常瑞明 王鵬 楊濤 陳錦武 常建星

骨髓間充質干細胞促進糖尿病大鼠骨折愈合的研究

常瑞明1王鵬2楊濤2陳錦武1常建星3*

目的 檢測促炎因子TNF?α、IL?6及抗炎因子IL?4、IL?10以及Toll樣受體4在骨髓間充質干細胞促進糖尿病大鼠骨折愈合過程中的動態(tài)變化，探討炎癥失衡在此過程中的作用及可能機制。方法 7～8周齡SPF級雄性自發(fā)性2型糖尿病GK大鼠56只，喂養(yǎng)高脂飼料造模。造模成功后（隨機血糖≥11.1 mmol/L）暴露大鼠左側股骨，人為造成開放性骨折并給與克氏針復位內固定，將培養(yǎng)收集濃縮的骨髓間充質干細胞注射于骨折周圍肌肉軟組織，于實驗后第1周、3周、6周、8周分別行X線攝片、下腔靜脈取血測定炎癥因子、骨折局部軟組織檢測TLR4表達。結果 術后第1周、3周、6周、8周對照組TNF?a、IL?6、TLR?4表達均高于實驗組（P＜0.05），而IL?4、IL?10則低于實驗組（P＜0.05）；兩組動物在手術后第三周均可見骨折處骨痂生長，實驗組更加明顯，但對照組骨痂不均勻，骨密度較低。結論 骨髓間充質干細胞局部移植可以降低GK糖尿病大鼠骨折后機體的炎癥反應，促進骨折愈合。

骨髓間充質干細胞；GK糖尿病大鼠；炎癥反應因子；Toll樣受體4；骨折愈合

1 材料與方法

1.1 實驗動物及主要試劑

GK大鼠60只，雄性，購于上海斯萊克實驗動物有限責任公司，許可證號碼（SCXK（滬）2012?2002；高脂飼料購于上海普路騰生物科技有限公司；骨髓間充質干細胞購于Cyagen Biosciences Inc.兔抗鼠 TLR4抗體購于 Cell Signaling（Boston，MA，US）；內 參 抗 ?GAPDH 購 于 USBiological（Swampscott，MA，US）；鼠 TNF?α、IL?6、IL?4、IL?10 ELISA Kit購于達科為生物技術公司。

1.2 實驗方案

雄性7～8周齡GK大鼠給于高脂飼料喂養(yǎng)2周，測隨機血糖≥11.1 mmol/L認為造模成功。大鼠隨機分為實驗組和對照組各28只。（1）實驗組：大鼠在行手術后立即在骨折復位周圍肌肉軟組織處注射濃縮好的骨髓間充質干細胞（2×106個/mL）；（2）對照組：術后在手術部位處注射同等劑量的無菌生理鹽水。然后兩組動物分籠飼養(yǎng)，自由飲水、攝食。

大鼠截骨內固定模型：戊巴比妥鈉（45 mg/kg）腹腔注射麻醉滿意后，俯臥位固定于手術實驗臺，股骨外后方做約1.5 cm切口，逐層分離，暴露股骨中段，用電動擺鋸橫型離斷股骨，復位后用克氏針內固定，然后逐層縫合。手術過程見圖1。

1.3 骨髓間充質干細胞培養(yǎng)

鼠骨髓間充質干細胞細胞株在超凈臺下復蘇培養(yǎng)，定期換液、傳代，于手術當天取指數(shù)生長期的細胞進行濃縮制成細胞懸液（2×106個/mL），準備注射。

1.4 標本采集

于術后第1周、第3周、第6周、第8周麻醉后行骨折處攝片，下腔靜脈取血后即刻離心，取骨折處肌肉軟組織即刻-80℃低溫冰箱保存待測。

圖1 模型制作過程圖解

1.5 酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）

參照廠家說明書測定血液當中TNF?α、IL?6、IL?4、IL?10含量。

1.6 Western blot測定TLR?4表達

過程簡述：取股骨骨折周圍骨膜及肌肉軟組織，BCA蛋白定量試劑盒進行總蛋白測定（Thermo Fisher Scientific Inc.Rockford，USA）。取上述蛋白樣品各20μg，進行SDS?PAGE電泳和Western blotting分析。蛋白樣本加緩沖液混合，100℃變性處理5 min，蛋白上樣于12%聚丙烯酰胺凝膠電泳，用60 V進行濃縮膠電泳，時間20 min，120V在分離膠中電泳，60 min，電泳至溴酚藍剛跑出即終止電泳。電泳后轉印至PVDF膜上，封閉2小時，4℃孵育特異性一抗，過夜，一抗反應結束后與HRP標記的特異性二抗室溫孵育1 h，TBST洗膜，15 min×3次；用化學發(fā)光法（ECL）顯影。Adobe Photoshop 7.0分析條帶光密度。

