鴻英1，+朱亞露1，+揭畢志香+趙陽(yáng)+何家惠+于漾+侯繼波

摘要：為完善現(xiàn)有雞傳染性法氏囊病病毒（infectious bursal disease virus，簡(jiǎn)稱(chēng)IBDV）滅活疫苗生產(chǎn)工藝，形成適用于批量生產(chǎn)的抗原制備技術(shù)流程，對(duì)IBDV NJ09株病毒在DF-1細(xì)胞上的增殖工藝進(jìn)行研究。通過(guò)培養(yǎng)基篩選、血清最適濃度比較、接毒量測(cè)定等相關(guān)試驗(yàn)，明確了規(guī)?；a(chǎn)工藝，即將DF-1細(xì)胞以1 ∶3、1 ∶4比例分瓶（0.85×105～1.2×105個(gè)/mL）傳代培養(yǎng)，細(xì)胞生長(zhǎng)36～48 h后按體積分?jǐn)?shù)0.1%～0.2%接種IBDV NJ09株毒種，接毒后 36～48 h收毒；同時(shí)篩選出適宜IBDV NJ09株病毒增殖的MD611培養(yǎng)基及小牛血清，既可以滿(mǎn)足高滴度抗原增殖的生長(zhǎng)需要，又降低了疫苗生產(chǎn)成本，形成了適用于規(guī)?；a(chǎn)的抗原接種、收獲、處理工藝技術(shù)指標(biāo)，按上述工藝所增殖的IBDV NJ09株抗原病毒含量穩(wěn)定在108.0 TCID50/mL以上，可滿(mǎn)足含IBDV組分的系列滅活疫苗生產(chǎn)需要，為該病毒滅活疫苗大規(guī)模生產(chǎn)提供了技術(shù)支持。

關(guān)鍵詞：雞傳染性法氏囊病毒；NJ09株；DF-1細(xì)胞；生產(chǎn)工藝

中圖分類(lèi)號(hào)： S858.315.3文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2017）17-0152-03

收稿日期：2017-02-24

基金項(xiàng)目：公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專(zhuān)項(xiàng)（編號(hào)：201303046）。

作者簡(jiǎn)介：揭鴻英（1978—），女，福建三明人，碩士，助理研究員，主要從事獸用生物制品研究。E-mail：hongying6090@163.com。

通信作者：于漾，碩士，助理研究員，主要從事獸用生物制品研究。Tel：（025）84392058；E-mail：yangyu1719223@163.com。DF-1細(xì)胞是一種可以持續(xù)傳代的雞胚成纖維細(xì)胞系，由美國(guó)明尼蘇達(dá)大學(xué)的Himly等于1998年用10日齡EV-0雞胚胎制備而成[1]。與傳統(tǒng)的雞成纖維（chicken embryo fibroblast，簡(jiǎn)稱(chēng)CEF）細(xì)胞相比，該細(xì)胞系在產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)中有著明顯的優(yōu)勢(shì)，目前已廣泛應(yīng)用于禽類(lèi)病毒的增殖研究及疫苗的規(guī)模化生產(chǎn)中[2-3]，其中在雞傳染性法氏囊病病毒（infectious bursal disease virus，簡(jiǎn)稱(chēng)IBDV）的增殖研究上也有相關(guān)報(bào)道[4-9]。IBDV是雞傳染性法氏囊?。╥nfectious bursal disease）的致病病原，雞感染該病毒不僅會(huì)引起雛雞發(fā)病死亡，更重要的是會(huì)破壞雛雞法氏囊組織，導(dǎo)致免疫抑制，誘發(fā)機(jī)體對(duì)其他病原的敏感性，威脅禽養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展[10-13]。在IBDV的疫苗研究中，近年來(lái)也有利用傳代細(xì)胞培養(yǎng)病毒的報(bào)道，但由于IBDV包含多個(gè)株系，受毒源株系差別、培養(yǎng)體系等因素的影響，IBDV在DF-1等傳代細(xì)胞上的增殖條件也各不相同[14-18]。為提高IBDV NJ09株在DF-1細(xì)胞上增殖的病毒含量，同時(shí)考慮大規(guī)模培養(yǎng)的生產(chǎn)成本，筆者所在實(shí)驗(yàn)室對(duì)IBDV NJ09株細(xì)胞適應(yīng)毒在DF-1細(xì)胞上的增殖進(jìn)行不同條件的篩選，擬確定IBDV NJ09株在DF-1細(xì)胞上的最佳生產(chǎn)工藝。

