劉丹丹 ， 杜方原 ， 馮春燕 ， 張永寧 ， 王彩霞 ， 仇松寅 ，劉曉飛 ， 王 勤 ， 吳紹強(qiáng) ， 林祥梅

(中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院動(dòng)物檢疫研究所 ， 北京 大興 100176)

小反芻獸疫血清學(xué)檢測方法研究進(jìn)展

劉丹丹 ， 杜方原 ， 馮春燕 ， 張永寧 ， 王彩霞 ， 仇松寅 ，劉曉飛 ， 王 勤 ， 吳紹強(qiáng) ， 林祥梅

(中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院動(dòng)物檢疫研究所 ， 北京 大興 100176)

小反芻獸疫(Peste des petits ruminant,PPR)是由小反芻獸疫病毒(Pestedespetitsruminantvrius，PPRV)引起的一種能感染家畜和野生小反芻動(dòng)物的高度接觸性傳染病，被世界衛(wèi)生組織(OIE)列為A類疫病。PPRV是副黏病毒科麻疹病毒屬成員，僅存在一個(gè)血清型，主要感染山羊和綿羊。感染后康復(fù)及接種免疫后的動(dòng)物可終身免疫。對(duì)急性、亞急性和癥狀不明顯的感染及免疫后的動(dòng)物進(jìn)行精準(zhǔn)的PPRV特異性抗體檢測是目前血清學(xué)檢測的重要研究方向。

目前，PPR的檢測方法主要用來進(jìn)行疫病診斷、疫病動(dòng)態(tài)監(jiān)測及其流行情況的調(diào)查，一些特殊檢測手段也用于PPR的地理分布和傳播特性的研究中。此外，為了實(shí)施精確有效的防控策略，有必要利用臨床和血清監(jiān)測手段來定位疫病暴發(fā)的地點(diǎn)并監(jiān)控疫病的傳播范圍。更快捷、更有效和更環(huán)保的同時(shí)能被大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室接受是目前PPR診斷試劑的研發(fā)方向。本文主要介紹現(xiàn)階段PPRV血清學(xué)檢測方法，以及相關(guān)抗原蛋白及抗原決定簇的研究進(jìn)展。

1 PPRV不同病毒蛋白的免疫原性

抗原的免疫原性是通過體液免疫應(yīng)答水平進(jìn)行評(píng)估的。體液免疫能抑制病毒的復(fù)制，同時(shí)發(fā)生的細(xì)胞免疫反應(yīng)也有助于殺死感染細(xì)胞。在野毒感染的急性期時(shí)表現(xiàn)出的過高熱反應(yīng)標(biāo)志著體液免疫應(yīng)答的開始。產(chǎn)生免疫后，1周左右出現(xiàn)抗體，3～4周左右上升至平臺(tái)期。中和抗體是抵御病毒感染的第一道防線，對(duì)治療麻疹病毒屬病毒引起的疫病有重要的作用。PPRV能刺激機(jī)體產(chǎn)生IgM和IgG抗體，IgM很快消失，而IgG可穩(wěn)定存在若干年，隨后水平降低但不會(huì)消失。疫苗產(chǎn)生的免疫保護(hù)力可持續(xù)1～3年[1]。

PPRV 蛋白的免疫學(xué)特性與血清學(xué)診斷息息相關(guān)。PPRV基因組為單股負(fù)鏈RNA，共編碼8種蛋白，其中6種是結(jié)構(gòu)蛋白，包括核衣殼蛋白(N)、磷酸化蛋白(P)、基質(zhì)蛋白(M)、大蛋白(L)以及血凝素蛋白(H)和融合蛋白(F)[2]。6種結(jié)構(gòu)蛋白中的3種病毒蛋白N、H和F可誘導(dǎo)產(chǎn)生免疫反應(yīng)。蛋白N可誘導(dǎo)產(chǎn)生免疫反應(yīng)，蛋白H和F誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體。位于PPRV包膜內(nèi)的F和H蛋白被制備成重組疫苗，用于免疫山羊。單獨(dú)或共同表達(dá)的重組蛋白都可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫力。接種重組羊痘病毒制備的疫苗，首次免疫后即可產(chǎn)生中和抗體。中和抗體滴度可在6個(gè)月內(nèi)保持較高的滴度，且在再次感染后會(huì)迅速升高。羔羊獲得的母源抗體可抵御病毒侵害，說明PPRV抗體具有很強(qiáng)的保護(hù)效力[3]。

