劉 煒 ，丁小霞 ，李培武 ，喻 理 ，雷紹榮 ，楊小鳳

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所，湖北武漢430062；2.農(nóng)業(yè)部油料作物生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢430062；3.農(nóng)業(yè)部油料產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室（武漢），湖北武漢430062；4.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院分析測(cè)試中心，四川成都610066）

花生中白藜蘆醇含量測(cè)定的前處理方法優(yōu)化

劉 煒1，2，3，4，丁小霞1，2，3，李培武1，2，3，喻 理1，2，3，雷紹榮4，楊小鳳4

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所，湖北武漢430062；2.農(nóng)業(yè)部油料作物生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢430062；3.農(nóng)業(yè)部油料產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室（武漢），湖北武漢430062；4.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院分析測(cè)試中心，四川成都610066）

通過比較溶劑直接提取法、高速離心提取法和固相萃取柱提取法3種不同的前處理方法對(duì)花生樣品進(jìn)行處理，采用高效液相色譜法（HPLC）對(duì)處理后樣品中的白藜蘆醇含量進(jìn)行測(cè)定，研究并優(yōu)化花生中白藜蘆醇含量測(cè)定的前處理方法。結(jié)果表明，固相萃取柱提取法效果好，回收率高，該方法的檢出限為0.08 mg/kg，加標(biāo)回收率在96.9%～101.0%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）在1.5%～2.1%。

花生；白藜蘆醇；前處理方法；高效液相色譜法

1 材料和方法

1.1 材料

供試材料為純度≥98%的白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品，由德國Dr.Ehrenstorfer公司生產(chǎn)。

1.2 試劑

Waters-2695高效液相色譜儀，儀器配Waters-2998光電二極管陣列檢測(cè)器；德國IKA T18 basic勻漿機(jī)；湘儀TDZ5-WS離心機(jī)；美國N-EVAP-111氮吹濃縮儀；乙腈（色譜純）；無水乙醇（分析純）；氧化鋁分層柱（0.074～0.149 mm）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；純凈水；0.45 μm有機(jī)濾膜。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 稱取白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品50.0 mg置于50 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度,制成質(zhì)量濃度為1 000 mg/L的白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)貯備液，保存于4℃。臨用時(shí)，用甲醇稀釋成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)使用液。

標(biāo)準(zhǔn)工作液系列的配制：甲醇稀釋白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)貯備液得到 0.1，0.5，1.0，2.0，5.0，7.0，10.0 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3.2 樣品前處理 方法一（國標(biāo)法）：溶劑直接提取。稱取5.0 g花生粉狀樣品于100 mL離心管中，加入85%乙醇水溶液60 mL，再置于80℃水浴45 min，不時(shí)振搖。冷卻后用濾紙過濾，殘?jiān)蒙倭?5%乙醇水溶液洗滌后合并提取液，并定容至100 mL。吸取2 mL濾液，于5 000 r/min離心5 min，上清液待用[16]。

方法二：高速離心提取。稱取5.0 g花生粉狀樣品于100 mL離心管中，加入85%乙醇水溶液10 mL高速勻漿2 min后，于4 000 r/min離心10 min。將上清液轉(zhuǎn)入50 mL容量瓶中。殘?jiān)謩e用5 mL 85%乙醇水溶液提取2次后合并提取液，并定容至50 mL。搖勻后用0.45 μm濾膜過濾，待用[17]。

方法三：固相萃取柱提取。稱取5.0 g花生粉狀樣品于50mL離心管中，加入85%乙醇水溶液40mL置于80℃水浴45 min，不時(shí)振搖。放置過夜后吸取8 mL上清液過氧化鋁層析柱，收集濾液到10 mL刻度管。40℃氮吹濾液至1 mL，用0.45 μm濾膜過濾，待用。

1.3.3 高效液相色譜條件 色譜柱條件為Waters C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱溫為40℃；檢測(cè)波長為306 nm；流動(dòng)相A為乙腈；流動(dòng)相B為水；進(jìn)樣量為10 μL；檢測(cè)器為二極管陣列檢測(cè)器。梯度洗脫條件列于表1。

