盧如玲，王麗珍，袁 爍，朱妹妹，古子娟，楊怡雯

1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院(廣州510405)，2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)(廣州510405)

·實驗研究·

健脾化痰中藥聯(lián)合有氧運(yùn)動對肥胖型PCOS大鼠胰島素抵抗及胰島素信號通路的影響*

盧如玲1，王麗珍1，袁 爍1，朱妹妹2，古子娟2，楊怡雯2

1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院(廣州510405)，2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)(廣州510405)

目的：建立多囊卵巢綜合征伴胰島素抵抗(PCOS-IR)動物模型，觀察健脾化痰中藥聯(lián)合有氧運(yùn)動對PCOS-IR大鼠胰島素、性激素及卵巢組織PI3K/PKB/mTOR蛋白表達(dá)的影響。方法：大鼠造模成功后隨機(jī)分為有氧運(yùn)動組、中藥加有氧運(yùn)動組、模型對照組，經(jīng)不同干預(yù)治療28天后，檢測大鼠體重、空腹血糖(FPG)、空腹胰島素(FINS)，計算胰島素抵抗指數(shù)(Homa IR)；檢測大鼠血清LH、FSH、T；Western Blot法檢測大鼠卵巢組織PI3K/PKB/mTOR蛋白水平的表達(dá)。結(jié)果： 中藥加有氧運(yùn)動組體重、FPG、FINS、胰島素抵抗(IR)、LH、FSH、T、PI3K/PKB蛋白表達(dá)量較模型對照組顯著升高(P<0.05)，mTOR蛋白表達(dá)量顯著降低(P<0.05)。 中藥加有氧運(yùn)動組FINS、IR、T、mTOR蛋白表達(dá)量較有氧運(yùn)動組顯著下降(P<0.05)，PI3K/PKB蛋白表達(dá)量顯著升高(P<0.05)。結(jié)論：健脾化痰中藥聯(lián)合有氧運(yùn)動能減輕肥胖型PCOS-IR大鼠體重，改善IR及性激素異常，其機(jī)制可能通過影響胰島素信號通路PI3K/PKB/mTOR的活性來發(fā)揮作用。

多囊卵巢綜合征(Polycystic ovary syndrome ,PCOS) 是育齡期婦女常見的內(nèi)分泌紊亂綜合征，常表現(xiàn)為糖代謝異常與生殖功能障礙并存。臨床主要以高雄激素、持續(xù)無排卵及卵巢多囊樣改變?yōu)樘卣?，病理生理涉及范圍廣泛[1]。70%的PCOS患者存在血脂異常，主要表現(xiàn)為糖耐量減低、肥胖和血脂代謝異常等， IR是其關(guān)鍵發(fā)病機(jī)制[2]。目前尚無統(tǒng)一的發(fā)病機(jī)制能夠完整解釋PCOS的臨床癥候群，故其發(fā)病機(jī)制成為婦產(chǎn)科醫(yī)師的研究重點(diǎn)及難點(diǎn)。

健脾化痰中藥加減蒼附導(dǎo)痰湯方是廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦科名老中醫(yī)張玉珍教授的經(jīng)驗方，既往有臨床及實驗報道加減蒼附導(dǎo)痰湯可改善IR[3-4]，但對于肥胖型PCOS患者的體重控制不太理想，一定量的有氧運(yùn)動可減輕體質(zhì)量，降低體脂率，對PCOS起輔助治療作用。本實驗旨在建立PCOS-IR動物模型，觀察健脾化痰中藥聯(lián)合有氧運(yùn)動對肥胖型PCOS-IR大鼠血清FINS及性激素、卵巢組織PI3K/PKB/mTOR蛋白表達(dá)水平的影響，并進(jìn)一步探討其作用機(jī)制。

材料與方法

1 實驗動物 取21日齡SPF級雌性大鼠48只，購買于廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心(許可證號：SCXK(粵)2013-0002)，體重控制在60～70 g，其中12只為空白對照組，剩余36只利用經(jīng)典Poresky造模方法聯(lián)合高脂飼料誘導(dǎo)肥胖型PCOS-IR大鼠模型。造模成功后，隨機(jī)分為模型對照組、有氧運(yùn)動組、中藥+有氧運(yùn)動組各12只，分別實施不同的干預(yù)措施。

