邰苗苗，吳小葉，杜海燕，孟繁榮，張春香，任有蛇

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山西太谷030801；2.朔州市平魯區(qū)畜牧獸醫(yī)局，山西平魯036800）

山羊附睪頭細(xì)胞轉(zhuǎn)染中新霉素和嘌呤霉素的濃度篩選

邰苗苗1，吳小葉2，杜海燕1，孟繁榮1，張春香1，任有蛇1

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山西太谷030801；2.朔州市平魯區(qū)畜牧獸醫(yī)局，山西平魯036800）

通過(guò)對(duì)9月齡黑山羊附睪頭細(xì)胞進(jìn)行不同濃度、不同時(shí)間新霉素和嘌呤霉素的處理，收集各個(gè)時(shí)間的細(xì)胞并進(jìn)行計(jì)數(shù)，旨在研究山羊附睪頭細(xì)胞對(duì)新霉素和嘌呤霉素的耐受濃度。結(jié)果顯示，山羊附睪頭細(xì)胞在轉(zhuǎn)染時(shí)對(duì)新霉素和嘌呤霉素適宜的質(zhì)量濃度分別為400，2 μg/mL；試驗(yàn)細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果與細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)相一致，山羊附睪細(xì)胞與其他哺乳動(dòng)物不同組織器官對(duì)新霉素和嘌呤霉素的耐受濃度基本一致。研究結(jié)果可為后期基因敲除和過(guò)表達(dá)載體轉(zhuǎn)染進(jìn)山羊附睪頭細(xì)胞時(shí)抗性基因濃度的確定提供了參考，也為后期基因功能的研究奠定了基礎(chǔ)。

山羊附睪頭細(xì)胞；新霉素；嘌呤霉素

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用黑山羊飼養(yǎng)于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院試驗(yàn)基地，以9月齡公羊附睪頭細(xì)胞作為試驗(yàn)材料。

1.2 主要試劑

細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM/F12，無(wú)菌PBS，胰蛋白酶，青鏈霉素混合液，HEPES液（博士德生物公司）；嘌呤霉素（美國(guó)Sigma公司），新霉素（即G418，美國(guó)Amresco公司），胎牛血清（澳洲Gibco公司生產(chǎn)，購(gòu)自北京博雅宏興科技發(fā)展有限公司），Guava Via-Count Reagent（北京強(qiáng)欣博瑞生物技術(shù)有限公司），GuavaRInstrument Cleaning Fluid（北京強(qiáng)欣博瑞生物技術(shù)有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

將傳代至第3～4代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的山羊附睪頭細(xì)胞以50%密度鋪到96孔板中，換上含10%胎牛血清及100 U/mL青霉素和鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基，每孔添加100 μL細(xì)胞懸液，置于含5%CO2的37℃無(wú)菌恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。24 h后分別更換添加新霉素的不含青鏈霉素培養(yǎng)基，使其在細(xì)胞培養(yǎng)液的終質(zhì)量濃度分別為 0，50，100，200，400，600，800 μg/mL，每2 d換一次添加新霉素的培養(yǎng)基，每組 15 個(gè)重復(fù)，分別于 48，96，120，144，168 h 消化添加不同濃度新霉素的3個(gè)孔。采用Guava EasyCyte流式細(xì)胞儀進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)，選擇7～10 d細(xì)胞全部死亡的新霉素濃度為篩選濃度。

篩選嘌呤霉素時(shí)，添加不同濃度的嘌呤霉素，使嘌呤霉素的終質(zhì)量濃度分別為 0，1.0，2.5，5.0，7.5，10.0 μg/mL，每2 d換一次添加嘌呤霉素的培養(yǎng)基，每組9個(gè)重復(fù)，分別于24，48，72 h后消化添加不同濃度的嘌呤霉素的3個(gè)孔，采用Guava EasyCyte流式細(xì)胞儀進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)，選擇3～4 d細(xì)胞全部死亡的嘌呤霉素濃度為篩選濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同新霉素濃度對(duì)附睪頭活細(xì)胞的抑制效果

表1 不同新霉素濃度對(duì)附睪頭活細(xì)胞數(shù)目的影響（平均值） 個(gè)

試驗(yàn)結(jié)果顯示，新霉素處理48 h后，處理組質(zhì)量濃度為800 μg/mL時(shí)，細(xì)胞并未全部死亡，在使用新霉素處理細(xì)胞96，120 h后，細(xì)胞對(duì)新霉素的耐受質(zhì)量濃度分別為600，400 μg/mL；新霉素處理144，168 h后，細(xì)胞對(duì)新霉素的耐受質(zhì)量濃度均為200 μg/mL（表 1）。