表1 梯度洗脫條件

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程的建立

在試驗(yàn)條件下，采集甲醇配制的7個(gè)不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品信號(hào)繪制其標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，白藜蘆醇在質(zhì)量濃度為0.1～10 mg/L時(shí)，質(zhì)量濃度（C，mg/L）與其峰面積（A）呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)大于0.999。白藜蘆醇的相關(guān)系數(shù)和檢出限列于表2。

表2 線性關(guān)系試驗(yàn)結(jié)果

2.2 方法檢出限（LOD）與定量限（LOQ）比較

按“步驟 1.2.1，1.2.2，1.2.3”3 種前處理方法得出的檢出限（LOD）和定量限（LOQ）列于表3。三者比較，固相萃取柱提取法的檢出限和定量限最低，可以更好地測(cè)定花生中的白藜蘆醇。

表3 檢出限和定量限數(shù)據(jù)

2.3 方法重復(fù)性和準(zhǔn)確度比較

在花生粉碎樣品中添加混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，使添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1.0，5.0，10.0 mg/kg。每個(gè)濃度水平重復(fù) 5 次，分別按照“按步驟 1.2.1，1.2.2，1.2.3”3 種前處理方法處理樣品，進(jìn)行精密度與準(zhǔn)確度的測(cè)定，3種添加濃度的方法重復(fù)性及回收率列于表4，3種前處理方法兩兩之間的加標(biāo)回收率差異均較大，且回收率溶劑直接提取法一＜高速離心提取法二＜固相萃取柱提取法，固相萃取柱提取法的加標(biāo)回收率高于其余2種方法，重復(fù)性好于其余2種方法。

表4 樣品添加回收和重復(fù)性試驗(yàn)（n＝5）

3 討論與結(jié)論

本研究通過比較3種前處理方法的檢出限、定量限、回收率和精密度發(fā)現(xiàn)，固相萃取柱提取法在獲得最佳凈化效果的同時(shí)可得到最佳的回收率，綜合考慮，固相萃取柱提取法優(yōu)于高速離心法，而高速離心法優(yōu)于溶劑直接提取法。因?yàn)榘邹继J醇難溶于水[18]，易溶于乙醚、甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯等有機(jī)溶劑[19]，對(duì)白藜蘆醇的提取率由低到高依次為丙酮＜無水乙醇＜甲醇＜乙醚＜乙酸乙酯，因?yàn)橐掖季哂袩o毒、安全、價(jià)格低廉、易得、易回收的特點(diǎn)[20]，選擇乙醇作為提取白藜蘆醇的試劑較適宜。溶劑直接提取法提取試劑消耗量大，且提取效率不高。高速離心法乙醇提取白黎蘆醇的提取率略低于固相萃取柱提取法，但提取試劑消耗較高，提取不完全。固相萃取柱提取法用85%乙醇作為提取劑，經(jīng)過80℃高溫提取，靜置過夜，可以讓白藜蘆醇與萃取劑充分接觸，提高萃取效率。由于白藜蘆醇在植物組織中含量很低，并且粗提物中含有大量的雜質(zhì)，如大黃素等蒽醌類化合物，必須對(duì)其進(jìn)行分離純化，以得到高純度的白藜蘆醇，中性氧化鋁作為分離介質(zhì)，利用其特有的吸附層析作用，可以將白藜蘆醇與花生樣品中的其他雜質(zhì)實(shí)現(xiàn)有效分離，且對(duì)白藜蘆醇不會(huì)造成死吸附，樣品損失少且提取率高。花生樣品經(jīng)過提取凈化后，采用氮吹濃縮儀對(duì)提取劑進(jìn)行濃縮，可達(dá)到良好的富集效果。

通過比較溶劑直接提取、高速離心提取、固相萃取柱提取法3種不同的前處理方法對(duì)花生樣品進(jìn)行處理，采用高效液相色譜法（HPLC）對(duì)處理后樣品中的白藜蘆醇含量進(jìn)行測(cè)定，最終證明固相萃取柱提取法效果好，回收率高，方法的的檢出限為0.08 mg/kg，加標(biāo)回收率在96.9%～101.0%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）在1.5%～2.1%。

［1］宋海南，錢善軍，劉瑋.虎杖中白藜蘆醇的提取及分析檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展[J].廣州化工，2014，42（21）：18-82.

