羅建江，馬紅霞

新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院(烏魯木齊 830000)

竹瀝對(duì)慢阻肺大鼠肺組織中AQP1、AQP4、AQP5、TNF-α和IL-6的影響*

羅建江，馬紅霞△

新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院(烏魯木齊 830000)

目的：觀察中藥竹瀝對(duì)慢性阻塞性肺疾病(COPD)大鼠肺組織中水通道蛋白1(AQP1)、4(AQP4)、5(AQP5)及腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素6(IL-6)表達(dá)的影響，探討中藥竹瀝對(duì)慢性阻塞性肺病患者化痰療效的可能機(jī)制。方法：選用雄性Wistar大鼠30只，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后隨機(jī)分為空白組、模型組、干預(yù)組,每組10只，除空白組外，其他組均采用香煙熏結(jié)合彈性蛋白酶氣管滴入法復(fù)制COPD大鼠模型，90 d后，干預(yù)組進(jìn)行鮮竹瀝口服液灌胃10 d，余兩組進(jìn)行生理鹽水灌胃10 d。干預(yù)結(jié)束后采用PCR法觀察AQP1、AQP4、AQP5的表達(dá)，酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測(cè)定大鼠肺組織中TNF-α和IL-6的含量。結(jié)果：與空白組比較，模型組、干預(yù)組肺組織中AQP1、AQP4、AQP5濃度顯著下降(P<0.01)，TNF-α、IL-6濃度顯著升高(P<0.01)。與模型組比較，干預(yù)組肺組織AQP1、AQP5濃度顯著升高(P<0.01)，AQP4、TNF-α和IL-6濃度顯著下降(P<0.01)，差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論：竹瀝對(duì)COPD的療效可能與調(diào)節(jié)水通道蛋白1、5(AQP1)、(AQP5)的轉(zhuǎn)運(yùn)，抑制腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素6(IL-6)表達(dá)密切相關(guān)。

“龐大容量的肺”是對(duì)慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary disease，COPD)的最早描述，目前已經(jīng)認(rèn)識(shí)到氣道和肺組織對(duì)有害氣體或顆粒的異常炎癥反應(yīng)被認(rèn)為是其重要特征[1]。其發(fā)病率高，對(duì)患者的活動(dòng)能力、生活質(zhì)量構(gòu)成嚴(yán)重危害[2]。氣道粘液的高分泌是COPD患者氣道阻塞的主要原因，也是影響病情和預(yù)后評(píng)估的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[3]，本文通過(guò)對(duì)大鼠造模，中藥竹瀝進(jìn)行干預(yù)，對(duì)肺組織中水通道蛋白1(AQP1)、水通道蛋白4(AQP4)、水通道蛋白5(AQP5)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白介素6(IL-6)進(jìn)行觀察，探索竹瀝對(duì)COPD臨床療效的作用機(jī)制，報(bào)道如下。

材料與方法

1 動(dòng) 物 SPF級(jí)雄性Wistar成年大鼠30只，鼠齡8周，體質(zhì)量200 g±50 g，由新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

2 藥物與劑量 鮮竹瀝口服液 (成分：鮮竹瀝，國(guó)藥準(zhǔn)字：Z35020128)根據(jù)體重按體表面積換算200 g加減50 g大鼠的每日灌藥量為6.6 ml，分早晚兩次灌胃。

3 試劑與儀器 電子天平由中國(guó)上海天平儀器廠生產(chǎn)，-80 ℃低溫冰箱由德國(guó) Thermo公司生產(chǎn)高速臺(tái)式離心機(jī)由德國(guó)Eppendorf公司生產(chǎn)，Milli-Q型純水系統(tǒng)由美國(guó) Millipore公司生產(chǎn)，Elisa試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司(Rat IL-6 ELISA Kit No23035347 IL-6單位ng/L)

