化脅迫,促進(jìn)Y518進(jìn)一步合成谷胱甘肽。

過氧化氫;釀酒酵母;氧化脅迫;谷胱甘肽

谷胱甘肽(glutathione,GSH)是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸3種氨基酸殘基組成的小分子化合物,自然界中的絕大多數(shù)動(dòng)植物和微生物細(xì)胞均能夠合成GSH[1-3]。作為細(xì)胞內(nèi)的一種天然抗氧化活性物質(zhì),GSH能夠直接與氧化性物質(zhì)反應(yīng)或者作為清除自由基的基質(zhì)進(jìn)而抵御由活性氧(reactive oxygen species,ROS)造成的氧化性損傷[4-6],因此GSH常作為天然抗氧化劑被添加到各類食品及其原料中。隨著食品安全意識(shí)的不斷提高,人們對(duì)食品中天然抗氧化劑的應(yīng)用需求越來越強(qiáng)烈,因此國(guó)內(nèi)外對(duì)于GSH的需求量日益增大,這其中存在的巨大商業(yè)價(jià)值推動(dòng)了GSH的生產(chǎn)。

以釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)作為發(fā)酵菌株通過微生物發(fā)酵法生產(chǎn)GSH是目前常用的一種GSH生產(chǎn)方法,相比溶劑萃取法、化學(xué)合成法和酶轉(zhuǎn)化法具有安全、高效、無污染和操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)[7-9]。然而,普通Saccharo-mycescerevisiae菌株的胞內(nèi)GSH含量一般不足細(xì)胞干重的1%[10],因此通過各種物理、化學(xué)或者生物方法對(duì)Saccharomycescerevisiae進(jìn)行處理從而提高其胞內(nèi)GSH積累量已經(jīng)成為研究的熱點(diǎn)[11-13]。

在前期的研究中,本實(shí)驗(yàn)室通過亞硝基胍誘變篩選得到一株高產(chǎn)GSH的Saccharomycescerevisiae突變株Y518[14],并且通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性氧化脅迫能夠促進(jìn)Y518合成GSH[15]。本研究欲在此基礎(chǔ)上,進(jìn)一步通過添加外源過氧化氫對(duì)Y518進(jìn)行氧化脅迫來研究外源性氧化脅迫對(duì)Y518合成GSH的影響,以期能夠?yàn)檫M(jìn)一步提高Y518的谷胱甘肽發(fā)酵產(chǎn)量提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

Saccharomycescerevisiae突變株Y518:本實(shí)驗(yàn)室(蘇州食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)篩選保藏。

1.1.2 試劑

GSH檢測(cè)試劑盒、Cu/Zn超氧化物歧化酶(Cu/Zn-superoxide dismutase,Cu/Zn-SOD)檢測(cè)試劑盒、過氧化氫酶(catalase,CAT)檢測(cè)試劑盒、酵母細(xì)胞裂解液:上海碧云天生物技術(shù)有限公司;

γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-glutamyl systeine synthetase,GSH I)檢測(cè)試劑盒、GSH合成酶(GSH II)檢測(cè)試劑盒:蘇州科銘生物技術(shù)有限公司;

總RNA提取試劑盒、DNA酶試劑盒:德國(guó)Qiagen公司;

cDNA合成試劑盒、熒光染料試劑盒、RNA制膠試劑盒:美國(guó)Bio-Rad公司;

過氧化氫(hydrogen peroxide,H2O2):分析純,生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

Saccharomycescerevisiae培養(yǎng)基[16]:酵母膏5 g/L、葡萄糖20 g/L、磷酸二氫鉀6 g/L、硫酸鉀3 g/L、硫酸銨5 g/L、硫酸鎂1.5 g/L,pH 6.0。

1.2 儀器與設(shè)備

酶標(biāo)儀:iMark型,美國(guó)Bio-Rad公司;

RCR儀:MyCycler型,美國(guó)Bio-Rad公司;

實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀:CFX96 Touch型,美國(guó)Bio-Rad公司;

全自動(dòng)電泳儀:Experion型,美國(guó)Bio-Rad公司;