2 PPRV與同屬病毒的血清交叉反應(yīng)性

由于麻疹病毒屬病毒的同源蛋白的核苷酸序列和氨基酸序列相似，導(dǎo)致病毒之間具有交叉反應(yīng)，是確診的難點(diǎn)之一。蛋白質(zhì)序列分析表明，同源蛋白的同源區(qū)域可能代表病毒的結(jié)構(gòu)相同或功能等效的區(qū)域[2,4]。用于疫病診斷的血清學(xué)試驗(yàn)如免疫熒光法、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)和瓊脂凝膠免疫擴(kuò)散試驗(yàn)等，都表明在麻疹病毒屬病毒的N、P、M、L和表面蛋白F中存在交叉反應(yīng)。研究顯示，至少在反應(yīng)初期，麻疹病毒(MV)/犬瘟熱病毒(CDV)、MV/牛瘟病毒(RPV)、RPV/PPRV以及CDV/海豚瘟熱病毒(PDV)表現(xiàn)出成對(duì)的交叉保護(hù)性。這些組合，除RPV/PPRV之外均被隨后的系統(tǒng)進(jìn)化學(xué)研究所證實(shí)。研究表明，RPV/MV形成了系統(tǒng)進(jìn)化的一個(gè)支系，而CDV/PDV 構(gòu)成了另外一個(gè)支系。PPRV屬 RPV/MV支系的一個(gè)分支[5]。這些病毒中，RPV需要與PPRV 做鑒別診斷，因?yàn)檫@兩種病毒能在反芻動(dòng)物中表現(xiàn)出相似的臨床癥狀。當(dāng)兩種病毒的地理分布和宿主范圍一致時(shí)，做血清學(xué)監(jiān)測尤為困難。雖然RPV已經(jīng)被根除，但仍需進(jìn)一步研發(fā)PPRV特異性血清學(xué)方法以減少PPRV同其他麻疹病毒之間的交叉反應(yīng)。

3 PPRV血清學(xué)診斷的靶蛋白

研究顯示，在麻疹病毒屬病毒的表面蛋白中，只有H蛋白引起的病毒間的交叉反應(yīng)較小。該蛋白主要影響細(xì)胞噬性，與宿主特異性信號(hào)淋巴細(xì)胞活化分子(SLAM)相結(jié)合誘發(fā)特異性的中和免疫反應(yīng)[6]。PPRV的H蛋白具有血凝素活性[7]和神經(jīng)氨酸酶活性[8]。通過構(gòu)象序列結(jié)合，H蛋白的鼠單克隆抗體(mAbs)能識(shí)別并中和抗原表位來抑制神經(jīng)氨酸酶的活性和血凝素的活性[9]。基于H蛋白的PPRV-mAb的檢測方法可用于血清學(xué)鑒別診斷。

相比較而言，F(xiàn)蛋白是病毒蛋白中最保守的蛋白。在PPRV中，F(xiàn)蛋白是主要的交叉保護(hù)性抗原，其C端和N端都具有保守性[4]。由于F基因的高度同源性，它主要用于PPRV的分子流行病學(xué)研究[10-11]。

麻疹病毒屬病毒的N蛋白具有較高的抗原保守性。N蛋白位于病毒的核心部位，含量高，具有高度免疫原性。PPRV N蛋白的氨基酸序列分為中度保守的氨基端，高度保守的中心區(qū)以及覆蓋105個(gè)aa的極不保守的羧基端3個(gè)區(qū)域。PPRV N蛋白抗原表位可以通過mAbs檢測，還可通過免疫或感染牛羊的陽性血清加以確認(rèn)[12]。研究發(fā)現(xiàn)，N蛋白的單克隆抗體可以區(qū)分PPRV和RPV，可用于PPRV ELISA檢測試劑盒的研發(fā)。

4 血清學(xué)檢測方法

目前主要用血清學(xué)檢測結(jié)合臨床癥狀及流行病學(xué)來確診PPR。臨床上PPR易同出血性敗血癥(Hemorrhagic septicemia)、山羊傳染性胸膜肺炎(Goat contagious pleural pneumonia,CCPP)及RP混淆。PPRV血清學(xué)檢測方法最常用的是病毒中和試驗(yàn)(VNT)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)，較少應(yīng)用的是血凝抑制試驗(yàn)(HI)和間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)方法。