4 實(shí)驗(yàn)分組及造模給藥 將30只大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后隨機(jī)分為三組，每組10只，即慢性阻塞性肺病模型組、慢性阻塞性肺病模型干預(yù)組和空白對(duì)照組。具體干預(yù)措施為：模型組和干預(yù)組在開始實(shí)驗(yàn)后的第30天以0.8 ml/100 g的生理鹽水氣管滴注溶20 U彈性蛋白酶，并于第1天至第29天、第31天至第90天內(nèi)每天上下午進(jìn)行熏煙，每次10只大鼠持續(xù)1 h。在90 d熏煙后模型組和干預(yù)組分別進(jìn)行生理鹽水和鮮竹瀝口服液灌胃10 d?？瞻捉M于第30天采用與模型組同樣的方式在氣管內(nèi)進(jìn)行等體積生理鹽水的滴注，90 d后進(jìn)行生理鹽水灌胃10 d。

造模成功的表現(xiàn)為：大鼠肺部組織顏色呈白色或灰白色，外觀體積增大膨脹，鏡下可見支氣管的管腔狹窄，黏膜充血水腫變形或異常增厚，杯狀細(xì)胞化明顯，大量炎性細(xì)胞聚集浸潤(rùn)。呼吸性細(xì)支氣管管壁增生、肺泡膨大。細(xì)支氣管遠(yuǎn)端的氣囊腔不斷膨脹，最終破裂并融合成大的氣腔，因?yàn)榛乜s力降低，從而導(dǎo)致彈力纖維網(wǎng)破壞[4]。

5 指標(biāo)檢測(cè) 麻醉實(shí)驗(yàn)大鼠取血的同時(shí)，開胸暴露胸腔，結(jié)扎右肺，切除后上中葉迅速放入-80 ℃冰箱，用PCR法對(duì)肺組織中AQP1、AQP4、AQP5進(jìn)行檢測(cè)。下葉采用ELISA法分別對(duì)IL-6、TNF-α的濃度分別進(jìn)行測(cè)定，實(shí)驗(yàn)具體步驟按照試劑盒內(nèi)的說(shuō)明書進(jìn)行操作。

6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件。所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，并對(duì)相關(guān)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)行單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

樣本缺失說(shuō)明：氣道滴注彈性蛋白酶進(jìn)行染毒過(guò)程中空白組死亡3只大鼠，染毒后熏煙造模過(guò)程中模型組、干預(yù)組各組死亡3只大鼠，有效樣本量21只，TNF-α、IL-6測(cè)試中采用單鼠雙肺測(cè)定，有效樣本量為24只。

1 實(shí)驗(yàn)各組對(duì)模型大鼠肺部組織中AQP1、AQP4、AQP5表達(dá)高低的影響 表1結(jié)果顯示：與空白組比較，模型組與干預(yù)組AQP1、AQP4、AQP5含量顯著下降(P<0.01)；與模型組比較，干預(yù)組AQP1、AQP5顯著升高，AQP4顯著降低(P<0.01)。

表1 各組對(duì)大鼠肺組織中AQP1、AQP4、AQP5表達(dá)的影響

注：與空白組比較，△P<0.01；與模型組比較， *P<0.01

2 各組對(duì)大鼠肺組織中TNF-α、IL-6的影響 表2結(jié)果顯示：與空白組比較，模型組與干預(yù)組TNF-α、IL-6顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組比較，干預(yù)組TNF-α、IL-6顯著下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

表2 各組對(duì)大鼠肺組織中TNF-α、IL-6的影響

注：與空白組比較，△P<0.01；與模型組比較， *P<0.01

討 論

竹瀝，又名竹汁、淡竹瀝等，始載于東漢的《神農(nóng)本草經(jīng)》。自古有“痰家之圣劑”之美稱。常用于治療肺熱痰壅、咳嗽、大熱煩渴，驚風(fēng)等疾病，古籍中一些經(jīng)典方劑如“竹瀝達(dá)痰丸”、“竹瀝枳術(shù)丸”、“黃柏竹瀝膏”等均有對(duì)竹瀝的應(yīng)用記載。

