張二芹 ， 滕 蔓 ， 羅 俊 ， 趙孟孟 ， 許倩茹 ， 趙 東 ， 鄧瑞廣 ， 張改平

(1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 河南省動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 農(nóng)業(yè)部動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 ， 河南 鄭州 450002 ；2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院 ， 河南 鄭州 450002)

豬乙型腦炎病毒EDⅢ蛋白的原核表達(dá)、純化及活性檢測(cè)

張二芹1，2， 滕 蔓1， 羅 俊1， 趙孟孟2， 許倩茹2， 趙 東1， 鄧瑞廣1， 張改平2

(1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 河南省動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 農(nóng)業(yè)部動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 ， 河南 鄭州 450002 ；2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院 ， 河南 鄭州 450002)

在大腸桿菌BL21(DE3)中表達(dá)乙腦病毒(JEV)EDⅢ蛋白、鎳柱純化并檢測(cè)表達(dá)蛋白。采用RT-PCR方法擴(kuò)增EDⅢ基因片段，構(gòu)建重組表達(dá)載體pET-28a-EDⅢ并轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)菌，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，表達(dá)可溶性產(chǎn)物經(jīng)Ni-NTA親和層析純化，最后通過SDS-PAGE和Western-Blot檢測(cè)表達(dá)蛋白。結(jié)果成功構(gòu)建原核表達(dá)載體pET-28a-EDⅢ；EDⅢ蛋白在BL21(DE3)菌已表達(dá)，經(jīng)Ni-NTA獲得純化蛋白，并經(jīng)Western-Blot檢測(cè)具有反應(yīng)活性。

乙腦病毒 ； EDⅢ蛋白 ； 表達(dá)蛋白

乙腦是由日本乙型腦炎病毒引起的一種急性人獸共患傳染病。經(jīng)三帶喙庫(kù)蚊等蚊蟲叮咬傳播感染中樞神經(jīng)系統(tǒng)。JEV屬于黃病毒科黃病毒成員,乙腦病毒為球形，直徑40 nm，單股正鏈RNA病毒。病毒基因組全長(zhǎng)約為11 kb，自5′至3′依次編碼結(jié)構(gòu)蛋白C、M、E及非結(jié)構(gòu)蛋白NS1-NS5。結(jié)構(gòu)蛋白E[1-8]是JEV的主要保護(hù)性抗原，E糖蛋白上有中和抗原表位和血凝抗原表位，可誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體和血凝抑制抗體，從而保護(hù)機(jī)體免受病毒的攻擊。研究發(fā)現(xiàn),E蛋白的抗原決定簇分為3個(gè)區(qū)域，即EDⅠ,EDⅡ和EDⅢ。其中EDⅢ蛋白具有免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)，包含有中和抗原表位，可作為黃病毒科血清學(xué)診斷抗原及免疫接種該蛋白可抗病毒。因此本試驗(yàn)進(jìn)行了EDⅢ原核表達(dá)、純化及生物活性檢測(cè)，為進(jìn)一步研究病毒的特性、診斷試劑及新型疫苗等奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 pET-28a表達(dá)載體和BL21(DE3)宿主菌為本實(shí)驗(yàn)室保存。EDⅢ-F，EDⅢ-R引物合成及測(cè)序由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成；限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和XhoⅠ，Ex-Taq聚合酶、連接試劑盒及反轉(zhuǎn)錄試劑盒，購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；JEV兔源多克隆抗體由本實(shí)驗(yàn)室保存；羊抗兔二抗，購(gòu)自北京博奧星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2 方法