2 實驗方法 參考文獻(xiàn)方法，采用經(jīng)典Poresky方法造模，造模時間為56 d，空白對照組全程予充足的普通飼料及無菌水，模型組全程喂高脂飼料。模型組自第35～46 d頸背部皮下注射逐漸增加劑量的精蛋白生物合成人胰島素注射液( 諾和靈N) ，由開始0.5 U/d逐漸增加至6U/d，第47～56 d給予固定劑量6U/d，并加用HCG 6U/d，第35天開始每日喂以5%葡萄糖水。

造模結(jié)束后，空白對照組和模型對照組灌胃等容量生理鹽水，有氧運(yùn)動組和中藥+有氧運(yùn)動組采用有氧跑臺運(yùn)動(購自于安徽正華生物儀器有限公司，型號：ZH-PT)，有氧運(yùn)動首次運(yùn)動跑臺坡度為0，速度為10米/min，隔天遞增速度至12米/min(強(qiáng)度相當(dāng)于75%V02 MAX)，適應(yīng)性訓(xùn)練1周，之后連續(xù)進(jìn)行，1次/d，60 min/次，7次/周，為期28 d。中藥加有氧運(yùn)動組每日灌胃中藥1次，灌胃量分別為1 ml/100 g，連續(xù)28 d。加減蒼附導(dǎo)痰湯全方組成：蒼術(shù)、香附、法半夏、當(dāng)歸、石菖蒲、皂角刺各10 g，陳皮6 g，茯苓、黃芪各30 g，山藥20 g ，丹參、淫羊藿各15 g，購自廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科，水煎液由廣州中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)部提供，參考臨床用藥劑量，根據(jù)動物公斤體重劑量換算出大鼠的等效劑量。大鼠灌胃量為1 ml/100 g，據(jù)此換算出水煎液濃度為3.1815 g/ml。

3 檢測指標(biāo) 干預(yù)治療28 d后，電子天平稱大鼠體重，用10%水合氯醛腹腔注射，麻醉后腹主動脈取血，常溫放置30 min后，高速離心(3000 r/min，4℃)，取上層血清送檢，羅氏活力型血糖儀測FPG，放射免疫法測FINS，根據(jù)HOMA-IR=FPG×FINS/22.5，計算出IR值，酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)測LH、FSH、T，Western Blot法檢測大鼠卵巢組織中PI3K/PKB/mTOR蛋白水平的表達(dá)。

結(jié) 果

1 各組間體重的比較 經(jīng)干預(yù)治療28d后，空白對照組體重(321.89±6.67)g，模型對照組(359.44±19.79)g，有氧運(yùn)動組(317.11±32.84)g，中藥+有氧運(yùn)動組(307.21±28.32)g，與空白對照組比，模型對照組體重顯著升高(P<0.05)；與模型對照組比，有氧運(yùn)動組、中藥+有氧運(yùn)動組顯著下降(P<0.05)。

2 各組間血清胰島素抵抗方面的比較 經(jīng)干預(yù)治療28 d后，與空白對照比較，模型對照組FPG、FINS、IR顯著升高(P<0.05)；與模型對照組比較，有氧運(yùn)動組FPG、IR顯著降低(P<0.05)，中藥加有氧運(yùn)動組FPG、FINS、IR顯著降低(P<0.05)；與有氧運(yùn)動組比較，中藥+有氧運(yùn)動FINS、IR顯著降低(P<0.05)，見表1。

表1 各組胰島素抵抗方面的比較表

注：經(jīng)多組間單因素方差分析，與空白對照組比較，*P<0.05； 與模型對照組比較，#P<0.05；與有氧運(yùn)動組比較，△P<0.05

3 各組間血清性激素水平的比較 經(jīng)干預(yù)治療28 d后，與空白對照比較，模型對照組LH、FSH、T顯著升高(P<0.05)；與模型對照比較，有氧運(yùn)動組FSH顯著降低(P<0.05)，中藥+有氧運(yùn)動組LH、FSH、T顯著降低(P<0.05);與有氧運(yùn)動組比較，中藥+有氧運(yùn)動組T顯著降低(P<0.05)，見表2。

