張杰良，黃雪珍，莫和國，鄧文成，梁映亮，徐灼均，徐 寧

(南方醫(yī)科大學(xué)附屬小欖醫(yī)院檢驗(yàn)科,廣東中山 528415)

·經(jīng)驗(yàn)交流· doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2017.28.024

尿微量清蛋白抗原再添加檢測技術(shù)與前帶檢查研究分析*

張杰良，黃雪珍△，莫和國，鄧文成，梁映亮，徐灼均，徐 寧

(南方醫(yī)科大學(xué)附屬小欖醫(yī)院檢驗(yàn)科,廣東中山 528415)

目的探討尿微量清蛋白(mALB)抗原再添加檢測與前帶檢查技術(shù)應(yīng)用，識(shí)別并消除反應(yīng)體系中存在的鉤狀效應(yīng)。方法選擇mALB濃度分別為3.03、1 152.20、2 031.20、3 539.60 mg/L的門診患者隨機(jī)新鮮尿液標(biāo)本4份，選取濃度為3.03 mg/L與1 152.20 mg/L兩份標(biāo)本，按照不同的稀釋比例，配制成系列稀釋濃度標(biāo)本12份，加上述兩高值標(biāo)本組成14份高低系列濃度標(biāo)本；在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)置前帶檢查報(bào)警參數(shù)，使用抗原再添加技術(shù)檢測14份標(biāo)本中mALB，觀察并記錄理論濃度值、反應(yīng)過程吸光度值、實(shí)測濃度值與前帶檢查值；通過對(duì)出現(xiàn)前帶報(bào)警前后標(biāo)本濃度進(jìn)行系列再稀釋，查找出現(xiàn)前帶報(bào)警的最低濃度值。結(jié)果系列稀釋濃度標(biāo)本中，低濃度標(biāo)本1至標(biāo)本5沒有前帶檢查報(bào)警，而高濃度標(biāo)本6至標(biāo)本14都有前帶檢查報(bào)警，而出現(xiàn)前帶檢查報(bào)警的最低濃度值為360.74 mg/L。結(jié)論mALB檢測方法對(duì)高濃度標(biāo)本存在明顯的鉤狀效應(yīng)，應(yīng)用抗原再添加檢測與前帶檢查技術(shù)能夠迅速、有效地識(shí)別反應(yīng)體系中的鉤狀效應(yīng)，并通過儀器自動(dòng)稀釋再檢測功能正確測定標(biāo)本濃度。

尿微量清蛋白；抗原再添加技術(shù)；前帶檢查；鉤狀效應(yīng)

免疫濁度分析是利用抗原與相應(yīng)抗體反應(yīng)后形成免疫復(fù)合物，通過介質(zhì)濁度產(chǎn)生的變化，定量檢測標(biāo)本中抗原或抗體濃度的方法，其在臨床檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)技術(shù)方面應(yīng)用極為廣泛，如免疫球蛋白、特種蛋白、補(bǔ)體、尿液蛋白等物質(zhì)的檢測；該方法是一種抗原抗體結(jié)合動(dòng)態(tài)測定方法，具有敏感、特異、簡便快速等特點(diǎn)，可用于自動(dòng)化及大批量檢測[1]；然而，此方法對(duì)于低濃度標(biāo)本的檢測結(jié)果比較好，但對(duì)于高濃度標(biāo)本可能會(huì)出現(xiàn)“鉤狀效應(yīng)(Hook Effect)”[2]，即由于抗原或抗體過量，使抗原抗體比例不合適而導(dǎo)致檢測結(jié)果呈弱陽性或假陰性的現(xiàn)象。本研究應(yīng)用抗原再添加檢測與前帶檢查技術(shù)，通過對(duì)系列高低濃度的尿微量清蛋白(mALB)進(jìn)行免疫比濁定量檢測，研究分析不同濃度標(biāo)本反應(yīng)吸光度與實(shí)測濃度的變化，同時(shí)根據(jù)反應(yīng)監(jiān)測曲線形狀與前帶檢查(Prozone Check)報(bào)警值，識(shí)別并消除反應(yīng)體系中存在鉤狀效應(yīng)。

1 材料與方法

1.1標(biāo)本來源 選擇門診患者新鮮隨機(jī)尿液4份，經(jīng)檢測，mALB濃度分別為3.03、1 152.20、2 031.20、3 539.60 mg/L。

