吳威+趙天明+張振+張學俊+李雄

摘要：對白芨中的天然化合物進行酶解法提取，為其開發(fā)利用提供技術參考。以純水、70%乙醇提取為對照，采用酸性蛋白酶、果膠酶、纖維素酶對白芨塊莖進行相繼酶解，并對各提取物中的成分進行HPLC分析。酶解法與水提法、醇提法提取的白芨塊莖中物質種類及含量存在明顯差異。酶解法是比水提法和醇提法更為有效的白芨天然產物提取方法，所得提取的化學成分種類多，提取效率高。

關鍵詞：白芨；天然化合物；酶解；HPLC；化學成分

中圖分類號： R284.2文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2017）17-0175-04

別稱白及，為蘭科白芨屬多年生草本植物[1]，其化學成分主要是聯芐類（bibenzyls）、菲類（phenanthrenes）及其衍生物，如丁香樹脂酚、β-谷甾醇、沒食子酸等。此外，還有少量的揮發(fā)油、黏液質、白芨甘露聚糖（bletilla mannan）以及淀粉、葡萄糖等[2-4]。白芨具有收斂止血、消腫生肌、抗菌消炎、抗氧化、抗腫瘤等多種藥理功效，臨床上廣泛用于治療出血、瘡瘍腫毒、皮膚皸裂、潰瘍、燙灼傷等病，療效顯著[5-10]。另外，白芨中含有豐富的白芨多糖膠，在食品中可作為增稠劑；在化妝品等行業(yè)也有較好的應用[11-13]。

白芨天然產物的傳統提取方法有水提取、有機溶劑提取法等，但有研究表明，純水提取的物質相對有限，高溫操作會引起熱敏性有效成分的大量分解；有機溶劑提取物中殘余溶劑不易除去，且成本相對較高[13]。然而，酶解法有其他傳統方法達不到的優(yōu)點，如反應條件溫和，不破壞目標天然產物的化學結構，保持了其活性和藥效；有效地破壞植物組織和細胞，有利于胞內外大量天然產物的溶出，提取效率高；原料無須粉碎，利于提取液過濾除雜和減少有效成分的損失等。目前尚未見到酶解法提取白芨的研究報道，本研究采用酸性蛋白酶、果膠酶和纖維素酶相繼對白芨塊莖中的天然活性成分進行酶解提取，為中藥白芨的進一步開發(fā)及應用提供技術參考。

1材料與方法

1.1試驗材料

白芨，由貴州省農業(yè)科學院提供；酸性蛋白酶（50 000 U/g）、果膠酶（50 000 U/g）、纖維素酶（50 000 U/g），均購自張家港市金源生物化工有限公司；食品添加劑檸檬酸和檸檬酸鈉，均購自濰坊英軒實業(yè)有限公司；無水乙醇（分析純99.7%），購自天津市富宇精細化工有限公司；99.9%色譜純乙腈，購自美國Tedia公司；色譜純異丙醇，購自天津市科密歐化學試劑有限公司。

1.2儀器

Agilent 1260高效液相色譜儀，購自安捷倫公司；Eclipse Plus C18（3.5 μm，3.0 mm×100 mm），購自安捷倫公司；BSA224S電子分析天平，購自常州萬泰天平儀器有限公司；UH-5300紫外可見分光光度計，購自天美（中國）科學儀器有限公司；SHA-C水浴恒溫振蕩器，購自常州澳華儀器有限公司；RE-2000B旋轉蒸發(fā)器，購自上海越眾儀器設備有限公司；TGL 16M 凱特離心機，購自鹽城市凱特實驗儀器有限公司；SB-120D超聲波清洗機，購自寧波新藝超聲波設備有限公司；DZ-2BCII真空干燥箱，購自天津市泰斯特儀器有限公司。