表2 空腹血清內(nèi)分泌指標(biāo)含量的比較表

注：經(jīng)多組間單因素方差分析，與空白對照組比較，*P<0.05； 與模型對照組比較，#P<0.05；與有氧運(yùn)動組比較，△P<0.05

4 各組間卵巢組織PI3K/PKB/mTOR蛋白表達(dá)水平的比較 經(jīng)干預(yù)治療28 d后，與空白對照比較，模型對照組PI3K/PKB蛋白相對表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，mTOR蛋白相對表達(dá)量顯著升高(P<0.05)；與模型對照比較，有氧運(yùn)動組PI3K蛋白相對表達(dá)量顯著升高(P<0.05)，mTOR蛋白相對表達(dá)量顯著下降(P<0.05)，中藥+有氧運(yùn)動組PI3K/PKB蛋白表達(dá)量顯著升高(P<0.05)，mTOR蛋白相對表達(dá)量顯著下降(P<0.05)；與有氧運(yùn)動組比較，中藥+有氧運(yùn)動組PI3K/PKB蛋白表達(dá)量顯著升高(P<0.05)，mTOR蛋白相對表達(dá)量顯著下降(P<0.05)，見表3。

表3 不同組卵巢組織各通路蛋白相對含量

注：經(jīng)多組間單因素方差分析，與空白對照組比較，*P<0.05； 與模型對照組比較，#P<0.05；與有氧運(yùn)動組比較，△P<0.05

討 論

單純有氧運(yùn)動和健脾化痰中藥聯(lián)合有氧運(yùn)動均能使PCOS-IR大鼠體重顯著下降。一定強(qiáng)度的有氧運(yùn)動促進(jìn)了能量消耗和周身脂肪及糖原的代謝。劉紅菊[5]等人研究結(jié)果顯示不同強(qiáng)度的有氧運(yùn)動可使代謝綜合征女性膽固醇、血糖、體重指數(shù)較對照組顯著降低，與本實驗結(jié)果相似。改善IR方面，健脾化痰中藥聯(lián)合有氧運(yùn)動效果明顯優(yōu)于單純有氧運(yùn)動。既往研究表明[6]，痰濁與IR在病因病理、體質(zhì)特征、內(nèi)分泌、糖脂代謝和血流動力學(xué)等方面具有密切的聯(lián)系。加減蒼附導(dǎo)痰湯諸藥合用達(dá)到健脾化痰、燥濕消脂、理氣調(diào)經(jīng)之效。健脾化痰中藥聯(lián)合有氧運(yùn)動更能促進(jìn)新陳代謝，增加能量消耗，降低脂肪積聚，改善IR。有研究報道[7-8]，有氧運(yùn)動能改善人體和大鼠IR狀態(tài)，本研究結(jié)果表明單純有氧運(yùn)動不能改善IR，與相關(guān)文獻(xiàn)報道結(jié)果不符，考慮可能與運(yùn)動時間不夠長有關(guān)，有待今后進(jìn)一步研究。

本研究顯示健脾化痰中藥聯(lián)合有氧運(yùn)動在降雄方面更具優(yōu)勢。加減蒼附導(dǎo)痰湯包含補(bǔ)腎藥、化痰藥、健脾藥、活血化瘀藥、行氣藥?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)[9-10]對補(bǔ)腎活血、化痰祛濕中藥的研究證實補(bǔ)腎活血中藥可以降低雄激素水平，改善排卵，對 PCOS 大鼠糖耐量異常和IR都有十分明顯的抑制作用。有實驗表明[7]，為期兩周的游泳運(yùn)動可顯著改善PCOS大鼠IR狀態(tài)，降低T、E2，恢復(fù)多囊卵巢的正常形態(tài)，論證了運(yùn)動改善PCOS的組織學(xué)變化，本實驗有氧運(yùn)動時間更長，而且聯(lián)合健脾化痰中藥，故降雄效果更顯著。單純有氧運(yùn)動和健脾化痰中藥聯(lián)合有氧運(yùn)動均能影響PCOS-IR大鼠PI3K/PKB/mTOR的活性，上調(diào)PI3K、PKB蛋白水平活性，下調(diào)mTOR活性，且中藥聯(lián)合有氧運(yùn)動的調(diào)控作用更大。