1.2儀器與試劑 采用Roche Cobas C8000全自動(dòng)生化分析儀進(jìn)行樣品檢測；mALB檢測試劑(R1、R2)，mALB抗原過剩檢測試劑(R3)及配套校準(zhǔn)品與質(zhì)控品均由Roche公司提供。

1.3方法

1.3.1檢測原理 mALB采用的是抗原再添加的檢測方法,即抗清蛋白抗體與樣品中清蛋白反應(yīng)產(chǎn)生抗原/抗體復(fù)合物并形成濁度，在抗體適當(dāng)過量的情況下，吸光度隨著濁度增加而增加，反應(yīng)曲線方向上升；隨后加入一定量稀釋的清蛋白(抗原過剩檢測試劑)，如反應(yīng)曲線方向繼續(xù)上升，說明抗體過剩，如反應(yīng)曲線方向轉(zhuǎn)為下降，說明抗原過剩。根據(jù)反應(yīng)監(jiān)測曲線吸光度的前后變化可計(jì)算出標(biāo)本mALB濃度與判斷是否發(fā)生鉤狀效應(yīng)。

1.3.2檢測參數(shù) mALB檢測方法采用2點(diǎn)終點(diǎn)法，主/次波長為340 nm/700 nm，整個(gè)檢測過程時(shí)間10 min，儀器共測定并記錄38個(gè)吸光度點(diǎn)測定值并生成反應(yīng)監(jiān)測時(shí)間與吸光度反應(yīng)曲線圖；其中試劑R1、R2、R3添加時(shí)間分別于第0、8、19點(diǎn)；用于標(biāo)本吸光度及濃度計(jì)算的為第6點(diǎn)吸光度(A6)與第14點(diǎn)吸光度(A14)值，而用于前帶檢查(PC)的吸光度為第18點(diǎn)吸光度(A18)與第26點(diǎn)吸光度(A26)值，前帶檢查(PC)吸光度區(qū)間下限為“-32 000”,上限為“700”，如果PC值落在上下限之間,則前帶報(bào)警“>Proz”。以上所有檢測參數(shù)由Roche公司提供。

1.3.3標(biāo)本吸光度與前帶檢查值計(jì)算[3]標(biāo)本吸光度：Ax=A14-dx×A6,dx=(Vsamp+VR1)/(Vsamp+VR1+VR2),Cx=b×[(a-Ax)/(Ax-d)]1/c；前帶檢查值：dx=(Vsamp+VR1+VR2)/(Vsamp+VR1+VR2+VR3),PC=A26-dx×A18。Ax為待測標(biāo)本吸光度計(jì)算值，dx為稀釋因子，Cx為待測標(biāo)本濃度,Vsamp與VR1、VR2、VR3為反應(yīng)過程樣品與各試劑體積，a、b、c、d分別為mALB校準(zhǔn)曲線參數(shù)(S1Abs,K,A,B),PC為前帶檢查值。本文Cx與PC由儀器自動(dòng)計(jì)算并記錄。

1.3.4系列稀釋濃度標(biāo)本配制與測定 按照以下稀釋系列“1 L,0.95 L+0.05 H,0.9 L+0.1 H,0.8 L+0.2 H,0.7 L+0.3 H,0.6 L+0.4 H,0.5 L+0.5 H,0.4 L+0.6 H,0.3 L+0.7 H,0.2 L+0.8 H,0.1 L+0.9 H,1H”，用低濃度標(biāo)本3.03 mg/L(L)對(duì)高濃度標(biāo)本1 152.20 mg/L(H)進(jìn)行稀釋，將系列稀釋濃度標(biāo)本與濃度為2 031.20、3 539.60 mg/L兩高值標(biāo)本進(jìn)行編號(hào)(標(biāo)本1、標(biāo)本2……標(biāo)本14)并在儀器上檢測，計(jì)算系列標(biāo)本理論濃度，記錄儀器反應(yīng)過程吸光度值與實(shí)測濃度值。根據(jù)發(fā)生前帶檢查報(bào)警(>proz)前后(標(biāo)本5與標(biāo)本6)的標(biāo)本濃度，再采用上述的低濃度標(biāo)本(L)與高濃度標(biāo)本(H)配制(標(biāo)本5與標(biāo)本6濃度區(qū)間)系列稀釋濃度標(biāo)本，稀釋系列為(μL)：345L+135H、345L+140H、345L+145H、345L+150H、345 L+155 H、345 L+160 H、345 L+165 H、345 L+175 H，標(biāo)本編號(hào)：標(biāo)本21、標(biāo)本22……標(biāo)本28。記錄儀器反應(yīng)過程吸光度值及實(shí)測濃度值。