1材料與方法

1.1材料

25 cm2細(xì)胞瓶、細(xì)胞計(jì)數(shù)板、96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，均購(gòu)自美國(guó)Corning Coster公司；DMEM培養(yǎng)基、DMEM/F12培養(yǎng)基、胰蛋白酶、小牛血清、胎牛血清，均購(gòu)自GIBCO公司；MD611培養(yǎng)基，購(gòu)自北京清大天一科技有限公司；DF-1細(xì)胞，從美國(guó)ATCC公司購(gòu)入，由國(guó)家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心傳代、建庫(kù)和保存；雞傳染性法氏囊病毒NJ09株細(xì)胞適應(yīng)毒F3代，病毒含量為108.0 TCID50/mL（TCID50表示半數(shù)組織感染量），由筆者所在實(shí)驗(yàn)室培育和保存。

1.2DF-1細(xì)胞傳代比例篩選

選擇細(xì)胞生長(zhǎng)良好、致密度為95%以上的25 cm2細(xì)胞瓶，棄去培養(yǎng)液，用0.01 mol/L磷酸緩沖鹽溶液（PBS）輕輕蕩洗2次，加入0.1%胰酶-乙二胺四乙酸（EDTA）液2 mL進(jìn)行消化。當(dāng)細(xì)胞面呈毛玻璃狀，棄去消化液，利用瓶?jī)?nèi)殘留的0.5 mL消化液繼續(xù)消化，當(dāng)細(xì)胞面出現(xiàn)松散脫落時(shí)，加入不同比例含5%小牛血清的MD611培養(yǎng)液輕輕吹打，懸浮細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，使細(xì)胞生長(zhǎng)液中DF-1細(xì)胞數(shù)分別為 0.5×105～0.7×105個(gè)/mL（傳代比例1 ∶6）、0.67×105～083×105個(gè)/mL（傳代比例1 ∶5）、0.85×105～1.0×105個(gè)/mL（傳代比例 1 ∶4）、1.0×105～1.2×105個(gè)/mL（傳代比例1 ∶3），在25 cm2細(xì)胞瓶中加入10 mL細(xì)胞懸液，在37 ℃條件下培養(yǎng)，觀察細(xì)胞的貼壁情況、生長(zhǎng)狀態(tài)及細(xì)胞的密度。

1.3IBDV NJ09株在DF-1細(xì)胞上的最佳接毒量的確定

取已長(zhǎng)滿(mǎn)單層的25 cm2細(xì)胞瓶12個(gè)，分4組，每組3個(gè)重復(fù)，分別按0.1%、0.2%、0.5%、1.0%接毒量（體積分?jǐn)?shù)）接毒。接毒后，觀察細(xì)胞病變出現(xiàn)情況，待80%以上細(xì)胞出現(xiàn)病變時(shí)，收獲細(xì)胞毒。收獲的細(xì)胞毒反復(fù)凍融3次后，12 000 r/min 離心 10 min，取上清測(cè)定病毒含量。

1.4不同營(yíng)養(yǎng)液對(duì)擴(kuò)繁DF-1細(xì)胞的影響

DF-1細(xì)胞分別用3種細(xì)胞生長(zhǎng)液（DMEM+5%小牛血清、DMEM/F12+5%小牛血清、MD611+5%小牛血清）連傳3代后，消化細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.5不同營(yíng)養(yǎng)液擴(kuò)繁DF-1細(xì)胞對(duì)IBDV增殖的影響