PI3K/PKB/mTOR信號通路廣泛存在于全身組織中，是一條經(jīng)典的胰島素信號通路，是生物體內(nèi)組織代謝、生長、調(diào)亡等多種生物學(xué)過程中起重要作用，在正常生理狀況下，該條通路中的蛋白分子PI3K/PKB處于激活狀態(tài)，蛋白分子mTOR處于一致狀態(tài)，在胰島素抵抗的情況下，蛋白分子PI3K/PKB/mTOR與生理情況下剛好相反。胰島素與胰島素受體結(jié)合后，活化PI3K/PKB從胞漿轉(zhuǎn)位到組織膜，促進(jìn)其絲/蘇氨酸磷酸化。激活的PKB主要通過使下游蛋白mTOR、GSK-3等磷酸化而發(fā)揮作用。活化的mTOR通過其下游蛋白S6K1引起IRS-1絲氨酸殘基磷酸化，反饋性的減弱了胰島素信號的下傳[11]。當(dāng)機(jī)體處于高胰島素血癥狀態(tài)下，高濃度的胰島素會刺激此通路下游mTOR表達(dá)增多而使胰島素受體絲氨酸發(fā)生磷酸化后與PI3K結(jié)合減少，最終導(dǎo)致信號傳導(dǎo)途徑PI3K/PKB/mTOR被抑制，引發(fā)機(jī)體產(chǎn)生IR[12]。且IR是形成PCOS非常重要的病理機(jī)制，故通路PI3K/PKB/mTOR與PCOS-IR的形成和調(diào)節(jié)可能具有密切的聯(lián)系，能從分子機(jī)制上解釋其生理病理。

綜上所述，健脾化痰中藥聯(lián)合有氧運(yùn)動可以使肥胖PC0S-IR大鼠減重，改善IR，使內(nèi)分泌水平趨向正常，為臨床上利用健脾化痰中藥聯(lián)合有氧運(yùn)動治療肥胖型PCOS患者提供了理論基礎(chǔ)，其機(jī)制可能通過影響胰島素信號通路PI3K/PKB/mTOR的活性來發(fā)揮作用。但是必須強(qiáng)調(diào)這種治療方法貴在堅持，且有氧運(yùn)動達(dá)到一定的強(qiáng)度，否則可能影響整體療效。

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EffectoftraditionalChinesemedicineofinvigoratingspleenandreducingphlegmcombinedwithaerobicexerciseoninsulinresistanceandinsulinsignalingpathwayinobesePCOSrats

Lu Ruling, Wang Lizhen, Yuan Shuo,et al.

First Affiliated Hospital of Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine(Guangzhou 510405)

Objective: To establish an animal model with polycystic ovary syndrome combined with insulin resistance (PCOS-IR), to observe the effect of the Jianpi Huatan Chinese traditional medicine combined with aerobic exercise on insulin level, sex hormone and the expression of PI3K/PKB/mTOR protein in ovarian tissues of PCOS-IR rats.Methods: The rats were randomly divided into the aerobic exercise group, the Chinese traditional medicine + aerobic exercise group and the control group after modelling, and weights, fasting blood glucose (FPG) and fasting insulin (FINS) of rats were measured, to calculate insulin resistance index (Homa IR) after intervention for 28 days; serum LH, FSH and T of rates were detected; Western Blot method was adopted to detect the expression of PI3K/PKB/mTOR protein level in ovarian tissues of rats.Results: Weights, FPG, FINS, insulin resistance (IR), LH, FSH, T and the expression of PI3K/PKB proteins of the Chinese traditional medicine + aerobic exercise group were significantly higher than those of the control group (P<0.05). FINS, IR, T and the expression of mTOR of the Chinese traditional medicine + aerobic exercise group were significantly lower than those of the aerobic exercise group (P<0.05), while the expression of PI3K/PKB protein was increased significantly (P<0.05).Conclusion: Jianpi Huatan Chinese traditional medicine combined with aerobic exercise can reduce the weight of obese PCOS-IR rats, improve IR and sex hormone abnormalities, and it may play a role by affecting the activity of insulin signaling pathway PI3K/PKB/mTOR.

Polycysticovary syndrome/traditional Chinese medicine therapy Insulin resistance @Jianpi Huatan Chinese traditional medicine Animal experimentation Rats

*廣東省科技計劃項目(2014A020212273) 國家中醫(yī)藥管理局張玉珍全國名老中醫(yī)藥專家傳承工作室

多囊卵巢綜合征/中醫(yī)藥療法 胰島素抗藥性 @健脾化痰中藥 動物實驗 大鼠

R711.75

A

10.3969/j.issn.1000-7369.2017.11.057

(收稿：2017-04-25)