表1 mALB系列稀釋標(biāo)本濃度檢測值與前帶檢查值表

2 結(jié) 果

2.1mALB系列稀釋標(biāo)本理論濃度值、吸光度值、實(shí)測濃度值及對(duì)應(yīng)前帶檢查(PC)值結(jié)果 PC值在區(qū)間“-32 000，700”之內(nèi)的，顯示前帶檢查報(bào)警“>Proz”。見表1。

2.2前帶報(bào)警前后再稀釋系列標(biāo)本濃度檢測結(jié)果 標(biāo)本21、標(biāo)本22……標(biāo)本28的檢測濃度及對(duì)應(yīng)的PC值分別為：327.39 mg/L(982)、337.28 mg/L (871)、345.24 mg/L (829)、355.52 mg/L (787)、360.74 mg/L (665,>Proz)、369.64 mg/L (394,>Proz)、375.00 mg/L (383,>Proz)與396.75 mg/L (141,>Proz)。

圖1 mALB理論濃度值與吸光度計(jì)算值及實(shí)測濃度值關(guān)系變化圖

2.3mALB系列稀釋標(biāo)本理論濃度值與吸光度計(jì)算值及實(shí)測濃度值的變化關(guān)系 mALB系列稀釋標(biāo)本理論濃度值與吸光度計(jì)算值及實(shí)測濃度值的變化關(guān)系見圖1。隨著標(biāo)本mALB濃度(理論濃度)的增高，儀器測定吸光度值及Ax也在升高，一直到標(biāo)本10(922.21 mg/L)達(dá)到峰值；此后的高濃度標(biāo)本11(1 037.10 mg/L)至標(biāo)本14(3 539.60 mg/L)，測定吸光度值及Ax反而在下降，其中濃度最高的標(biāo)本14下降最多，其吸光度計(jì)算值A(chǔ)x只有1 247.3，介乎于低濃度標(biāo)本1(3.03 mg/L)與標(biāo)本2(60.63 mg/L)的Ax之間，呈明顯的假性低值。mALB系列稀釋標(biāo)本反應(yīng)過程吸光度變化較為典型的6個(gè)反應(yīng)監(jiān)測曲線見圖2。反應(yīng)曲線監(jiān)測點(diǎn)6之前(標(biāo)本與試劑1混合后)，高低濃度標(biāo)本吸光度變化相差不大；監(jiān)測點(diǎn)14之前(標(biāo)本與試劑1,2混合后)抗原與抗體反應(yīng)形成免疫復(fù)合物，產(chǎn)生濁度，在一定范圍內(nèi)標(biāo)本濃度越高，吸光度越高，通過監(jiān)測點(diǎn)A6與A14吸光度變化可根據(jù)公式計(jì)算待檢標(biāo)本濃度。

3 討 論

鉤狀效應(yīng)是免疫比濁分析中很常見的現(xiàn)象，如腎病綜合征患者尿液中mALB的檢測(出現(xiàn)弱陽性或假陰性結(jié)果)，能否正確識(shí)別與消除反應(yīng)體系中存在的鉤狀效應(yīng)，直接關(guān)系到待測標(biāo)本結(jié)果準(zhǔn)確性，進(jìn)而影響臨床診斷與治療[4]。