取分別用3種細(xì)胞生長(zhǎng)液（DMEM+10%小牛血清、DMEM/F12+10%小牛血清、MD611+5%小牛血清）連傳細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)單層的25 cm2細(xì)胞瓶9個(gè)，3個(gè)1組，每個(gè)細(xì)胞瓶按 0.1%（體積比）接毒。第1組維持液為DMEM培養(yǎng)基（DMEM+2%小牛血清），第2組維持液為DMEM/F12培養(yǎng)基（DMEM/F12+2%小牛血清），第3組維持液為MD611培養(yǎng)基（MD611+2%小牛血清）。接毒后觀察細(xì)胞病變情況，各組均在接毒后細(xì)胞病變數(shù)量超過(guò)80%時(shí)收毒，收獲的細(xì)胞毒反復(fù)凍融3次后，12 000 r/min離心10 min，取上清測(cè)定病毒含量。endprint

1.6不同血清對(duì)IBDV增殖的影響

取已長(zhǎng)滿(mǎn)單層細(xì)胞的25 cm2細(xì)胞瓶6個(gè)，3個(gè)1組，按 0.1%（體積比）接毒。第1組維持液為含2%小牛血清的培養(yǎng)基，第2組為含2%胎牛血清的培養(yǎng)基。接毒后觀察細(xì)胞病變情況，各組均在接毒后細(xì)胞病變數(shù)量達(dá)到80%以上時(shí)收毒，-20 ℃凍存，12 000 r/min離心10 min，取上清測(cè)定病毒含量。

1.7IBDV收毒時(shí)凍融次數(shù)對(duì)病毒含量的影響

取已長(zhǎng)滿(mǎn)單層細(xì)胞的25 cm2細(xì)胞瓶6個(gè)，3個(gè)1組。按0.1%（體積比）接毒。接毒后觀察細(xì)胞病變情況，當(dāng)細(xì)胞病變數(shù)量超過(guò)80%時(shí)收毒，第1組將所取的3個(gè)方瓶細(xì)胞毒懸液混勻，反復(fù)吹打，不凍融，收獲病毒液。第2組將細(xì)胞置于 -20 ℃ 凍融，分別在凍融1、2、3次時(shí)取樣。所有樣品經(jīng) 12 000 r/min 離心10 min，取上清測(cè)定病毒含量。

1.8毒價(jià)測(cè)定方法

已長(zhǎng)滿(mǎn)單層細(xì)胞的96孔細(xì)胞板，棄去培養(yǎng)液，每孔用PBS洗滌1次。將病毒用無(wú)血清的培養(yǎng)液作10倍系列稀釋?zhuān)瑥淖畹拖♂尪鹊牟《疽洪_(kāi)始接種細(xì)胞，每個(gè)稀釋度接4個(gè)孔，每孔100 μL，在37 ℃ CO2培養(yǎng)箱中吸附1 h之后，每孔加入100 μL維持液（血清終濃度為2%）。放入37 ℃ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天觀察并記錄細(xì)胞病變情況，連續(xù)觀察7 d，計(jì)算TCID50。

2結(jié)果與分析

2.1DF-1細(xì)胞傳代比例篩選

由表1可以看出，將DF-1細(xì)胞按1 ∶3～1 ∶6不同比例分瓶傳代，在一定時(shí)間內(nèi)均能長(zhǎng)成致密單層。但隨著分瓶比例的加大，長(zhǎng)成致密單層的時(shí)間延長(zhǎng)。DF-1細(xì)胞按1 ∶3、1 ∶4 比例分瓶傳代時(shí)，接種后24～48 h能長(zhǎng)成致密單層，培養(yǎng) 48 h 時(shí)細(xì)胞數(shù)較多；而按1 ∶5～1 ∶6分瓶培養(yǎng)48 h細(xì)胞數(shù)少于1 ∶3、1 ∶4比例分瓶試驗(yàn)組，且于接種后60～84 h才長(zhǎng)成致密單層。因此，以1 ∶3、1 ∶4的傳代比例培養(yǎng)36～48 h 為最佳。