1.7 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件分析，符合正態(tài)分布的實驗數(shù)據用均數(shù)±標準差表示，組內比較用方差分析，組間用t檢驗，顯著性水準為P小于0.05。

2 結 果

2.1 血清炎癥因子的測定

GK糖尿病大鼠經開放骨折內固定后不同時間點測定血液中炎癥因子的含量。實驗組促炎因子TNF?α、IL?6在第1周、第3周、第6周、第8周均低于對照組（P＜0.05），而抗炎因子IL?4、IL?10在對應時間點均高于對照組（P＜0.05）；有趣的是結果發(fā)現(xiàn)促炎和抗炎因子的變化在第一周到第三周的變化幅度較大，第三周至第八周變化幅度趨于平穩(wěn)，這說明炎癥反應在術后三周內較為劇烈，之后逐漸平穩(wěn)下來。見表1、表2。

表1 GK大鼠骨折內固定術后各時間點TNF?α、IL?6 （ng/mL,x±s，n=7）

表2 GK大鼠骨折內固定術后各時間點IL?4、IL?10（ng/mL,x±s，n=7）

2.2 骨折處軟組織TLR?4的表達

大鼠于手術后第1周、第3周、第6周、第8周分別取骨折周圍肌肉、骨膜等軟組織測定其TLR?4的表達，結果顯示實驗組TLR?4表達在對應時間點均低于對照組（P＜0.05）（圖2）。

2.3 術后大鼠不同時間點骨折愈合的X線表現(xiàn)

術后第一周實驗組和對照組均未見明顯的骨痂生長，術后第三周骨折處開始有較明顯的骨痂生長，實驗組術后第六、第八周骨折處逐漸愈合，骨皮質連續(xù)，骨密度均勻；對照組雖然也有逐漸愈合的趨勢，但骨質密度明顯不均勻，骨痂生長狀況不如實驗組（圖3）。

圖2 不同時間點骨折處軟組織TLR-4的表達

3 討 論

炎癥反應在糖尿病發(fā)病機制中的作用越來越被研究者認識［2］。但糖尿病足的神經病變、血管病變、難以控制的感染仍然是臨床棘手問題，而糖尿病足引起的骨質破壞（特別是夏克氏足）是致殘的重要因素［3］。骨科研究者試圖通過矯正融合植骨等手段重建足部的正常骨骼形態(tài)，為足部潰瘍愈合、回復足部的行走承重功能提供條件，但術后骨質延遲愈合甚至不愈合成為難以逾越的難關［4］。

圖3 骨折愈合的X線表現(xiàn)

骨髓間充質干細胞來源廣泛，在一定條件下可以定向分化成軟骨細胞、成骨細胞等，具有促進骨折愈合的能力［5］，但局部注射骨髓間充質干細胞促進糖尿病大鼠骨折愈合的研究報道較為少見。本實驗旨在研究骨折周圍局部注射濃縮后的骨髓間充質干細胞對糖尿病大鼠骨折內固定術后骨折愈合過程中炎癥因子、TLR?4的動態(tài)變化，結合骨折處X線顯示骨痂生長情況，探討炎癥反應在其中的作用。

TNF?α、IL?6是具有代表性的促炎因子，IL?4、IL?10是經典的抗炎因子代表，正常情況下機體處于促炎抗炎動態(tài)平衡狀態(tài)［6］。TLR?4是一類跨膜蛋白模式識別受體，在機體的免疫應答和炎癥反應中發(fā)揮重要作用，TLR?4是其中非常重要的一類。它識別病原體后向細胞內傳遞信號，激活多種核轉錄因子，誘導促炎因子的產生，打破抗炎?促炎平衡［7］。本實驗結果顯示實驗組在術后第1、第3、第6、第8周促炎因子TNF?α、IL?6均低于對應時間點的對照組，而抗炎因子IL?4、IL?10均高于對應時間點的對照組，骨折處肌肉軟組織中TLR?4的表達均低于對應時間點的對照組，這些結果說明炎癥反應對糖尿病大鼠骨折內固定術后骨折的愈合過程有影響。本實驗還發(fā)現(xiàn)，在大鼠骨折內固定術后第1周到第3周時間段炎癥反應的變化幅度較大，第3周后逐漸趨于平穩(wěn)狀態(tài)，說明骨折內固定術后早期（3周內）炎癥反應較劇烈。