根據(jù)表1和圖1理論濃度、標(biāo)本Ax與儀器記錄的實(shí)測濃度Cx之間不成比例的變化關(guān)系可知，mALB檢測方法對(duì)高劑量標(biāo)本存在明顯的鉤狀效應(yīng)。表1與圖1還顯示，標(biāo)本10的濃度值為系列稀釋濃度拐點(diǎn)(標(biāo)本吸光度與實(shí)測濃度由增長轉(zhuǎn)向下降)，從而可能會(huì)誤認(rèn)此標(biāo)本濃度為出現(xiàn)鉤狀效應(yīng)的拐點(diǎn)，但從PC值可知，標(biāo)本6的濃度值(462.62 mg/L)已出現(xiàn)前帶檢查報(bào)警(>Proz)，一直持續(xù)到標(biāo)本14；也就是說，標(biāo)本6到標(biāo)本10之間雖然反應(yīng)仍為正反應(yīng)，但已出現(xiàn)鉤狀效應(yīng)(理論濃度與實(shí)測濃度不成比例增加)，而出現(xiàn)鉤狀效應(yīng)的濃度點(diǎn)應(yīng)是在標(biāo)本5(347.72 mg/L)與標(biāo)本6濃度之間。根據(jù)前帶報(bào)警前后濃度再稀釋系列標(biāo)本檢測結(jié)果，mALB檢測方法出現(xiàn)前帶檢查報(bào)警的最低濃度值為360.74 mg/L，即標(biāo)本濃度大于或等于此值的檢測結(jié)果可能存在鉤狀效應(yīng)。上述結(jié)果說明，通過在分析儀器設(shè)置前帶檢查參數(shù)可迅速、有效識(shí)別反應(yīng)體系中存在的鉤狀效應(yīng)[5]。需要注意的是，本實(shí)驗(yàn)所用的mALB檢測試劑盒的使用說明書上注明的方法檢測范圍為3～400 mg/L，其上限值比本實(shí)驗(yàn)前帶報(bào)警值要高。也就是說，檢測值在達(dá)到方法檢測范圍上限前可能已存在鉤狀效應(yīng)，因此對(duì)檢測結(jié)果進(jìn)行解釋或進(jìn)行方法性能驗(yàn)證時(shí)要注意鑒別。

通過圖2可知，如反應(yīng)體系中有抗體過剩，加入抗原過剩檢測試劑(試劑3)后，濁度增加，吸光度繼續(xù)上升；如反應(yīng)體系中抗體已消耗完(抗原過量)，加入抗原過剩檢測試劑后，濁度增加不明顯，甚至下降，導(dǎo)致吸光度下降，通過吸光度點(diǎn)A18與A26監(jiān)測加入抗原過剩檢測試劑前后吸光度變化，并計(jì)算前帶檢查值判斷是否出現(xiàn)前帶報(bào)警。從圖2可直觀看出，高低濃度標(biāo)本反應(yīng)監(jiān)測曲線整體呈現(xiàn)明顯不同變化，以標(biāo)本2的反應(yīng)曲線為參考曲線來看，隨著標(biāo)本濃度的增高，反應(yīng)曲線向上移動(dòng)，標(biāo)本10的反應(yīng)曲線達(dá)到最高點(diǎn)；此后，隨著標(biāo)本濃度繼續(xù)升高，其反應(yīng)監(jiān)測曲線卻向下移動(dòng)，這種現(xiàn)象的出現(xiàn)是由于標(biāo)本濃度越高，抗原抗體比例越失衡，反應(yīng)完成率就越低造成的。標(biāo)本14(3 539.60 mg/L)可能是由于反應(yīng)一開始抗體就被消耗完成，抗原抗體比例嚴(yán)重失衡，各監(jiān)測點(diǎn)吸光度均處于低水平，其整個(gè)反應(yīng)監(jiān)測曲線呈一低平曲線。由此可知，正確認(rèn)識(shí)與理解反應(yīng)監(jiān)測曲線的吸光度前后變化特點(diǎn)，是鑒別鉤狀效應(yīng)是否存在的基礎(chǔ)[6]。