慢性阻塞性肺病作為肺部損傷的常見慢性疾病，目前西醫(yī)多用抗感染、解痙平喘等手段治療，但效果并不理想，結(jié)合中醫(yī)辨證論治無(wú)論是疾病的穩(wěn)定期還是急性加重期都會(huì)提高COPD療效，改善肺功能[5-6]。中藥竹瀝可抑制痰液的分泌、減輕氣道的炎癥反應(yīng)，廣泛用于各類呼吸道、肺部感染所致的咳嗽、咳痰、胸悶氣憋[7]，有研究表明[8]西醫(yī)基礎(chǔ)治療聯(lián)合鮮竹瀝口服可增加COPD急性發(fā)作期療效，舒利迭聯(lián)合鮮竹瀝對(duì)治療穩(wěn)定期COPD患者安全有效，不僅能改善患者肺功能、同時(shí)還能減少激素吸入次數(shù)。其機(jī)制認(rèn)為可能與竹瀝含有大量巰基，可使分泌物中黏蛋白、糖蛋白的二硫鍵斷裂，起到稀釋痰液粘稠度，促進(jìn)纖維擺動(dòng)等作用，其次與竹瀝中含豐富硒元素，可清除氧自由基，穩(wěn)定細(xì)胞膜等因素有關(guān)[9]。

水通道蛋白(Aquaporins，AQPs)作為細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，在目前已發(fā)現(xiàn)的13種AQP中，有六種表達(dá)于肺，其中AQP1、AQP4、AQP5在肺水轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中有重要作用。有研究表明，AQP5基因敲除后可減弱肺部對(duì)細(xì)菌的清除能力，COPD患者中AQP4表達(dá)減少可導(dǎo)致其肺功能下降及氣道炎癥加重[10]。TNF-α、IL-6是機(jī)體內(nèi)兩種重要的多功能細(xì)胞因子，具有廣泛的生物學(xué)活性，可促進(jìn)肺部炎癥細(xì)胞的募集，包括COPD、哮喘在內(nèi)的慢性氣道炎癥性疾病，其急性加重期均有TNF-α、IL-6的參與[11]。

本研究對(duì)小鼠造模干預(yù)后發(fā)現(xiàn)：與空白組大鼠比較，模型組大鼠肺組織APQ1、APQ4、APQ5含量明顯下降， IL-6 及TNF-α含量明顯升高，表明在香煙煙霧及彈性蛋白的誘導(dǎo)下，肺內(nèi)水液轉(zhuǎn)運(yùn)功能下降，運(yùn)行失調(diào)，使水液儲(chǔ)留于氣道。與模型組比較，干預(yù)組可顯著增強(qiáng)肺組織中AQP1、AQP5的表達(dá)，降低TNF-α、IL-6的表達(dá)，這與方志全[12]等研究相一致，提示竹瀝可增強(qiáng)肺組織中水通道蛋白表達(dá)，以AQP1、AQP5為主，同時(shí)減輕炎性因子TNF-α、IL-6浸潤(rùn)，減少氣道和肺粘液高分泌，緩解COPD患者痰液堵塞的狀況，其機(jī)制可能還與粘蛋白如MUC5AC，MUC5BC、以及其它水通道蛋白的表達(dá)有關(guān)，需進(jìn)一步研究論證。

[1] Kim V，Criner G.Chronic bronchitis and chronic obstructive pulmonary disease[J]．American Journal of Respiratory & Critical Care Medicine，2013，234(3)：149-161．

[2] 中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸病學(xué)分會(huì)慢性阻塞性肺疾病學(xué)組．慢性阻塞性肺疾病診治指南[J]．中華結(jié)核和呼吸雜志，2013，36(4)：255-264．

[3] 鐘相根，李宇航，賈 旭，等．“通利大腸”對(duì)慢性阻塞性肺疾病大鼠氣道黏液高分泌的影響[J]．北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，33(12)：809-812．

[4] 宋一平，崔德健，茅培英，等．慢性阻塞性肺疾病大鼠模型的建立及藥物干預(yù)的影響[J]．中華內(nèi)科雜志，2000，39(8)：51．

[5] 李秀蘭, 吳巴特爾, 常曉英,等. 順應(yīng)臟腑湯治療慢性阻塞性肺病穩(wěn)定期臨床觀察[J]. 陜西中醫(yī), 2016, 37(7):832-833.