2.2IBDV在DF-1細(xì)胞上的最佳接毒量的確定

IBDV NJ09株在DF-1細(xì)胞上按0.5%～1.0%的量接毒，細(xì)胞在接毒后24 h出現(xiàn)病變，24～36 h細(xì)胞全部脫落，由表2可見(jiàn)，接種量0.5%～1.0%條件下，收毒時(shí)間為28～30 h，病毒含量為107.4～107.8 TCID50/mL。按0.1%～0.2% 的量接毒，細(xì)胞在接毒后24～36 h開(kāi)始出現(xiàn)病變，36～48 h 80%的細(xì)胞出現(xiàn)病變，病毒含量為108.0～108.2 TCID50/mL。因此，按0.1%～0.2%接毒量接毒時(shí)，36～48 h收毒的病毒含量最高。

2.3不同營(yíng)養(yǎng)液對(duì)DF-1細(xì)胞增殖的影響

由表3可知，培養(yǎng)48 h時(shí)，含DMEM培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)液中的細(xì)胞數(shù)為67萬(wàn)個(gè)/mL，DMEM/F12培養(yǎng)基中的細(xì)胞數(shù)為70萬(wàn)個(gè)/mL，而MD611培養(yǎng)基中的細(xì)胞數(shù)為100萬(wàn)個(gè)/mL，高于另2種培養(yǎng)基；在生產(chǎn)成本上，MD611培養(yǎng)基增殖DF-1細(xì)胞的生產(chǎn)成本明顯低于DMEM、DMEM/F12培養(yǎng)基，因此MD611培養(yǎng)基是經(jīng)濟(jì)又適宜的DF-1細(xì)胞培養(yǎng)基。

2.4不同營(yíng)養(yǎng)液對(duì)IBDV增殖的影響

由表4可知，3種營(yíng)養(yǎng)液中，含DMEM培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)液中IBDV的增殖效價(jià)最低，病毒含量為107.67 TCID50/mL，而含DMEM/F12、MD611培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)液中IBDV病毒含量分別為108.20、108.27 TCID50/mL，兩者IBDV的增殖量相當(dāng)，而在生產(chǎn)成本上，DMEM/F12生產(chǎn)成本大約是MD611的3倍（表3），因此MD611是一種適宜IBDV NJ09株病毒在DF-1上增殖的培養(yǎng)基。

3討論與結(jié)論

DF-1作為一種重要的禽傳代細(xì)胞，目前已在多種禽病毒增殖研究中被應(yīng)用，如IBDV、H9亞型禽流感病毒、新城疫病毒、馬立克氏病病毒等[19-20]。筆者所在實(shí)驗(yàn)室前期已經(jīng)馴化獲得1株DF-1細(xì)胞適應(yīng)毒——IBDV NJ09株，基于該細(xì)胞毒，本研究對(duì)其在DF-1細(xì)胞上進(jìn)行增殖培養(yǎng)時(shí)的接毒量、營(yíng)養(yǎng)液、血清、收毒方法等方面進(jìn)行了條件優(yōu)化，為進(jìn)一步完善該毒株的疫苗生產(chǎn)工藝提供支持。

從不同分瓶傳代比例看，DF-1細(xì)胞按1 ∶3～1 ∶6傳代，細(xì)胞都能長(zhǎng)成單層，但長(zhǎng)成單層需要的時(shí)間不同。因此可以根據(jù)不同的目的，選擇不同的分瓶比例。當(dāng)需要接毒時(shí)，可以選擇1 ∶3～1 ∶4的比例傳代，細(xì)胞在培養(yǎng)24～48 h時(shí)可以長(zhǎng)成致密單層。如果僅是維持細(xì)胞的傳代需要，可以選擇 1 ∶5～1 ∶6的比例分瓶，這樣既保存了細(xì)胞，又減輕了工作量。