高通量組織破碎儀:TissueLyser II型,德國(guó)Qiagen公司。

1.3 方法

1.3.1 酵母發(fā)酵培養(yǎng) 用接種環(huán)挑取活化好的突變株Y518單菌落,接種到Saccharomycescerevisiae培養(yǎng)基中,于30 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)18 h,得到種子液;再將種子液以10%(體積分?jǐn)?shù))的接種量接種到Saccharomycescerevisiae培養(yǎng)基中,于相同條件下發(fā)酵培養(yǎng)64 h。

1.3.2 GSH含量和細(xì)胞干重的測(cè)定 取發(fā)酵液于4 ℃、12 000 r/min離心5 min,收集菌體細(xì)胞并用0.85%生理鹽水洗滌2次后按照GSH檢測(cè)試劑盒說明書的要求利用酶標(biāo)儀測(cè)定GSH含量,測(cè)定結(jié)果以mg/g(以細(xì)胞干重計(jì))表示;細(xì)胞干重于105 ℃條件下烘干測(cè)定。

1.3.3 Cu/Zn-SOD、CAT、GSH I和GSH II活力的測(cè)定

Cu/Zn-SOD、CAT、GSH I和GSH II的活力分別按照對(duì)應(yīng)檢測(cè)試劑盒說明書的要求在酶標(biāo)儀上進(jìn)行測(cè)定,測(cè)定結(jié)果以U/mg(以細(xì)胞干重計(jì))表示。

1.3.4 酵母總RNA的提取、純化和完整性檢測(cè) 取發(fā)酵液于4 ℃、12 000 r/min離心5 min,棄去上清液,收集菌體細(xì)胞并用冷的焦碳酸二乙酯(diethy pyrocarbonate,DEPC)水洗滌2次后用液氮猝滅2 min;加入600 μL酵母細(xì)胞裂解液和適量直徑0.45~0.55 mm的玻璃珠,用高通量組織破碎儀于30 Hz震蕩破碎處理5 min;將裂解產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至新的離心管中,于4 ℃、12 000 r/min離心5 min后按照總RNA提取試劑盒和DNA酶試劑盒說明書的要求提取和純化總RNA;根據(jù)RNA制膠試劑盒說明書的操作說明將總RNA樣品注入RNA檢測(cè)芯片內(nèi),利用全自動(dòng)電泳儀對(duì)RNA的完整性進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.5 cDNA的合成和基因相對(duì)表達(dá)量的檢測(cè) 按照cDNA 合成試劑盒說明書的要求利用PCR儀將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 5 min,42 ℃ 30 min,85 ℃ 5 min,保持4 ℃待用;按照熒光染料試劑盒說明書的要求利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀測(cè)定基因的相對(duì)表達(dá)量,擴(kuò)增效率采用cDNA梯度稀釋法計(jì)算,相對(duì)表達(dá)倍數(shù)按照2-△△Ct法計(jì)算,參照基因?yàn)棣?Actin,反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 30 s,95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s,40個(gè)循環(huán)。

2 結(jié)果與分析

2.1 H2O2添加時(shí)間對(duì)GSH發(fā)酵產(chǎn)量的影響

分別在發(fā)酵8,16,24,32 h時(shí)添加0.4 mmol/L H2O2,并測(cè)定發(fā)酵周期64 h內(nèi)Y518的生長(zhǎng)曲線和胞內(nèi)GSH含量,結(jié)果見圖1。未添加H2O2時(shí),Y518 在前16 h快速生長(zhǎng),16~48 h緩慢生長(zhǎng),48 h后逐漸下降;而在不同發(fā)酵時(shí)間添加H2O2后Y518的細(xì)胞干重均呈現(xiàn)出下降的趨勢(shì)[圖1(a)],表明添加H2O2會(huì)抑制Y518的生長(zhǎng),與陳珊等[17]的研究結(jié)果一致,可能是H2O2作為強(qiáng)氧化劑會(huì)對(duì)酵母細(xì)胞產(chǎn)生一定的毒害作用。未添加H2O2時(shí),Y518的胞內(nèi)GSH含量隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增加,在48 h達(dá)到最高[(12.02±0.12) mg/g],隨后開始下降;而在不同發(fā)酵時(shí)間添加H2O2后,Y518的胞內(nèi)GSH含量均呈現(xiàn)出先快速增加后緩慢降低的趨勢(shì)[圖1(b)],相比之下在24 h添加H2O2后Y518的胞內(nèi)GSH含量在40 h達(dá)到最高[(12.98±0. 24) mg/g],表明在24 h添加H2O2較為合適。