免疫比濁中高劑量鉤狀效應(yīng)識(shí)別可以從檢測系統(tǒng)的試劑、儀器、方法等各環(huán)節(jié)著手。有研究報(bào)道通過反應(yīng)完成率設(shè)置儀器參數(shù)與試劑或樣品二次添加觀察時(shí)間反應(yīng)進(jìn)程曲線的變化，可有效識(shí)別反應(yīng)體系中存在的鉤狀效應(yīng)[6-7]，但該方法無法給出直觀明了的報(bào)警參數(shù)，并且操作繁瑣，不容易理解。騰曉梅[8]通過對(duì)超過檢測方法線性范圍的標(biāo)本進(jìn)行手工稀釋或儀器自動(dòng)稀釋再檢測的方法能較好地識(shí)別鉤狀效應(yīng)，但本文結(jié)果已表明，在標(biāo)本濃度達(dá)到線性范圍階限前可能已存在鉤狀效應(yīng)。上述學(xué)者文獻(xiàn)結(jié)果顯示，在全自動(dòng)生化分析儀器上設(shè)置合適的檢測參數(shù)對(duì)標(biāo)本進(jìn)行監(jiān)測，是監(jiān)測反應(yīng)體系中鉤狀效應(yīng)存在的有效方法，但都無法準(zhǔn)確、直觀快速地解決反應(yīng)體系中鉤狀效應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)的mALB檢測方法應(yīng)用抗原再添加與前帶檢查技術(shù)，通過觀察反應(yīng)監(jiān)測曲線的變化及反應(yīng)過程有無前帶檢查報(bào)警，能夠迅速、準(zhǔn)確地測定標(biāo)本中的mALB濃度，并能有效識(shí)別反應(yīng)體系中存在的鉤狀效應(yīng)。如識(shí)別反應(yīng)體系存在有鉤狀效應(yīng)，則可以通過儀器上的自動(dòng)稀釋功能對(duì)標(biāo)本進(jìn)行稀釋重測或采用手工合理稀釋后正確測定標(biāo)本中分析物濃度。

高劑量鉤狀效應(yīng)不僅存在于免疫比濁分析中,在電化學(xué)發(fā)光免疫[9]、酶免疫測定[10]等所有以抗原抗體反應(yīng)為基礎(chǔ)、以吸光度分析為手段的臨床檢驗(yàn)方法中也普遍存在。因此，作為臨床實(shí)驗(yàn)室工作者應(yīng)該高度重視抗原抗體檢測中高劑量鉤狀效應(yīng)對(duì)分析結(jié)果的影響，盡量識(shí)別并消除反應(yīng)體系中存在的鉤狀效應(yīng)，切實(shí)提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性,為臨床提供可靠的診斷數(shù)據(jù)。

[1]王蘭蘭,許化溪,歐啟水,等.臨床免疫學(xué)檢驗(yàn)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2012:206-211.

[2]Cha KH,Sim YB,Chae H,et al.The analytical performance evaluation of FreeliteTMHuman Kappa Free and Human Lambda Free on the SPAPLUSTMimmunoturbidimetric analyzer[J].J Clin Lab Anal,2014,28(3):229-236.

[3]ROCHE.Cobas C8000 modular analyzer series COBI-CD Compendium of Background Information[M].Germany:Roche Diagnostics GmbH,2009:9-43.

[4]王妹,胡仁明.催乳素免疫測定法和鉤狀效應(yīng)[J].國際內(nèi)分泌代謝雜志,2009,29(2):95-97.

[5]Christopher RM,Peter MV,Catherine AH.A case of hook effect in the serum free light chain assay using the Olympus AU400e[J].Clin Biochemi,2009,42(1):121-124.

[6]劉忠民,高月亭,陳濤.自動(dòng)生化分析儀自動(dòng)識(shí)別免疫比濁分析中的鉤狀效應(yīng)[J].現(xiàn)代臨床醫(yī)學(xué)生物工程學(xué)雜志,2000,6(4):252-254.

[7]劉忠民,高月亭,陳濤.抗原過量檢查在全自動(dòng)生化分析儀上的應(yīng)用[J].廣州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2000,28(4):54-56.

[8]滕曉梅.免疫比濁法用于全自動(dòng)生化分析儀中產(chǎn)生鉤狀效應(yīng)的防范[J].國際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2015,36(12):1649-1650.

[9]李慧,高致遠(yuǎn).電化學(xué)發(fā)光免疫法檢測甲胎蛋白出現(xiàn)鉤狀效應(yīng)1例[J].檢驗(yàn)醫(yī)學(xué),2012,27(9):706-707.

[10]呂朝輝,范玉林,馬曉紅,等.ELISA法檢測HBsAb產(chǎn)生鉤狀效應(yīng)2例臨床分析[J].中國肝臟病雜志,2014,6(2):59-60.

廣東省中山市醫(yī)學(xué)科研基金資助項(xiàng)目(2016J154)。

張杰良(1982-)，主管技師，本科，主要從事臨床生化檢驗(yàn)工作?！?/p>

,E-mail:769137702@qq.com。

R446.1

B

1671-8348(2017)28-3962-03

2017-04-18

2017-06-26)