［2］余淑嫻，鄭湘娟，胡六根，等.白藜蘆醇及其檢測(cè)方法的研究[J].江西科學(xué)，2006，24（2）：210-213.

［3］李潔，熊興耀，曾建國，等.白藜蘆醇的研究進(jìn)展[J].中國現(xiàn)代中藥，2013，15（2）：100-108.

［4］ SIEMANN E H，CREASY L L.Concentration of the phytoalexin resveratrol in wine[J].Enologyand Viticulture，1992，43（1）：49-52.

［5］CARUSO F，TANSKI J A，VILLEGAS ESTRADA，et al.Structural basis for antioxidant activity of trans-resveratrol：Ab initio calculations and crystal and molecular structure[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，2004，52（24）：7279-7285.

［6］牛培勤，郭傳勇.白藜蘆醇藥理作用的研究進(jìn)展[J].醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2006，25（6）：524-525.

［7］汪開拓，馬莉，盧霞.超聲波輔助提取葡萄皮渣中白藜蘆醇工藝的優(yōu)化研究[J].西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2013，26（3）：1201-1206.

［8］陳瓊玲，劉紅芝，劉麗，等.高壓-微波法提取花生根中自藜蘆醇[J].食品科學(xué)，2013，34（20）：41-48.

［9］王林，何宗琴，鄭在，等.酶法提取虎杖中白藜蘆醇的工藝優(yōu)化[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41（8）：3339-3340，3381.

［10］李燕，劉軍海.白藜蘆醇提取及分離純化研究進(jìn)展[J].糧食與油脂，2009（5）：37-41.

［11］張烜，胡君萍，韓玫，等.HPLC法測(cè)定花生不同部位中白藜蘆醇的含量[J].新疆醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，26（5）：440-441.

［12］王琴飛，應(yīng)東山，洪彩香，等.HPLC測(cè)定黃曲霉菌侵染后花生種子中 6種芪化物 [J].中國油料作物學(xué)報(bào)，2013，35（4）：428-435.

［13］侯建波，謝文，史穎珠，等.高效液相色譜法測(cè)定進(jìn)口葡萄酒中的白藜蘆醇及其甙 [J].理化檢驗(yàn)（化學(xué)分冊(cè)），2015，51（7）：938-942.

［14］周雅琴，樊溪源，周小雷，等.不同產(chǎn)地虎杖中白藜蘆醇與白藜蘆醇苷含量測(cè)定[J].醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2012，31（5）：632-634.

［15］姜瑞清，黎繼烈.白藜蘆醇分離純化及檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展[J].中藥材，2007，30（3）：367-371.

［16］南京財(cái)經(jīng)大學(xué)，江南大學(xué).GB/T 24903—2010 糧油檢驗(yàn) 花生中白藜蘆醇的測(cè)定 高效液相的色譜法[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2010.

［17］四川省農(nóng)科院分析測(cè)試中心，農(nóng)業(yè)部食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心（成都）.NY/T 2641—2014 植物源性食品中白藜蘆醇和白藜蘆醇苷的測(cè)定 高效液相色譜法[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2014.

［18］黃衛(wèi)文，黃壽恩，黎繼烈，等.白藜蘆醇的提取、檢測(cè)技術(shù)及其生物活性研究進(jìn)展[J].食品與機(jī)械，2010，26（6）：148-152.

［19］單輝君，張名位，張瑞芬，等.花生根中自藜蘆醇提取工藝的優(yōu)化[J].農(nóng)業(yè)機(jī)械學(xué)報(bào)，2008，39（2）：93-97.

［20］李燕，劉軍海.白藜蘆醇提取及分離純化研究進(jìn)展[J].糧食與油脂，2009（5）：37-41.