2.2 H2O2添加量對(duì)GSH發(fā)酵產(chǎn)量的影響

在發(fā)酵24 h時(shí)分別添加0.2,0.4,0.6,0.8 mmol/L H2O2,并測(cè)定發(fā)酵周期64 h內(nèi)Y518的生長(zhǎng)曲線和胞內(nèi)GSH含量,結(jié)果見圖2。添加不同濃度H2O2后Y518的細(xì)胞干重均呈現(xiàn)出下降的趨勢(shì),添加0.8 mmol/L H2O2后Y518的細(xì)胞干重下降最顯著,細(xì)胞生長(zhǎng)抑制最嚴(yán)重[圖2(a)];而隨著H2O2濃度的增大,Y518的胞內(nèi)GSH含量先呈現(xiàn)出逐漸增加的趨勢(shì),在添加0.6 mmol/L時(shí)達(dá)到最高[(13.69±0.28) mg/g],繼續(xù)增大到0.8 mmol/L后GSH含量反而有所降低[圖2(b)],可能是過大的H2O2濃度對(duì)酵母細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制較嚴(yán)重[圖2(a)],減弱了胞內(nèi)GSH的合成,表明在24 h添加0.6 mmol/L H2O2較為合適。

圖1 Y518在不同H2O2添加時(shí)間下的細(xì)胞干量和胞內(nèi)GSH含量Figure 1 Dry cell weight and intracellular GSH content of Y518 under different addition time of H2O2

圖2 Y518在不同H2O2添加量下的細(xì)胞干量和胞內(nèi)GSH含量Figure 2 Dry cell weight and intracellular GSH content of Y518 under differentaddition amount of H2O2

2.3 抗氧化酶系的活力

Cu/Zn-SOD和CAT是抗氧化酶系中的2種重要的活性酶,能夠在細(xì)胞遭受氧化脅迫時(shí)清除胞內(nèi)過多的ROS,維持細(xì)胞氧化還原環(huán)境的平衡[18-19]。由圖3可知,隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng),未添加H2O2時(shí)Y518的Cu/Zn-SOD和CAT的活力變化趨勢(shì)一致,均呈現(xiàn)出先增加后降低的趨勢(shì);而在24 h添加0.6 mmol/L H2O2后Cu/Zn-SOD和CAT的活力顯著高于未添加H2O2的,表明添加H2O2對(duì)Y518的細(xì)胞產(chǎn)生了氧化脅迫,使Cu/Zn-SOD和CAT活力提高。

2.4 GSH合成酶系的活力

酵母細(xì)胞內(nèi)GSH的合成反應(yīng)是由GSH合成酶系分步催化完成的,首先谷氨酸和半胱氨酸在限速酶GSH I的催化下反應(yīng)生成γ-谷氨酰半胱氨酸,進(jìn)一步在GSH II的催化下γ-谷氨酰半胱氨酸和甘氨酸反應(yīng)生成GSH[20-21]。由圖4可知,隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng),未添加H2O2時(shí)Y518的GSH I和GSH II的活力變化趨勢(shì)一致,均呈現(xiàn)出逐漸降低的趨勢(shì);而在24 h添加0.6 mmol/L H2O2后GSH I和GSH II的活力顯著高于未添加H2O2時(shí)的,表明添加H2O2對(duì)Y518細(xì)胞產(chǎn)生氧化脅迫使GSH I和GSH II活力提高,促進(jìn)了GSH的合成。

2.5 總RNA的質(zhì)量

對(duì)提取的總RNA完整性進(jìn)行鑒定,結(jié)果見圖5。電泳圖上呈現(xiàn)的3條帶分別為28S、18S和5S,條帶清晰可見沒有彌散,表明提取的總RNA完整性好,沒有降解,符合后續(xù)基因相對(duì)表達(dá)量檢測(cè)的質(zhì)量要求。

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)圖3 Y518未添加和添加0.6 mmol/L H2O2的Cu/Zn-SOD和CAT活力Figure 3 Cu/Zn-SOD activity and CAT activity of Y518 added without and with 0.6 mmol/L H2O2