1.2.1 引物合成 根據(jù)GenBank登錄JEV株SA-14-14-2 EDⅢ序列合成一對(duì)引物，序列如下：

EDⅢ-F：5′- ccggaattcgacaaactggctctgaaag-3′(下劃線為EcoRⅠ酶切位點(diǎn))。

EDⅢ-R：5′- atactcgagcgtgcttccagctttgtg-3′(下劃線為XhoⅠ酶切位點(diǎn))。

1.2.2 EDⅢ基因的擴(kuò)增及pET-28a載體的構(gòu)建

根據(jù)TRIZol試劑盒說明書提取JEV RNA，合成cDNA的條件如下：模板RNA 10μL，EDⅢ-R引物1μL,70 ℃水浴10 min,冰上放置5 min,加6 μL預(yù)混液(4uL 5×Buffer,1μL dNTP,0.5 μL RNase inhibitor, 0.5 μL M-MLV)42 ℃水浴1 h，72 ℃滅活10 min。進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min;94 ℃30 s,53 ℃ 40 s,72 ℃45 s,30個(gè)循環(huán)72 ℃延伸10 min。用1%瓊脂糖凝膠分析擴(kuò)增產(chǎn)物，EcoRⅠ和XhoⅠ酶切回收EDⅢ和pET-28a，連接，轉(zhuǎn)化EcoliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞。挑取單菌落，菌液PCR，提質(zhì)粒和酶切鑒定重組載體，測(cè)序，保留陽(yáng)性菌種。

1.2.3EcoliBL21(DE3)的誘導(dǎo)表達(dá) 取鑒定正確的菌種過夜培養(yǎng)，按1∶100比例加入新鮮LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，當(dāng)OD600=0.4～0.6時(shí)，加入IPTG終濃度為0.5 mmol/L，誘導(dǎo)8 h。10 000 r/min離心1 min收集菌體，PBS溶解，超聲破碎，收集沉淀，加入 5×SDS上樣緩沖液進(jìn)行樣品處理，取上述樣品做SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍(lán)染色，最后脫色，觀察結(jié)果。

1.2.4 表達(dá)蛋白的純化 離心收集菌體，用50 mmol/L的PBS重懸菌液，超聲破碎(破碎5s，間隔5s，共10 r/min),10 000 r/min離心10 min，收集上清，鎳離子親和層析柱(Ni-NTA)純化蛋白，20 mmol/L咪唑漂洗液平衡鎳柱，最后用100 mmol/L咪唑洗脫液洗脫蛋白，收集洗脫液，取不同濃度咪唑洗脫液進(jìn)行SDS-PAGE分析。

1.2.5 Western-Blot檢測(cè)EDⅢ 按文獻(xiàn)[7]的方法進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR擴(kuò)增EDⅢ JEV的EDⅢ基因的RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠中電泳，結(jié)果大約在約330 bp處有一條電泳帶, 與預(yù)期片段大小相符(圖1)。

圖1 JEV EDⅢ基因的RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物1:標(biāo)準(zhǔn)DNA分子質(zhì)量； 2.EDⅢ基因RT-PCR產(chǎn)物

2.2 重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-EDⅢ的鑒定 將EDⅢ與表達(dá)載體pET-28a連接，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)，挑單菌落培養(yǎng)后,通過菌液PCR擴(kuò)增及重組質(zhì)粒酶切鑒定，可見2條分別為5 300 bp和330 bp左右的片段，與預(yù)期結(jié)果一致(圖2)。

圖2 重組質(zhì)粒pET-28a-EDⅢ的鑒定1,4：標(biāo)準(zhǔn)DNA分子質(zhì)量 ；2：菌液的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；3：重組質(zhì)粒pET-28a-EDⅢ的酶切產(chǎn)物；

2.3 表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE分析 鑒定的陽(yáng)性菌株EcoliBL21(DE3)經(jīng)0.5 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)8 h后，SDS-PAGE分析表達(dá)蛋白，結(jié)果大約在13 ku處有一條明顯的特異性蛋白條件，大小與預(yù)期結(jié)果相符(圖3)。

2.4 EDⅢ融合蛋白的純化 利用Ni-NTA agarose柱,通過親和層析純化EDⅢ融合蛋白，表達(dá)菌體BL21(DE3)經(jīng)沉淀、超聲、變性、純化得到EDⅢ蛋白，純化的蛋白透析和濃縮后，應(yīng)用紫外光吸收定量法測(cè)得蛋白濃度為1.9 g/L(圖4)。

圖3 EDⅢ蛋白的SDS-PAGE分析1：預(yù)染蛋白質(zhì)Marker; 2：未誘導(dǎo)的pET-28a-EDⅢ;3：誘導(dǎo)的pET-28a-EDⅢ