1.3試驗方法

1.3.1白芨處理取干燥的白芨塊莖，壓成厚度為0.1～02 cm的裂制薄片，干燥環(huán)境遮光保存，待用。

1.3.2蛋白酶提取在4個編號為1、2、3、4的 1 000 mL 三角瓶中分別加入50 g白芨。將2 000 mL pH值為3.2的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液分4次與6 g酸性蛋白酶于500 mL燒杯中混合，4次洗脫后收集的酶解液合并，平均倒入4個三角瓶中，搖勻后置于54 ℃水浴搖床上同時同條件進行振蕩，酶解終止時間分別為2、4、6、12 h。按時分別取出，抽濾后分別在旋轉蒸發(fā)儀（60 ℃）上濃縮至15～20 mL，加入無水乙醇至終體積為50 mL并對應編號，趁熱劇烈振蕩混合充分后靜置過夜，取上清液離心進行高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）檢測分析，醇沉沉淀 45 ℃ 下進行真空干燥，并計算提取率。

1.3.3果膠酶提取待酸性蛋白酶提取完全后分別收集各時段三角瓶中所有白芨殘余固體物繼續(xù)進行果膠酶酶解。將2 000 mL pH值為3.6的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液分4次與6 g果膠酶于500 mL燒杯中混合，4次洗脫后收集的酶解液合并，平均倒入4個三角瓶中與白芨殘余物混勻，置于 50 ℃ 水浴搖床上同時進行振蕩，酶解時間及后續(xù)操作同“1.3.2”節(jié)。

1.3.4纖維素酶提取待果膠酶提取完全后分別收集濾紙上的殘渣與瓶中剩余的白芨合并，繼續(xù)進行纖維素酶提取。將2 000 mL pH值為5.2的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液分4次與6 g纖維素酶于500 mL的燒杯中混勻，4次洗脫后合并酶解液，平均倒入4個三角瓶中，置于50 ℃水浴搖床上同時進行振蕩，酶解時間及后續(xù)操作同“1.3.2”節(jié)。

1.3.5純水對照組于4個編號為1、2、3、4的 1 000 mL 三角瓶中分別加入50 g白芨。將2 000 mL純水平均倒入這4個三角瓶中，搖勻后置于50 ℃水浴搖床上同時同條件進行振蕩，提取時間及后續(xù)操作同“1.3.2”節(jié)。

1.3.6乙醇對照組于4個編號為1、2、3、4的 1 000 mL 三角瓶中分別加入50 g白芨。將2 000 mL 70%乙醇溶液平均倒入這4個三角瓶中，搖勻后置于50 ℃水浴搖床上同時同條件進行振蕩，提取時間及后續(xù)操作同“1.3.2”節(jié)。

1.3.7HPLC測定方法測定樣品為酸性蛋白酶提取物、果膠酶提取物、纖維素酶提取物，以及對照組純水提取物和70%乙醇提取物。樣品經0.45 μm的針頭微孔濾膜注射入進樣瓶中，進樣量為10 μL，色譜柱為等徑3.5 μm的Eclipse Plus C18反相柱，柱長100 mm，柱徑3.0 mm，柱溫40 ℃，梯度淋洗，流動相流速為0.45 mL/min，流動相A溶液為5%乙腈，流動相B溶液為95%乙腈，淋洗梯度：0～5 min，B溶液0 ～10%；5～10 min，B溶液10%～20%；10～30 min，B溶液 20%～30%；30～45 min，B溶液30%～60%；45～55 min，B溶液60%～100%。紫外檢測波長為220 nm。endprint

2結果與分析

2.1提取物的吸光特性

取同時段等量的水提、醇提、酸性蛋白酶、果膠酶、纖維素酶提取液合并混勻，離心取上清液，經稀釋后于190～600 nm 范圍內進行可見紫外吸收掃描。由圖1可知，提取物的最大紫外吸收峰出現在220 nm處，也就是說白芨中在紫外線下有強吸收的物質在該坡長下幾乎都能檢測到。272 nm處也有1個紫外吸收峰，但在該處檢測到的物質種類較少，為了對提取物組分進行較全面的檢測，所以試驗選取220 nm作為HPLC檢測的波長。