Optimization of Pretreatment Methods for Determination of Resveratrol in Peanut

LIUWei1，2，3，4，DINGXiaoxia1，2，3，LI Peiwu1，2，3，YULi1，2，3，LEI Shaorong4，YANG Xiaofeng4
（1.Institute of Oil Crops，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Wuhan 430062，China；2.Key Laboratory of Biology and Genetic Breeding of Oil Crops，Ministry of Agriculture，Wuhan 430062，China；3.Laboratory of Risk Assessment for Oilseeds Products（Wuhan），Ministry of Agriculture，Wuhan 430062，China；4.Analysis and Testing Center，Sichuan Academy of Agricultural Sciences，Chengdu 610066，China）

After comparing the recoveries of 3 different sample pretreatment methods,the levels of resveratrol content in samples were detected by High Performance Liquid Chromatography,and studied and optimized the pretreatment method for the determination of resveratrol contents of in peanuts.The results showed that the solid phase extraction method gave the best recovery data,the method detection limit was 0.08 mg/kg,the recovery was 96.9%-101.0%and the relative standard deviation was 1.5%-2.1%.

peanut；resveratrol;pretreatment method;high performance liquid chromatography

O65

A

1002-2481（2017）10-1695-03

10.3969/j.issn.1002-2481.2017.10.29

白藜蘆醇（resveratrol，Res）是非黃酮類的多酚化合物，是許多植物受到生物或非生物脅迫時(shí)產(chǎn)生的一種植物抗毒素[1]。1939年人類首次發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇，1940年日本人Tokaoka首次從毛葉藜蘆（Veratrum grangiflorum）的根部分離得到白藜蘆醇[2]。白藜蘆醇有順式和反式2種結(jié)構(gòu)，其中，反式白藜蘆醇的生理活性強(qiáng)于順式白藜蘆醇，在植物中主要以反式白藜蘆醇存在，紫外照射可使反式白藜蘆醇轉(zhuǎn)換為順式白藜蘆醇[3]。近年來的研究表明，白藜蘆醇具有抗腫瘤、抗氧化[4]、抗自由基[5]、保護(hù)肝臟、保護(hù)心血管等功能，其中，最令人矚目和最有發(fā)展前景的是能夠抑制某些癌細(xì)胞的生長、發(fā)生和增殖，因此，被譽(yù)為繼紫杉醇之后又一新的綠色抗癌藥物。此外，白黎蘆醇具有調(diào)節(jié)免疫、抗病毒、抗細(xì)菌及真菌、抗變態(tài)反應(yīng)、輻射防護(hù)、預(yù)防急性傳染性非典型肺炎（非典）等藥用價(jià)值[6]。因此，研究和提取植物中的白藜蘆醇至關(guān)重要。目前，國內(nèi)外有關(guān)植物中白藜蘆醇提取分析的研究報(bào)道很多，涉及到的前處理和檢測(cè)方法也越來越多、越來越先進(jìn)[7-10]。高效液相色譜法具有高靈敏度、高效能和高速度的特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于葡萄酒、虎杖、花生等樣品中白藜蘆醇的檢測(cè)[11-14]。HPLC法測(cè)定白藜蘆醇的含量，樣品前處理方法的不同將直接影響測(cè)定結(jié)果[15]。目前，對(duì)花生中白藜蘆醇的檢測(cè)方法基本采用GB/T 24903—2010《糧油檢驗(yàn)花生中白藜蘆醇的測(cè)定高效液相色譜法》，該法采用乙醇水溶液直接提取白藜蘆醇后上機(jī)測(cè)定，未考慮花生中油脂類雜質(zhì)在乙醇水溶液中溶解性好的特點(diǎn)對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響。

本試驗(yàn)結(jié)合GB/T 24903—2010標(biāo)準(zhǔn)優(yōu)化前處理方法，對(duì)花生中含有大量油脂類物質(zhì)和白藜蘆醇含量較低等因素進(jìn)行研究，以建立提取效果好、回收率高、重復(fù)性好的檢測(cè)方法。

2017-05-18

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31601573）；四川省財(cái)政創(chuàng)新能力提升工程項(xiàng)目（2017QNJJ-022，2015QNJJ-037）

劉 煒（1988-），女，重慶開縣人，研究實(shí)習(xí)員，主要從事食品安全分析研究工作。丁小霞為通信作者。