王 濤，鄒文俊，張 璐,2，李 洋,2，郝俊杰,2，趙艷玲(.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，四川 成都637； 2.解放軍第302醫(yī)院藥學(xué)部，北京 00039)

*碩士研究生。研究方向：中藥理論與應(yīng)用研究。E-mail：2090483423@qq.com

#通信作者：主任藥師，博士，研究員。研究方向：中藥藥理學(xué)。E-mail：zhaoyl2855@126.com

基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)四逆湯抗心力衰竭的作用機(jī)制Δ

王 濤1,2*，鄒文俊1，張 璐1,2，李 洋1,2，郝俊杰1,2，趙艷玲2#
(1.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，四川 成都611137； 2.解放軍第302醫(yī)院藥學(xué)部，北京 100039)

目的：利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)預(yù)測(cè)中藥復(fù)方四逆湯抗心力衰竭的作用機(jī)制。方法：通過中草藥綜合數(shù)據(jù)庫獲取四逆湯相關(guān)活性成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)；通過中草藥活性成分?jǐn)?shù)據(jù)庫和治療靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫篩選四逆湯的作用靶點(diǎn)，建立靶點(diǎn)數(shù)據(jù)集；通過人類孟德爾遺傳綜合數(shù)據(jù)庫篩選心力衰竭相關(guān)的靶標(biāo)；蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建四逆湯和心力衰竭疾病的交互靶標(biāo)；采用Cytoscape軟件構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)-疾病”交互網(wǎng)絡(luò)圖。結(jié)果：篩選出四逆湯中99個(gè)活性成分和176個(gè)直接作用的蛋白靶點(diǎn)，41個(gè)心血管相關(guān)疾病直接作用的蛋白靶點(diǎn)，489個(gè)交互蛋白。其中，四逆湯與心力衰竭共同直接作用的8個(gè)蛋白靶點(diǎn)；共有25條通路參與抗心力衰竭作用，進(jìn)一步文獻(xiàn)調(diào)研發(fā)現(xiàn)，相關(guān)度較高的預(yù)測(cè)通路均得到實(shí)驗(yàn)證實(shí)，如磷脂酰肌醇3-激酶-絲氨酸/蘇氨酸激酶通路、絲裂原活化蛋白激酶通路、甲狀腺激素信號(hào)通路、表皮生長(zhǎng)因子受體ErbB信號(hào)通路和人體抑癌基因p53通路等。結(jié)論：本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)初步揭示了四逆湯抗心力衰竭作用的多維調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為其的臨床應(yīng)用提供了理論依據(jù)。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)； 四逆湯； 心力衰竭； 作用機(jī)制

四逆湯出自《傷寒論》，“脈浮而遲，表熱里寒，下利清谷者，四逆湯主之”。該方由附子、干姜和甘草等3味藥組成，為回陽救逆之代表方劑，用于少陰病之四肢厥逆、脈沉微細(xì)、神疲欲寐、惡寒倦臥及腹痛下利等陽氣虛衰諸癥[1]。對(duì)四逆湯回陽救逆等傳統(tǒng)功效的現(xiàn)代研究結(jié)果顯示，其具有強(qiáng)心、心肌保護(hù)、血管保護(hù)、免疫調(diào)節(jié)及抗休克作用[2]。研究結(jié)果顯示，四逆湯對(duì)心力衰竭大鼠具有保護(hù)作用，且其對(duì)心血管疾病的治療作用在臨床中也得到了證實(shí)[3-4]。中藥具有多成分多靶點(diǎn)的特點(diǎn)，故與化學(xué)藥相比，中藥的研究具有較高的難度，尤其是中藥復(fù)方的研究。四逆湯在臨床上應(yīng)用廣泛，但其成分復(fù)雜，目前多為臨床研究或針對(duì)其個(gè)別活性單體進(jìn)行的研究，并不能較為全面地反映其藥理作用的體內(nèi)機(jī)制。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基于系統(tǒng)生物學(xué)的理論對(duì)生物系統(tǒng)的網(wǎng)絡(luò)分析，強(qiáng)調(diào)對(duì)信號(hào)通路的多途徑調(diào)節(jié)，提高了臨床藥物試驗(yàn)成功率和藥物的治療效果[5]?；诰W(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，對(duì)中藥的活性成分、作用靶點(diǎn)和疾病等3個(gè)方面進(jìn)行綜合網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，使對(duì)中藥藥理學(xué)特征的概括更為全面，也符合中藥多成分多靶點(diǎn)的特點(diǎn)[6]。因此，現(xiàn)以網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)為研究方法，對(duì)四逆湯治療心血管疾病的作用機(jī)制進(jìn)行探討，以期為四逆湯的臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1數(shù)據(jù)的建立