4.1 血凝抑制試驗(yàn)(HI)和間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA) HI是一種便捷廉價(jià)的血清學(xué)檢測手段，但由于其易與麻疹病毒屬的其他病毒產(chǎn)生交叉反應(yīng)而少有應(yīng)用。IFA是一種將抗原抗體反應(yīng)與顯微示蹤相結(jié)合的技術(shù)，利用血清和相應(yīng)的熒光標(biāo)記物孵育，在熒光顯微鏡下，可以直接觀察特異性熒光及其存在的位置。由于該方法需要特殊的儀器設(shè)備，僅限于實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)。

4.2 病毒中和試驗(yàn)(VNT) VNT是最早用的檢測PPRV抗體的血清學(xué)方法，也是OIE陸生動(dòng)物手冊(cè)中推薦的國際貿(mào)易檢測方法[13]。VNT是利用抗體對(duì)病毒的中和作用，通過觀察中和反應(yīng)后血清與病毒混合液引起的細(xì)胞病變來測定血清中的抗體及其效價(jià)。該方法最早應(yīng)用于牛瘟，在牛瘟根除計(jì)劃[14]中發(fā)揮了重要作用。但該方法過于繁瑣且需要培養(yǎng)病毒和細(xì)胞，不適用于大規(guī)模監(jiān)測。目前該方法作為鑒別手段僅用于實(shí)驗(yàn)室的研究，也用于評(píng)估新的檢測方法及對(duì)未知種群、駱駝、易感PPRV野生物種的靈敏度和特異性。

4.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA) 目前建立的PPRV的ELISA檢測方法主要分為間接ELISA法、阻斷ELISA法及競爭ELISA法。隨著桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)和原核表達(dá)系統(tǒng)的發(fā)展，ELISA包被的抗原由原來的全病毒發(fā)展為重組蛋白、合成肽等。

4.3.1 間接ELISA法 間接ELISA法是先包被抗原，加入待檢血清，利用酶標(biāo)記的抗抗體檢測與固相抗原結(jié)合的待檢血清。2007年Balamurugan[3]等建立了PPRV的間接ELISA法，包被抗原為PPRV全病毒?，F(xiàn)在間接ELISA法使用的抗原多為由桿狀病毒表達(dá)或原核表達(dá)的重組PPRV N蛋白，相較于病毒而言，重組蛋白更易制備、更特異、更安全，無PPRV感染的國家也可以應(yīng)用[15]。間接ELISA法操作簡便，但該檢測方法難以區(qū)分麻疹病毒屬病毒交叉反應(yīng)，因此常用于初步篩查試驗(yàn)。

4.3.2 阻斷ELISA法與競爭ELISA法 阻斷ELISA法和競爭ELISA法都是先包被抗原，檢測待檢血清中的抗體。阻斷ELISA法原理是先將待檢血清同包被的抗原進(jìn)行孵育，然后加入H蛋白特異性單克隆抗體，待檢血清阻斷H蛋白與H蛋白的單克隆抗體結(jié)合，導(dǎo)致加入酶標(biāo)抗二抗的抗體和顯色液后陽性血清顏色減退。競爭ELISA法是將待檢血清和特異性單克隆抗體同時(shí)加入反應(yīng)板，待檢血清與H蛋白特異性單克隆抗體競相結(jié)合包被的抗原，導(dǎo)致加入的酶標(biāo)抗二抗的抗體和顯色液后陽性血清顏色較淺。和競爭ELISA法相比，阻斷ELISA法敏感性和特異性更好。競爭ELISA法應(yīng)用廣泛在非洲、中東和亞洲的PPR診斷中，準(zhǔn)確性非常高，目前被英國BDSL公司商品化。有研究顯示，相對(duì)于高度特異的牛瘟競爭ELISA，PPR競爭ELISA法有時(shí)會(huì)檢出牛瘟抗體，尤其是檢測牛瘟免疫后的動(dòng)物時(shí)，PPR競爭ELISA法的特異性會(huì)明顯下降[16]。