2.2提取物的HPLC檢測

在白芨植物組織中存在大量的具有高活性的天然化合物，而這些組織的生命活動是由于植物的各種生物酶的代謝及合成作用體現的，這些酶大多是蛋白質。利用蛋白酶可以降解白芨組織中的酶蛋白使組織內活性物質溶出。而植物很多組織之間的結合都是通過果膠質將它們黏接在一起的，經過蛋白酶的酶解會使這些果膠質充分暴露出來，再用果膠酶降解成為小分子成分，從而有助于細胞間果膠內的天然物質溶解出來，同時還會使植物細胞壁變得更為疏松，便于纖維素酶繼續(xù)酶解。植物細胞壁的主要成分是纖維素及少量的果膠類物質，這些物質的化學結構中含有大量的羥基，具有親水疏油的性質，有機溶劑無法滲入細胞內，纖維素酶可針對性地降解細胞壁和細胞間質中的纖維素、半纖維素等成分，提高細胞膜的通透性，便于胞內的天然物質溶出[14-16]。

由于酶解白芨植物組織是兩相生物化學反應，反應速度比化學反應慢，所以酶解提取天然產物的反應時間是影響生物活性物質提取效果的重要因素。本試驗于不同時間下對白芨天然產物進行提取，并利用搖床進行振蕩以加快反應速度，同時以純水、70%乙醇提取作對照。

2.2.1酸性蛋白酶提取的化學成分由圖2可知，酸性蛋白酶酶解提取的白芨物質種類較多，組成復雜。提取時間對提取的物質種類無影響，但對物質的含量影響較大。a峰物質的含量在提取2～6 h內逐漸增加，但在6 h后卻略微下降；15～20 min溶出的物質含量隨著酶解時間的增加而增大，尤其是b峰物質變化最明顯；c、d峰物質的含量隨著酶解時間的增加均有所下降，尤其是在6 h后下降趨勢更明顯。綜合來看，6 h為酸性蛋白酶酶解提取白芨中天然化合物的最佳時間。另外，酸性蛋白酶對白芨組織的破壞作用常隨著酶解時間的增加而增大，溶出的主要物質含量也增加，但長期的氧氣接觸或酶解作用都可能會引起某些物質的氧化或降解，而這種現象在隨后的果膠酶和纖維素酶酶解過程中均存在。

2.2.2果膠酶提取的化學成分由圖3可知，繼酸性蛋白酶酶解后， 再用果膠酶酶解白芨剩余物時仍有大量的天然產物

溶出，其主要的物質種類和酸性蛋白酶相同，但物質含量卻均有所下降，尤其是e、f、c、d峰物質。此外，果膠酶提取2 h時溶出了酸性蛋白酶提取物中沒有的g峰物質，其含量較大，但隨著提取時間的增加，其含量在逐漸下降，并在隨后的纖維素酶提取物中不再出現，表明g峰物質主要存在黏連細胞的胞間果膠質中，同時也說明繼蛋白酶酶解6 h后再用果膠酶酶解2 h，此時提取的物質種類較多，含量較大。

2.2.3纖維素酶提取的化學成分由圖4可知，經酸性蛋白酶和果膠酶相繼酶解后的剩余白芨固體再經纖維素酶酶解得到的物質成分顯著減少，尤其是在酶解10 min后沒有物質出現。經纖維素酶酶解仍有大量的a峰物質，說明a峰物質在細胞內外均大量存在。胞內的其他物質在纖維素酶提取物中均未得到，可能大多是一些親水性物質，在酸性蛋白酶和果膠酶酶解過程中幾乎均已水解溶出，再用纖維素酶酶解時，溶出的物質就極少。在纖維素酶酶解提取物中沒有出現g峰物質，進一步說明g峰物質主要存在于黏連細胞的胞間果膠中。另外，隨著提取時間的增加，a峰的峰面積明顯下降，因此，經酸性蛋白酶和果膠酶相繼酶解后，再用纖維素酶酶解提取白芨天然化合物的最佳時間為2 h。

2.2.4純水提取的化學成分由圖5可知，純水提取的白芨化學成分種類較多，在13～22 min集中出峰明顯且含量較大。在22 min后溶出的物質種類較少，含量也極低，可能主要是一些極性較小的親脂性成分。提取時間對提取物質的種類無影響，但對物質的含量影響較大，表現為隨著提取時間的增加，提取的物質含量也在增加，尤其是a峰和b峰。