在培養(yǎng)過(guò)程中，將新霉素處理過(guò)后每個(gè)時(shí)間段的細(xì)胞狀態(tài)都進(jìn)行拍照保存。圖1為新霉素終質(zhì)量濃度為200 μg/mL的細(xì)胞0～7 d的生長(zhǎng)狀態(tài)。從圖1可以看出，最初新霉素對(duì)附睪頭細(xì)胞未產(chǎn)生抑制效果，隨著添加新霉素時(shí)間的延長(zhǎng)，活細(xì)胞越來(lái)越少，細(xì)胞形態(tài)也有所變化。在添加新霉素144 h后，細(xì)胞形態(tài)異常，細(xì)胞全部變圓，未呈現(xiàn)正常的鵝卵石狀，且細(xì)胞核增大，細(xì)胞質(zhì)變渾濁。

2.2 不同嘌呤霉素濃度對(duì)附睪頭活細(xì)胞的抑制效果

從表2可以看出，嘌呤霉素處理附睪頭細(xì)胞24 h后，不同質(zhì)量濃度的嘌呤霉素能夠殺死部分細(xì)胞，但即使嘌呤霉素質(zhì)量濃度高達(dá)10 μg/mL，也未能使細(xì)胞全部死亡；嘌呤霉素處理附睪頭細(xì)胞48 h后，5.0 μg/mL的嘌呤霉素組細(xì)胞就已全部死亡；嘌呤霉素處理附睪頭細(xì)胞72 h后，細(xì)胞對(duì)嘌呤霉素的耐受質(zhì)量濃度是1.0 μg/mL。

表2 不同嘌呤霉素質(zhì)量濃度對(duì)附睪頭活細(xì)胞數(shù)目的影響（平均值） 個(gè)

在添加不同質(zhì)量濃度的嘌呤霉素之后，不同時(shí)間段細(xì)胞狀態(tài)不同。圖2為嘌呤霉素終質(zhì)量濃度為1 μg/mL時(shí)0～3 d細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)。由圖2可知，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，維持正常形態(tài)的細(xì)胞數(shù)越來(lái)越少，添加1 μg/mL嘌呤霉素72 h后，細(xì)胞形態(tài)異常，細(xì)胞全部變圓，細(xì)胞核變大，不再是鵝卵石樣的細(xì)胞。

3 討論

利用基因敲除模型和基因過(guò)表達(dá)模型，借助序列分析平臺(tái)探究未知蛋白的功能是科學(xué)家對(duì)基因研究常用的方法[10]?；虻那贸瓦^(guò)表達(dá)需要以質(zhì)粒作為載體[11]，轉(zhuǎn)染進(jìn)山羊附睪頭細(xì)胞中對(duì)目的基因進(jìn)行剪切或者過(guò)量表達(dá)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染分為瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染[12]，本研究構(gòu)建基因敲除模型和過(guò)表達(dá)模型是為了將外源基因整合到真核細(xì)胞基因組中，使基因被敲除的細(xì)胞和基因過(guò)量表達(dá)的細(xì)胞能夠穩(wěn)定傳遞給后代細(xì)胞。轉(zhuǎn)染細(xì)胞的打靶載體一般會(huì)以腐草霉素、嘌呤霉素、潮霉素和新霉素等作為正篩選基因[9]。真核細(xì)胞中表達(dá)新霉素抗性基因的細(xì)胞能夠在含有新霉素的培養(yǎng)液中正常生長(zhǎng)，而沒(méi)有表達(dá)新霉素抗性基因的細(xì)胞，則會(huì)被新霉素抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)，從而導(dǎo)致細(xì)胞的死亡，這樣轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞就會(huì)被留下來(lái)，而轉(zhuǎn)染失敗的陰性細(xì)胞在篩選過(guò)程中就會(huì)死亡，不會(huì)對(duì)細(xì)胞模型的穩(wěn)定遺傳造成影響。

新霉素（Neomycin）是一種水溶性抗生素，屬于2-脫氧胺氨基糖苷類(lèi)抗生素[13]，其主要作用于細(xì)菌30S亞單位，抑制蛋白質(zhì)的合成，從而殺死細(xì)菌[14]；對(duì)于真核細(xì)胞，主要通過(guò)破壞細(xì)胞內(nèi)的溶酶體來(lái)?yè)p壞細(xì)胞[15]。而嘌呤霉素則是使DNA鏈斷裂，它與50S亞基A部位結(jié)合，抑制氨酰-tRNA的進(jìn)入，從而引起肽鏈合成的過(guò)早終止，一般2 d左右即可開(kāi)始發(fā)揮作用[9]。由此看來(lái)，新霉素對(duì)細(xì)胞的破壞需要較長(zhǎng)時(shí)間才能夠使細(xì)胞全部死亡，而嘌呤霉素作用時(shí)間就相對(duì)較短，這與本試驗(yàn)結(jié)果相吻合。有研究表明，人足細(xì)胞嘌呤霉素篩選質(zhì)量濃度為1.5 μg/mL[16]或1 μg/mL[17]；人乳腺癌BT549細(xì)胞嘌呤霉素篩選質(zhì)量濃度為3 μg/mL[18]；人牙髓干細(xì)胞嘌呤霉素篩選質(zhì)量濃度為2 μg/mL[19]；小鼠胚胎干細(xì)胞對(duì)新霉素的篩選質(zhì)量濃度為400 μg/mL[20]；山羊胎兒成纖維細(xì)胞對(duì)新霉素的篩選質(zhì)量濃度為400 μg/mL[12]，本研究在山羊附睪頭細(xì)胞上得到的結(jié)果與之基本一致。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，新霉素處理細(xì)胞第7天，細(xì)胞全部死亡的質(zhì)量濃度為200μg/mL，嘌呤霉素處理第3天，細(xì)胞全部死亡的質(zhì)量濃度為1 μg/mL。為保證篩選階段未轉(zhuǎn)染細(xì)胞能夠全部死亡，將其篩選質(zhì)量濃度變?yōu)樵瓉?lái)的2倍[3]，即新霉素篩選質(zhì)量濃度為 400 μg/mL，嘌呤霉素篩選質(zhì)量濃度為 2 μg/mL。