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)圖4 Y518未添加和添加0.6 mmol/L H2O2的GSH I和GSH II活力Figure 4 GSH I activity and GSH II activity of Y518 added without and with 0.6 mmol/L H2O2

圖5 Y518未添加和添加0.6 mmol/L H2O2的 總RNA電泳圖

Figure 5 RNA electrophoretogram of Y518 added without and with 0.6 mmol/L H2O2

2.6 GSH合成酶系基因和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子基因的相對(duì)表達(dá)量

基因GSHI和GSHII分別編碼GSH I和GSH II,其表達(dá)受到轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子YAP1和SKN7的聯(lián)合調(diào)控[22],在存在氧化脅迫的情況下,酵母細(xì)胞會(huì)激活YAP1和SKN7的表達(dá)上調(diào)GSHI和GSHII的表達(dá)量,進(jìn)而增強(qiáng)GSH的合成[23],發(fā)酵32 h時(shí)Y518的GSHI、GSHII、YAP1和SKN7的相對(duì)表達(dá)量測(cè)定結(jié)果見表1。在24 h添加0.6 mmol/L H2O2后Y518的GSHI、GSHII、YAP1和SKN7的相對(duì)表達(dá)量均顯著上調(diào)(上調(diào)倍數(shù)≥2),結(jié)果表明,添加H2O2產(chǎn)生氧化脅迫后激活了轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子YAP1和SKN7調(diào)控GSHI和GSHII的表達(dá),促進(jìn)了Y518合成GSH。

表1 Y518參與GSH合成的差異表達(dá)基因Table 1 Up or down-regulated gene expression of antioxidant activity in Y518 relative to 2-10515

3 結(jié)論

以亞硝基胍誘變篩選出的一株高產(chǎn)GSH的Saccharomycescerevisiae突變株Y518為研究對(duì)象,通過添加外源H2O2研究了外源性氧化脅迫對(duì)Y518合成GSH的影響。研究表明添加H2O2會(huì)抑制Y518的生長(zhǎng),但會(huì)促進(jìn)其合成GSH;H2O2的最佳添加時(shí)間為24 h,最佳添加量為0.6 mmol/L,最佳條件下Y518胞內(nèi)GSH含量達(dá)(13.69±0.28) mg/g,比未添加H2O2時(shí)提高了約14%;在24 h添加0.6 mmol/L H2O2會(huì)對(duì)Y518產(chǎn)生外源性氧化脅迫,激活轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子YAP1和SKN7,調(diào)控GSHI和GSHII的表達(dá),進(jìn)而提高GSH I和GSH II的活力,促進(jìn)Y518進(jìn)一步合成GSH。

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EffectsofexogenousoxidationstressonglutathionesynthesisinSaccharomycescerevisiaemutantY518

Effects of exogenous oxidative stress on glutathione production bySaccharomycescerevisiaemutant Y518 were researched by addition of exogenous hydrogen peroxide. The results showed that the addition of hydrogen peroxide inhibited the growth of Y518 cells, but promoted the synthesis of glutathione of Y518. The best addition time and amount of hydrogen peroxide were respectively 24 h and 0.6 mmol/L. The content of gluconate reached (13.69±0.28) mg/g, increased by about 14% compared to that without hydrogen peroxide. Exogenous oxidation stress on Y518 was produced by adding 0.6 mmol/L hydrogen peroxide at 24 h, which activated the transcription regulation factorYAP1 andSKN7 to control expressions ofγ-glutamylcysteine synthetase, then that of glutathione synthetase encoded genesGSHIandGSHII, and finally enhanced the activities ofγ-glutamylcysteine and glutathione synthetases to promote glutathione synthesis in Y518. Therefore, the addition of exogenous hydrogen peroxide could produce exogenous oxidation stress on Y518 and further promote Y518 to synthesize glutathione.

hydrogen peroxide;Saccharomycescerevisiae; oxidation stress; glutathione

鄭麗雪,女,常熟理工學(xué)院高級(jí)實(shí)驗(yàn)師,碩士。

齊斌(1965—),男,常熟理工學(xué)院研究員,博士。

E-mail:qibin65@126.com

2017—05—12

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.09.004

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