通過中草藥綜合數(shù)據(jù)庫(TDT，http：//tcm.cmu.edu.tw/)獲得四逆湯中所含3味中藥的活性成分結(jié)構(gòu)，再通過中草藥活性成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(HIT，http：//lifecenter.sgst.cn/hit/)和治療靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(TTD，http：//bidd.nus.edu.sg/group/cjttd/)篩選與心力衰竭相關(guān)靶點(diǎn)，建立四逆湯靶點(diǎn)數(shù)據(jù)集。通過人類孟德爾遺傳綜合數(shù)據(jù)庫(OMIM，http：//www.omim.org/)篩選心力衰竭相關(guān)基因和蛋白靶點(diǎn)，建立心力衰竭靶點(diǎn)數(shù)據(jù)集，其中靶點(diǎn)連接蛋白通過交互蛋白數(shù)據(jù)庫(http：//dip.doe-mbi.ucla.edu)獲得。為便于統(tǒng)一分析，以上所有靶點(diǎn)均轉(zhuǎn)化成UniProt數(shù)據(jù)庫識(shí)別碼格式。

1.2網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

為更合理地闡明四逆湯中活性成分與心力衰竭靶點(diǎn)之間的關(guān)系，對(duì)其進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析。通過蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(http：//www.genome.jp/kegg/)分析，將四逆湯的化學(xué)成分、成分對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)、疾病對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)和交互蛋白對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)整合，構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)-疾病”交互網(wǎng)絡(luò)。利用Cytoscape 2.8.3軟件將以上網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化分析，并對(duì)每個(gè)節(jié)點(diǎn)的中介中心性、點(diǎn)度中心性和接近中心性等3個(gè)拓?fù)鋮?shù)通過CentiScaPe 1.2軟件進(jìn)行評(píng)估，選擇點(diǎn)度中心性≥2倍中位數(shù)的靶點(diǎn)，作為四逆湯治療心力衰竭的目標(biāo)靶點(diǎn)。

1.3京都基因與基因組百科全書(Kyotoencyclopediaofgenesandgenomes，KEGG)通路富集分析

將“1.2”項(xiàng)下所得直接作用靶點(diǎn)的UniProt數(shù)據(jù)庫識(shí)別碼導(dǎo)入ArrayTrack v.3.5.0軟件中進(jìn)行KEGG通路富集分析，得出交互網(wǎng)絡(luò)中的直接作用靶點(diǎn)相關(guān)通路。

2 結(jié)果

2.1“成分-靶點(diǎn)-疾病”交互網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

基于數(shù)據(jù)庫構(gòu)建方法，共篩選出四逆湯中99個(gè)活性成分和176個(gè)直接作用的蛋白靶點(diǎn)，41個(gè)心血管相關(guān)疾病直接作用的蛋白靶點(diǎn)，489個(gè)交互蛋白。通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)構(gòu)建出四逆湯抗心力衰竭作用的交互網(wǎng)絡(luò)，采用不同顏色和形狀圖形使其可視化后，可清晰直觀的看出藥物化學(xué)成分與疾病靶點(diǎn)之間的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系(見圖1)。其中，三角形為藥物化學(xué)成分，圓形為藥物與疾病的作用蛋白靶標(biāo)，方形為藥物化學(xué)成分和疾病共同直接作用的蛋白靶標(biāo)。

圖1 四逆湯抗心力衰竭作用的“成分-靶點(diǎn)-疾病”交互網(wǎng)絡(luò)圖Fig 1 Interactive network chart of “ingredients-target points-diseases” of Sini decoction in treatment of heart failure

2.2四逆湯成分及疾病共同直接作用靶點(diǎn)及其拓?fù)鋮?shù)

“成分-靶點(diǎn)-疾病”交互網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果顯示，在四逆湯活性成分所直接作用的171個(gè)蛋白靶點(diǎn)和心血管疾病直接作用的41個(gè)蛋白靶點(diǎn)中，有8個(gè)為共有蛋白靶點(diǎn)，其可能是四逆湯抗心力衰竭作用的最相關(guān)蛋白靶點(diǎn)。因此，對(duì)該8個(gè)蛋白靶標(biāo)進(jìn)行拓?fù)鋮?shù)進(jìn)行計(jì)算，結(jié)果見表1。

表1 四逆湯抗心力衰竭作用的“成分-靶點(diǎn)-疾病”交互網(wǎng)絡(luò)中直接作用靶點(diǎn)的拓?fù)鋮?shù)分析Tab 1 Analysis on topological parameters of directly active target points in the interactive network of “ingredients-target points-diseases” of Sini decoction in treatment of heart failure

2.3KEGG通路分析

對(duì)網(wǎng)絡(luò)中所有點(diǎn)的拓?fù)鋮?shù)分析結(jié)果顯示，所有相關(guān)蛋白靶標(biāo)的3個(gè)拓?fù)鋮?shù)點(diǎn)度中心性、中介中心性、接近中心性的中位數(shù)分別為1、0和0.246 134 82。采用ArrayTrack v.3.5.0軟件進(jìn)行通路富集分析，共富集出25條通路與四逆湯抗心力衰竭的功效相關(guān)，見表2。