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Screening of Neomycin and Puromycin Concentration in Transfection of Goat Epididymal Caput Cells

TAI Miaomiao1，WU Xiaoye2，DU Haiyan1，MENG Fanrong1，ZHANG Chunxiang1，REN Youshe1
（1.College of Animal Science and Veterinary Medicine，Shanxi Agricultural University，Taigu 030801，China；2.Bureau of Animal Husbandry and Veterinary in Pinglu District Shuozhou City，Pinglu 036800，China）

This research was designed to study the tolerance of goat epididymal cells to neomycin and puromycin.The cells of different time were collected and counted at different concentrations of neomycin and puromycin.The results showed that the appropriate concentrations of goat epididymal cells to neomycin and puromycin were 400,2 μg/mL,respectively.The results of this test cell count consistent with the cell growth status,and the tolerance to neomycin and puromycin of goat epididymal cells and other mammalian cells of different tissues and organs was consistent.The results of this study will provide a reference for gene knockout and the determination of resistance genes of overexpression vector transfection into the goat epididymal cells,and to provide a basis for the study of the gene function.

goat epididymal caput cells;neomycin;puromycin

S814

A

1002-2481（2017）10-1691-04

10.3969/j.issn.1002-2481.2017.10.28

黑山羊是山西優(yōu)良的地方山羊品種，具有適應(yīng)性強(qiáng)、耐粗飼、易抓膘、抗病抗逆、肉質(zhì)好等特點(diǎn)[1]。為了深入研究黑山羊的繁殖性能，在對(duì)山羊睪丸和附睪頭差異表達(dá)基因的分析中發(fā)現(xiàn)，與睪丸相比，附睪頭中表達(dá)量上調(diào)比例最大的前10位基因中有7個(gè)是β防御素，其中，山羊β防御素124（Goat beta-defensin 124，gDB124）基因的上調(diào)比例最高[2]。為了深入研究β防御素124在山羊附睪頭中的功能，本研究對(duì)山羊附睪頭細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，分別構(gòu)建了gDB124敲除載體和gDB124過(guò)表達(dá)載體。為了篩選基因成功敲除及過(guò)表達(dá)的細(xì)胞，需要對(duì)載體上的抗性基因細(xì)胞耐受濃度進(jìn)行初步篩選[3]。

動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)開(kāi)始出現(xiàn)于20世紀(jì)，其目前已成為生物、醫(yī)學(xué)研究及應(yīng)用中廣泛采用的一種方法[4]。睪丸中產(chǎn)生的精子是不具備受精能力的[5]，其是在附睪微環(huán)境中獲得運(yùn)動(dòng)能力和受精能力的，因此，附睪上皮細(xì)胞的培養(yǎng)，需要考慮附睪管腔內(nèi)附睪液和精子等因素[6]。附睪體外模型的建立是從1995年大鼠附睪上皮的培養(yǎng)開(kāi)始發(fā)展并逐漸成熟起來(lái)的[7]。

本研究中過(guò)表達(dá)載體上的抗性基因?yàn)樾旅顾?，敲除載體上的抗性基因?yàn)猷堰拭顾?。由于抗生素?duì)具有耐藥性的真核細(xì)胞篩選的濃度不同[8]，不同細(xì)胞系對(duì)嘌呤霉素和新霉素的耐受度不同。即使是同種抗生素，不同廠家及批次的抗生素濃度也可能存在差異[9]。如果抗生素濃度過(guò)高，會(huì)對(duì)敲除成功的細(xì)胞產(chǎn)生抑制甚至是殺死細(xì)胞，造成陽(yáng)性細(xì)胞過(guò)少，效率低下；如果抗生素濃度過(guò)低，則不能充分抑制未轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞，造成假陽(yáng)性。為了避免不同細(xì)胞系之間的耐受差異，并保證試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，本研究需要對(duì)嘌呤霉素和新霉素的篩選濃度進(jìn)行測(cè)試。

2017-05-12

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31572407）；山西省研究生教育創(chuàng)新項(xiàng)目（2017SY036）

邰苗苗（1993-），女，山西臨汾人，在讀碩士，研究方向：動(dòng)物遺傳育種與繁殖。任有蛇為通信作者。