不同營(yíng)養(yǎng)液對(duì)DF-1細(xì)胞的增殖結(jié)果顯示，DMEM、DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞48 h，細(xì)胞數(shù)約增殖2倍，用MD611培養(yǎng)DF-1 48 h后，細(xì)胞數(shù)增殖3倍左右，而且MD611價(jià)格便宜，僅為DMEM價(jià)格的1/2左右、DMEM/F12價(jià)格的1/3左右。

病毒接毒量研究結(jié)果顯示，IBDV NJ09株在DF-1細(xì)胞上按1.0%的接毒量接毒，毒價(jià)并不是最高，這一結(jié)果說(shuō)明了1.0%的接毒量過(guò)大，導(dǎo)致細(xì)胞病變出現(xiàn)過(guò)早，毒價(jià)亦未因接種量的增加而更高。病毒接毒量不是越大越好，細(xì)胞接毒量太大會(huì)造成細(xì)胞病變提前，導(dǎo)致細(xì)胞迅速圓縮脫落，毒價(jià)反而不高；而接毒量過(guò)少時(shí)又會(huì)造成細(xì)胞病變出現(xiàn)延遲，細(xì)胞衰老、狀態(tài)差也會(huì)影響病毒增殖的毒價(jià)，前人研究IBDV在細(xì)胞上的增殖時(shí)也有類(lèi)似的發(fā)現(xiàn)[21-22]。最佳接毒量應(yīng)該用每個(gè)細(xì)胞的病毒感染復(fù)數(shù)（MOI）表示更科學(xué)，而本試驗(yàn)中，由于細(xì)胞培養(yǎng)工藝比較成熟，細(xì)胞數(shù)也比較穩(wěn)定，且毒種的病毒含量是穩(wěn)定的，故接毒量用占維持液的百分比表示，在具體操作中更便捷。

不同血清對(duì)IBDV增殖影響的研究結(jié)果顯示，胎牛血清中IBDV NJ09株的病毒增殖后的含量比小牛血清略高，而成本比小牛血清高300元/L，結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際，選擇性?xún)r(jià)比高的小牛血清。endprint

IBDV收毒時(shí)，凍融次數(shù)對(duì)病毒含量影響的研究結(jié)果顯示，不凍融雖然對(duì)病毒含量影響不大，但有一部分細(xì)胞未脫壁，不能完全收清，而凍融1、2次后少量未脫璧的細(xì)胞也能脫落，利于完全收獲。

通過(guò)系列試驗(yàn)對(duì)DF-1的培養(yǎng)及IBDV NJ09株細(xì)胞毒生產(chǎn)工藝條件進(jìn)行了研究，確定了培養(yǎng)基及血清，同時(shí)制定了適用于規(guī)模化生產(chǎn)的抗原接種、收獲、處理工藝技術(shù)指標(biāo)：（1）DF-1細(xì)胞在傳代時(shí)，以1 ∶3、1 ∶4比例傳代，培養(yǎng)36～48 h后能長(zhǎng)成致密單層，適合接毒；（2）選用MD611培養(yǎng)基+2%小牛血清濃度維持液增殖IBDV病毒，既可以確保增殖抗原的高滴度，又降低了生產(chǎn)成本；（3）IBDV NJ09株最適接毒量為0.1%～0.2%（體積分?jǐn)?shù)），接毒時(shí)間為細(xì)胞生長(zhǎng)36～48 h后，收毒時(shí)間為接毒36～48 h（80%以上細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞病變）后，可確保病毒含量不低于108.0 TCID50/mL；（4）IBDV NJ09株在DF-1細(xì)胞上增殖收毒時(shí)的凍融次數(shù)，對(duì)抗原病毒含量影響不明顯，為確保病毒收獲完全，建議選擇凍融1～2次。

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