3 討論

中醫(yī)藥是利用辨證和整體的思維模式、方法來研究及認(rèn)識(shí)人體正常生理活動(dòng)和病理變化、發(fā)病機(jī)制和治療策略、方法、療效評(píng)價(jià)等極其復(fù)雜的醫(yī)學(xué)科學(xué)體系[7]。該“模式”很難應(yīng)用單個(gè)或多種因素“加和”的微觀分析方法與手段加以闡述[8]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與中醫(yī)辨證論治及整體觀的原則相符合，在方法學(xué)上具有分析、動(dòng)態(tài)和整體的特點(diǎn)，是一種較全面系統(tǒng)的研究技術(shù)。以網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)來研究分析中藥及其復(fù)方，更加切合中醫(yī)藥的學(xué)術(shù)特點(diǎn)和實(shí)際，為解決現(xiàn)代中藥研究的熱點(diǎn)問題發(fā)揮了巨大的作用，極大地提升了中醫(yī)藥科技的總體水平[9]。

中藥大復(fù)方藥味較多，成分復(fù)雜，作用機(jī)制較難分析。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，篩選出四逆湯中99個(gè)活性成分和176個(gè)直接作用的蛋白靶點(diǎn)，41個(gè)心血管相關(guān)疾病直接作用的蛋白靶點(diǎn)，489個(gè)交互蛋白，并構(gòu)建了“成分-靶點(diǎn)-疾病”交互網(wǎng)絡(luò)圖。通過通路富集，發(fā)現(xiàn)共有25條通路參與對(duì)心血管疾病的治療作用，通過進(jìn)一步文獻(xiàn)調(diào)研，發(fā)現(xiàn)相關(guān)度較高的預(yù)測(cè)通路均得到實(shí)驗(yàn)證實(shí)，如磷脂酰肌醇3-激酶-絲氨酸/蘇氨酸激酶通路[10]、絲裂原活化蛋白激酶通路[11]、甲狀腺激素信號(hào)通路[12]、表皮生長(zhǎng)因子受體ErbB信號(hào)通路[13]和人體抑癌基因p53通路[14]等，在多種心力衰竭模型中均參與了對(duì)心臟功能的調(diào)節(jié)。以上結(jié)果也映射了中藥成分多、靶點(diǎn)多、作用途徑多、功能多的特點(diǎn)。本研究初步揭示了四逆湯抗心力衰竭作用的多維調(diào)控網(wǎng)絡(luò)， 為中醫(yī)藥的研究和發(fā)展提供了新的思路和方法。

表2 四逆湯抗心力衰竭作用的25條體內(nèi)通路Tab 2 The 25 internal pathways of the action of Sini decoction in anti-heart failure

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PredictionofMechanismofSiniDecoctioninAnti-heartFailureBasedonNetworkPharmacologyΔ

WANG Tao1,2, ZOU Wenjun1, ZHANG Lu1,2, LI Yang1,2, HAO Junjie1,2, ZHAO Yanling2
(1.College of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine,Sichuan Chengdu 611137, China; 2.Dept.of Pharmacy, 302 Military Hospital of China, Beijing 100039, China)

OBJECTIVE: To predict the mechanism of Sini decoction in anti-heart failure with the utilization of network pharmacology. METHODS: The Chinese herbal medicine database was searched to obtain the chemical constructions of Sini decoction related active ingredients; the database of active ingredients of Chinese herbal medicine and therapeutic target database was searched to screen the action target points of Sini decoction, so as to establish dataset of target points; the Online Mendelian Inheritance in Man database was searched to screen the related targets of heart failure; the protein to protein interaction network was used for constructing the interactive targets between Sini decoction and heart failure; the Cytoscape software was adopted to construct the interactive network chart of “ingredients-target points-diseases”. RESULTS: 99 active ingredients, 176 directly active protein target points, 41 directly active protein target points of cardiovascular related disease and 489 interactive proteins were screened out, 8 of which were the common protein target points of Sini decoction and heart failure; totally 25 pathways were involved in the action of anti-heart failure, further investigation and survey had indicated that all the predicted pathways with higher relevancy were testified, such as kinase pathways of phosphatidylinositol 3-kinase-serine/threonine and mitogen activated protein, signal pathways of thyroid hormones and epidermal growth factor receptor ErbB, human cancer suppressor gene p53 pathways, etc. CONCLUSIONS: By mean of network pharmacology, this study has preliminarily revealed the multi-dimension regulatory network of the action of Sini decoction in anti-heart failure, so that provide theoretical bases for its clinical application.

Network pharmacology; Sini decoction; Heart failure; Mechanism

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.81573631、No.81303120)；軍隊(duì)十二五面上課題(No.CWS11C164)

R932

A

1672-2124(2017)10-1304-03

DOI 10.14009/j.issn.1672-2124.2017.10.003

2017-08-02)