2.2.570%乙醇提取的化學成分乙醇是提取中藥有效成分常用的有機溶劑之一，常用于提取極性較小的化合物。采用適宜濃度的乙醇能提取親脂性化合物和親水性物質。

由圖6可知，70%乙醇提取的白芨物質種類比純水提取的物質種類豐富。在4～22 min內出現的物質種類和純水提取的基本一致，但在22～50 min內出現的物質種類比水提取的豐富，含量也比水提取的大。表明在4～22 min內出現的物質主要以親水性物質為主，22～50 min內溶出的除了純水提取的物質外，還多了一些脂溶性物質。另外，提取時間為2、4、6、12 h時，提取的物質種類是相同的，但隨著提取時間的增加，j、k等峰面積在6 h后下降明顯，說明6 h為70%乙醇提取白芨天然產物的最佳時間。

2.2.6酶提與水提、醇提提取的化學成分比較由圖7可知，從提取的物質種類上看，h、i峰物質主要存在于酸性蛋白酶、果膠酶和纖維素酶提取物中，而在水提和醇提提取物中沒有出現；c、d峰物質主要存在于酸性蛋白酶和果膠酶提取物中，在纖維素酶、水提、醇提提取物中沒有出現；g峰物質是酸性蛋白酶、纖維素酶、水提、醇提提取均得不到的，而在果膠酶提取物中卻大量存在，說明g峰主要存在于黏連細胞的胞間果膠中，只有通過果膠酶對胞間質的破壞才能使該物質溶出；另外，醇提取與水提取、酶提取相比較，在集中出峰的13～22 min 內溶出的物質種類大致是相同的，而在22～50 min內溶出的物質種類差異較大，醇提提取物中溶出的j、k等2種峰物質在水提和酶解提取物中沒有出現，也就是說醇提取物中除了包含水提取的物質外，還提取出了一些脂溶性物質。綜合看來，酶解提取物中h、i、c、d、g峰物質是水提和醇提均無法得到的。endprint

從提取的物質含量上看，a、e、m、f等4種峰物質在酶解、水提和醇提提取物中均大量存在，但物質含量卻存在較大的差異。酸性蛋白酶提取6 h時，a峰的峰面積為純水提取12 h的1.75倍，為醇提取6 h的2.7倍；e峰的峰面積為純水提取12 h的1.5倍，為醇提取6 h的0.9倍；m峰的峰面積為純水提取12 h的0.5倍，為醇提取6 h的0.5倍；f峰的峰面積為純水提取12 h的0.9倍，為醇提取6 h的0.8倍。綜合分析可知，利用酶法提取白芨天然化合物比水提取和70%乙醇提取更有效，提取的物質種類較多，提取效率高。

2.2.7酶解與水提法提取率的比較白芨塊莖中含有大量的親水性活性成分如白芨多糖膠等，采用水提-醇沉法可以大量獲得，但往往含有蛋白質、淀粉等諸多雜質。而采用全酶法提取時，蛋白酶可以除去大量的蛋白質，低溫可避免淀粉的糊化溶出。圖8為不同時間下酶提（酸性蛋白酶、果膠酶、纖維素酶相繼提?。┖退?次后得到的醇沉干燥物提取量的比較，由圖8可知，提取時間對物質的提取率影響較大，2種提取方法提取的物質量均在6 h時達到最大，6 h后逐漸下降；從提取效率上看，同等條件下酶解法的優(yōu)勢更明顯，其提取率是純水提取的3～5倍。

3結論

中藥所含的化學成分十分復雜，既含有多種有效成分，又有無效成分，有些還包含有毒成分，提取其有效成分并進一步加以分離、純化，得到有效單體是中藥研究領域中的一項重要內容。好的提取方法能最大限度地提取其中的有效成分，提高中藥制劑的內在質量和臨床治療效果，使中藥的藥效得以最大限度地發(fā)揮。本研究通過HPLC對酶提取、純水提取、70%乙醇提取的白芨塊莖中化學成分進行檢測分析，結果表明，酶法提取物中的化學成分種類比純水提取和醇提取豐富，且水溶性物質提取率較高，但對提取物中的化學成分鑒定還在進一步的研究中。另外，雖然酶解法對提取白芨中的天然化學成分有著較大的優(yōu)勢，但為發(fā)揮酶提取技術的最大優(yōu)勢，除了嚴格控制酶反應時間外，還須綜合考慮酶解溫度、pH值、底物的濃度、抵制劑和激動劑等酶反應條件對白芨提取效果的影響。

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