4.3.3 基于多肽或抗原表位的ELISA法 雖然競爭ELISA法應(yīng)用廣泛，但由于位阻現(xiàn)象，與牛瘟有一定的交叉反應(yīng)[16]。為了研發(fā)更特異的血清學(xué)檢測方法，首先要識(shí)別具有免疫顯性且針對(duì)PPRV的抗原表位和結(jié)構(gòu)域，合成單一的抗原表位。短合成肽的優(yōu)勢是它能消除非特異性反應(yīng)或位阻現(xiàn)象更特異。此外，這種方法還無需培養(yǎng)病毒或制備單克隆抗體。由于在所有結(jié)構(gòu)蛋白中，N蛋白是病毒豐度最高的蛋白，可迅速引起機(jī)體產(chǎn)生抗N的免疫應(yīng)答，因此N蛋白的氨基酸序列被選為PPRV的特異抗原表位的代表。對(duì)N蛋白的晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，顯示PPRV N蛋白的多變區(qū)具有高免疫原性。比較N蛋白多變區(qū)肽段和山羊抗PPR血清以及兔抗牛瘟血清這兩者的反應(yīng)，能快速精準(zhǔn)地辨識(shí)出針對(duì)PPR的抗原表位。Dechamma[17]等的研究顯示，N末端區(qū)域的肽132STEGPSSGSKKRIN144、C末端區(qū)域的肽433ATREEVKAAIP443和454RSGKPRGETPGQLLPEIMQ472與PPRV 抗體的高度特異反應(yīng)，且與牛瘟血清的反應(yīng)較少。為進(jìn)一步提高PPRV競爭ELISA反應(yīng)的特異性，研究者們致力于通過PPRV N蛋白抗原表位的免疫原性和特異性來制造多克隆抗血清以取代肽基ELISA的單克隆抗體。改進(jìn)后的基于抗原表位的競爭ELISA(peptide-based ELISA)更加敏感和特異[18]。

4.4 PPRV標(biāo)記疫苗配和血清學(xué)檢測的方法 目前現(xiàn)有的檢測方法并不能區(qū)分免疫動(dòng)物和感染動(dòng)物。因此，建立PPRV標(biāo)記疫苗和配套檢測方法將有助于制定免疫策略，控制疫病的流行。最理想的情況是，血清學(xué)監(jiān)測可以鑒別和區(qū)分野毒感染的動(dòng)物、免疫動(dòng)物以及野毒和免疫共同感染的動(dòng)物。Buczkowski[19]利用反向遺傳技術(shù)構(gòu)建了第一個(gè)RPV H蛋白單表位缺失的負(fù)標(biāo)記疫苗，能有效區(qū)分接種動(dòng)物與感染動(dòng)物，為研發(fā)PPRV標(biāo)記疫苗奠定了良好的基礎(chǔ)。PPRV標(biāo)記疫苗和配套檢測方法將成為無疫國家或地區(qū)防控突發(fā)PPR的理想工具，并且將成為比撲殺政策更經(jīng)濟(jì)適用的方法。此外，標(biāo)記疫苗將降低監(jiān)測成本并加快疫病控制和根除。

5 小結(jié)

競爭ELISA法是準(zhǔn)確、標(biāo)準(zhǔn)和高效的檢測方法，可評(píng)估因感染或注射疫苗引起的免疫反應(yīng)。因傳統(tǒng)的VNT受試驗(yàn)條件所限，競爭ELISA檢測方法有望成為VNT的替代檢測方法。針對(duì)單一表位的單克隆抗體技術(shù)的應(yīng)用顯著提高了競爭ELISA法診斷的特異性。該方法可用于檢測所有流行國家和無疫國家的小反芻獸樣本。雖然還未證實(shí)野生動(dòng)物是PPRV的儲(chǔ)存宿主，但已證實(shí)它們可以通過家養(yǎng)動(dòng)物受到感染[20]，利用準(zhǔn)確的血清學(xué)檢測方法對(duì)野生動(dòng)物的PPR進(jìn)行監(jiān)測，掌握其流行狀態(tài)與該疫病的防控息息相關(guān)。

近年來，人們逐漸認(rèn)識(shí)了PPR的破壞性及其對(duì)國家經(jīng)濟(jì)、食品安全帶來的巨大影響，國際組織開始重視該病。PPR的危害性迫使我們必須盡快開展全球范圍的防控和根除計(jì)劃?？焖贉?zhǔn)確的血清學(xué)診斷是疫情暴發(fā)時(shí)的首要舉措，也是防止疫病進(jìn)入國門的必要手段。

表1 ELISA方法

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S816

A

0529-6005(2017)09-0065-04

2017-06-07

國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃(2016YFC1201603)；十二五國家科技支撐計(jì)劃(2013BAD12B01)；國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目(31402171)

劉丹丹(1982-)，女，碩士，從事動(dòng)物檢疫工作，E-mail: ken0439@163.com

杜方原(1990-)，女，碩士，從事動(dòng)物檢疫工作，E-mail:dufy@caiq.gov.cn

注：杜方原與劉丹丹對(duì)本文具有同等貢獻(xiàn)

吳紹強(qiáng)，E-mail:wusq@caiq.gov.cn;林祥梅，E-mail:linxm@caiq.gov.cn