[6] 魚 濤, 魏亞?wèn)|, 趙梅梅,等. 加味清金化痰湯配合西藥治療痰熱壅肺型慢性阻塞性肺病及對(duì)肺功能的影響[J]. 陜西中醫(yī), 2015, 36(4):409-410.

[7] 馬 艷，田金娜，陳志富，等．竹瀝顆粒和鮮竹瀝液治療小兒痰熱咳嗽隨機(jī)對(duì)照臨床試驗(yàn)[J]．中國(guó)藥業(yè)，2012，21(8)：34-35．

[8] 鄭鴻燕，李志軍．鮮竹瀝口服液輔助治療COPD急性發(fā)作療效觀察[J]．新中醫(yī)，2016,48(4)：222-224．

[9] 孫紅梅．氨溴索口服液與鮮竹瀝液輔助臨床治療呼吸道感染療效探討[J]．繼續(xù)醫(yī)學(xué)教育，2016, 30(5):157-158．

[10] 孫忠民，朱 柏，楊 嵐，等．AQP4在COPD支氣管黏膜的表達(dá)及其與患者肺功能、氣道黏膜炎癥的相關(guān)性[J]．西安交通大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版，2008，29(2)：193-195．

[11] 方 榮，王 倩，馮麗偉，等．IL-13、TNF-α在慢性阻塞性肺疾病和哮喘患者中的檢測(cè)意義[J]．臨床肺科雜志，2016，21(8)：1410-1413．

[12] 方志全，肖忠英．復(fù)方鮮竹瀝液治療慢性阻塞性肺疾病32例[J]．河南中醫(yī)，2016，36(6)：1027-1029．

EffectofbamboojuiceonlungtissueofratswithCOPDinAQP1,AQP4,AQP5,TNF-andIL-6

Luo Jianjiang，Ma Hongxia.

The Fourth Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University (Urumqi 830000)

Objective: To observe the effect ofbamboo juice on lungtissue of rats with COPD in AQP1, AQP4, AQP5, TNF- and IL-6, To explore the possible mechanism of COPD patients with phlegm effect of juice.Methods: 30 male Wistar rats, fed after 1 weeks were randomly divided into control group, model group and intervention group, 10 rats in each group, except the blank group, other groups were treated with cigarette smoking combined with elastaseintratracheal instillation of COPD rats model was established, 90 days later, the intervention group in xianzhuli oral liquid gavage for 10 days, the two other groups were saline for 10 days. After the intervention, the expression of AQP1, AQP4 and AQP5 were observed by PCR method. The levels of TNF- and IL-6 in lung tissue were determined by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA).Results: Compared with the blank group, the concentrations of AQP1, AQP4 and AQP5 in the lung tissue of model group and intervention group were significantly decreased (P< 0.01), and the levels of TNF- and IL-6 were significantly higher (P< 0.01). Compared with the model group, the lung tissue AQP1 and AQP5 concentrations in the intervention group were significantly increased (P< 0.01), AQP4, TNF- and IL-6 concentrations were significantly decreased (P< 0.01), the difference was statistically significant.Conclusion: Bamboo juice have a curative effect of COPD may be related to the regulation of aquaporin 1 and aquaporin 5 (AQP1), (AQP5) transporter, inhibition of tumor necrosis factor alpha (TNF- alpha), interleukin 6 (IL-6) expression is closely related to.

Pulmonary disease, chronic obstructive/traditional Chinese medicine therapy Liquor phyllostachys Aquaporins Animal experimentation Rats

*新疆維吾爾自治區(qū)自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2015211C149)

△通訊作者

肺疾病, 慢性阻塞性 /中醫(yī)藥療法 竹瀝 水通道蛋白類 動(dòng)物實(shí)驗(yàn) 大鼠

R563

A

10.3969/j.issn.1000-7369.2017.11.061

(收稿：2017-06-28)