圖4 EDⅢ融合蛋白的純化1：預(yù)染蛋白質(zhì)Marker; 2：流穿樣品r； 3,4： 平衡Buffer；5-9：洗脫的蛋白

2.5 Wetsrn-Blot檢測(cè)EDⅢ蛋白 表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)過純化、濃縮后，經(jīng)過Western-Blot分析，結(jié)果與JEV兔源多克隆抗體呈現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)，而且無非特異性條帶，顯示表達(dá)產(chǎn)物的抗原性較好(圖5)。

圖5 表達(dá)產(chǎn)物的Western-Blot 分析1：預(yù)染蛋白質(zhì)Marker； 2：EDⅢ蛋白； 3：陰性對(duì)照

3 討論

乙腦是由乙腦病毒經(jīng)三帶喙庫(kù)蚊等蚊蟲叮咬傳播而引起的一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的急性傳染病，也是一種人獸共患的自然疫源性疾病。豬感染乙腦后，其主要特征為高熱、流產(chǎn)、死胎和公豬睪丸炎,因此對(duì)養(yǎng)豬業(yè)也造成重大的經(jīng)濟(jì)損失。

為了減少養(yǎng)豬業(yè)的經(jīng)濟(jì)損失，應(yīng)在潛伏期或更早階段進(jìn)行檢測(cè)和鑒別診斷，以便進(jìn)行積極預(yù)防。乙腦病毒E囊膜結(jié)構(gòu)蛋白分為3個(gè)抗原域，其中EDⅢ區(qū)域8有中和抗原表位、可作為黃病毒科血清學(xué)診斷抗原及免疫接種該蛋白可抗病毒。Senji Tafuku9等人用大腸桿菌表達(dá)JEV的EDⅢ蛋白免疫小鼠，具有保護(hù)作用。本研究將EDⅢ基因定向克隆到pET-28a載體中，轉(zhuǎn)到入BL21(DE3)菌，對(duì)表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)過可溶性鑒定，以可溶的形式存在，Ni-NTA純化的EDⅢ蛋白，經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)，純度可達(dá)到95%以上。通過Western-Blot鑒定，在13 ku處有條帶，與預(yù)期結(jié)果相符。表達(dá)的蛋白能與JEV的兔源多克隆抗體反應(yīng)，表明具有較好的反應(yīng)原性，這為以后作為診斷試劑及新型疫苗奠定基礎(chǔ)。

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ProkaryoticExpression,PurificationandActivityDetectionofPorcineJEVEDⅢProtein

ZHANG Er-qin1，2, TENG Man1, LUO Jun1, ZHAO Meng-meng2, XU Qian-ru2, ZHAO Dong1,DENG Rui-guang1, ZHANG Gai-ping2

(1.Henan Key Laboratory of Animal Immunology,Key Laboratory of Animal Immunology of the Ministry of Agriculture,Henan Academy of Agricultural Science, Zhengzhou 450002,China ； 2.College of Animal Scinece and Veterinary Medicine,Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002,China)

EDⅢ protein of Japanese encephalitis virus(JEV) was expressed, purified and identified in Escherichia coli BL21(DE3).The gene encoding EDⅢ protein was amplified with RT-PCR and the constructed recombinant plasmid pET28a-EDⅢ was transformed into BL21(DE3). EDⅢ solubility protein by IPTG was expressed, purified by Ni-NTA affinity chromatography and identified by SDS-PAGE and western-blot.The result showed that the recombinant plasmid pET28a-EDⅢ was successfully constructed, expressed in Escherichia coli BL21(DE3).The purified protein by Ni-NTA affinity chromatography possessed reactivity with its specific antibody confirmed by western-blot.

Japanese encephalitis virus ； domain Ⅲof envelope protein ; expression protein

ZHANG Gai-ping

S852.65+1

A

0529-6005(2017)09-0028-03

2016-12-16

河南省博士后科研資助項(xiàng)目(2013047)；河南省科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目(152102110127)；河南省農(nóng)業(yè)科技推廣財(cái)政補(bǔ)助資金項(xiàng)目(YCN201519111)

張二芹(1976-)，女，副教授，博士，主要從事動(dòng)物分子病毒學(xué)及轉(zhuǎn)基因植物疫苗的研究，E-mail:zhangerqin76@163.com

張改平，E-mail:zhanggaiping2003@163.com