術后第1周、第3周、第6周、第8周兩組X線結果顯示隨著時間的推移，骨折處逐漸均有骨痂形成，骨皮質逐漸形成連續(xù)，但實驗組大鼠骨折內固定后骨折處骨痂生長情況在對應時間點明顯優(yōu)于對照組，而且骨質密度均勻，愈合處骨形態(tài)規(guī)整。

結合本實驗結果說明骨髓間充質干細胞局部注射可促進糖尿病大鼠骨折的愈合，可能與注射干細胞后抑制機體的促炎因子形成、促進抗炎因子的釋放有關。骨髓間充質干細胞來源豐富，易于培養(yǎng)，局部注射方法簡便，期望在臨床上能有更廣闊的應用前景。

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Effect of bone marrow mesenchymal stem cells on fracture healing in diabetic rats

CHANG Ruiming1，WANGPeng2，YANGTao2，CHENJinwu1，CHANGJianxing3.
1Boji Medical Center，2Department of Emergency，3Department of Genaral Surgery，Sun Yat?sen Memorial Hospital，Sun Yat?sen University，Guangzhou 510120.Corresponding author：CHANGJianxing，chang_jianxing@aliyun.com

Objective To study the role of inflammation imbalance on mesenchymal stem cells promoting fracture healing in a model of GK diabetic rats by detecting the dynamic changes of the level of inflammation factors TNF?α，IL?6，IL?4，IL?10 and the expression of Toll?like receptor?4（TLR?4）.Methods The diabetic model on GK rats was induced by feeding high?fat diet（random blood sugar≥11.1 mmol/L）.The fracture was fixed with kirschner wire after the left thigh?bone of rats were exploded and sawed off，and then the concentrated stem cells were injected into the local area of the fracture.We collected the blood and tissue specimen to detect the concentrations of TNF?α，IL?6，IL?4，IL?10 and the expression of TLR?4 in one week，three week，six week and eight week after fracture fixation.The fracture healing was evaluated by X?ray.Results Thelevelsof TNF?α，IL?6 and the expression of TLR?4 were higher in the control group than those in the experimental group（all P values ＜ 0.05），however，the levels of IL?4 and IL?10 were lower in the control group（all P values ＜ 0.05）.The osteotylus forma?tion was more obvious and the bone mineral density was more homogeneous in the experimental group.Conclusion In the present study，our findings demonstrated that the local transplantation of bone mar?row mesenchymal stem cells reduced the inflammatory response and promote fracture healing fracture in diabetic GK rats.

mesenchymal stem cells；GK diabetic rats；inflammatory factors；TLR?4；fracture

中圖分類號：R683 文獻標識碼：A

10.3969/j.issn.1009?976X.2017.05.014

廣東省科技計劃項目（2013B060300008）

510120 廣州 中山大學孫逸仙紀念醫(yī)院1博濟醫(yī)療中心；2急診科；3普外科*通訊作者：常建星，Email：chang_jianxing@aliyun.com

隨著人們生活水平的提高，生活方式的改變，糖尿病的發(fā)病率呈現(xiàn)出逐年升高、年輕化的態(tài)勢。糖尿病血管病變、神經病變等并發(fā)癥給患者帶來嚴重后果，其中，糖尿病足導致的高致殘率更是給患者帶來嚴重的負擔，給社會帶來巨大的經濟損失。糖尿病足出現(xiàn)足部骨質的破壞，導致足踝部畸形，潰瘍難以愈合。諸多學者試圖通過矯形手術矯正畸形，為足部潰瘍愈合提供條件，但是術后骨折愈合困難甚至不愈合成為一個棘手的問題。近年來有報道應用骨髓間充質干細胞促進骨折愈合［1］，但局部注射的研究報道未見。炎癥反應在糖尿病發(fā)生發(fā)展中的重要作用越來越受到人們的普遍重視，本研究探討骨髓間充質干細胞促進糖尿病大鼠骨折愈合過程中炎癥間質及Toll樣受體4（TLR?4）的動態(tài)變化，為糖尿病骨折術后的愈合提供理論依據。

2017-08-26）