朱 星 王若宇 汪 銳 白 雪 任龍飛 邵嘉慧 張小凡

(上海交通大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，上海 200240)

萘降解菌的分離鑒定、生長特性和降解途徑探究*

朱 星 王若宇 汪 銳 白 雪 任龍飛 邵嘉慧 張小凡#

(上海交通大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，上海 200240)

從天津大港油田附近污染土壤中分離出1株萘降解菌株DGN9，經(jīng)形態(tài)學(xué)和16SrDNA測序鑒定，該菌株屬于無色桿菌(Achromobactersp.)。其最適生長溫度為30 ℃，最適pH為7，最適萘初始質(zhì)量濃度為1 000mg/L，在NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%、2%的條件下生長良好，具有一定的耐鹽性。其對萘的可能降解途徑為水楊酸降解途徑。同時，該菌株對蒽、菲、芘、聯(lián)苯、對苯二甲酸、鄰苯二酚、苯酚、苯甲酸鈉、水楊酸、鄰苯二甲酸等底物也有降解作用，具有底物生長廣譜性。

萘 無色桿菌屬 生長特性 降解途徑

多環(huán)芳烴(PAHs)是指兩個或兩個以上苯環(huán)以線狀、角狀或簇狀排列的稠環(huán)有機(jī)化合物[1-2]，由于疏水性和穩(wěn)定性使其容易在人體內(nèi)富集，具有致癌、致畸和致突變效應(yīng)，是一類普遍存在于環(huán)境中的對生態(tài)環(huán)境和人體健康具有嚴(yán)重危害的難降解污染物[3]。1976年，美國環(huán)境保護(hù)署(USEPA)就已將16種PAHs列為優(yōu)先控制的有機(jī)污染物[4]。隨著研究的進(jìn)步，越來越多的PAHs被發(fā)現(xiàn)，因此尋求高效、經(jīng)濟(jì)、環(huán)保的PAHs去除方法顯得越來越重要。

目前，去除污水中PAHs的方法有物理、化學(xué)和生物方法[5]。物理方法因不能徹底降解PAHs，已逐漸被研究人員放棄；化學(xué)方法雖然能有效降解PAHs，但同時存在二次污染和高能耗等問題。利用微生物降解PAHs的生物方法具有經(jīng)濟(jì)、高效、二次污染少等優(yōu)勢，因此成為了去除污水中PAHs的理想方法。大量研究發(fā)現(xiàn)并分離了能以PAHs為碳源進(jìn)行降解的微生物[6]。萘是PAHs中結(jié)構(gòu)最簡單、分子量最小的一種化合物，一直是研究PAHs降解的典型。已報道的萘降解菌很多，主要有反硝化產(chǎn)堿菌(Alcaligenesdenitrificans)、分支桿菌(Mycobacteriumsp.)、惡臭假單胞菌 (Pseudomonasputida)、泡馕假單胞菌(Pseudomonasvesicularis)、熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)、紅球菌(Rhodococcussp.)和莫拉氏菌(Moraxellasp.)等[7-8]。這些萘降解菌株對鹽度要求比較苛刻，關(guān)于耐鹽性萘降解菌的分離研究還比較少。辛樹權(quán)等[9]篩選出了一株可在NaCl質(zhì)量濃度為3 g/L的條件下良好生長的萘降解菌。饒麗[10]發(fā)現(xiàn)的萘降解菌可在2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))NaCl下良好生長。

無色桿菌(Achromobactersp.)是已知的可用于降解多種難降解污染物的微生物，如石油、苯酚、氯酚和苯甲酸等。唐玉斌等[11]發(fā)現(xiàn)，木糖氧化無色桿菌可以降解蒽、菲、芘、4種PAHs，具有生長底物廣譜性。李妮等[12]從孔雀綠污染土壤中分離出1株無色桿菌，發(fā)現(xiàn)其還可高效脫除孔雀綠。目前，關(guān)于無色桿菌降解萘的研究不多。因此，探究無色菌株對萘的降解途徑及其廣譜性和耐鹽性對理解無色桿菌降解PAHs具有一定的指導(dǎo)意義。本研究從天津大港油田附近污染土壤中分離出1株萘降解菌，對其進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察和16S rDNA測序分析，探究其最佳生長條件，并在最佳條件下對萘的降解途徑進(jìn)行了研究，同時對其廣譜性和耐鹽性進(jìn)行了討論。

1 材料和方法

1.1 材 料

1.1.1 土 樣

土樣取自天津大港油田附近(38°43′48″N、117°30′36″E)，該處土壤長期受石油污染，采集深度為5～10 cm，采集到的土樣放入塑封袋中，密封，置于4 ℃冰箱保存。

1.1.2 培養(yǎng)基

無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基[13]：Na2HPO42.2 g、KH2PO40.8 g、(NH4)2SO44.95 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、FeSO4·7H2O 10 mg、CaCl2·2H2O 10 mg、酵母粉 50 mg、礦物液10 mL，H2O 1 000 mL。其中，每100 mL礦物液中含ZnSO4·7H2O 50 mg、MnSO4·5H2O 50 mg、Na2MoO4·2H2O 10 mg、CuSO4·5H2O 5 mg、H2O 100 mL。

無機(jī)鹽固體培養(yǎng)基在無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))瓊脂。

1.1.3 儀 器

安捷倫7890B/5977A氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC/MS)， HP-5MS毛細(xì)管色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；尼康E200光學(xué)顯微鏡；日立S-520掃描電子顯微鏡(SEM)；UV-1800紫外可見分光光度計；Thermo X1R高速離心機(jī)；MLS-3750高壓滅菌鍋。

1.2 方 法

1.2.1 菌株的富集與純化

取0.5 g土樣置于30 mL的蒸餾水中，在30 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)24 h，取上清液3 mL轉(zhuǎn)接到30 mL無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中，30 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)7 d以富集萘降解菌，分別在萘初始質(zhì)量濃度為100、300、500、500、500 mg/L時連續(xù)富集5次后，選擇菌落生長較好的樣品在無機(jī)鹽固體培養(yǎng)基上多次劃線分離純化，-80 ℃甘油保存，編號為DGN9。

1.2.2 菌種鑒定

在光學(xué)顯微鏡和SEM觀察的基礎(chǔ)上利用16S rDNA測序分析進(jìn)行鑒定。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)體系：DNA模板0.5 μL，10×Buffer 2.5 μL，dNTP 1 μL，DNA聚合酶0.2 μL, 10 μmol/L引物(27F 5’-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3’、1492R 5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)各 0.5 μL，加雙蒸水至25 μL；擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)后72 ℃修復(fù)延伸10 min，4 ℃終止反應(yīng)。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)測序后在美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)進(jìn)行blast 比對，通過MEGA 4.1計算遺傳距離，鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3 菌株的生長特性測定

菌株的生長特性包括最適生長溫度、最適萘初始濃度、最適pH、耐鹽性及生長曲線。測定最適生長溫度時，設(shè)置20、25、30、35 ℃ 4種不同溫度，pH為7，萘初始質(zhì)量濃度為500 mg/L；測定最適萘初始質(zhì)量濃度時，設(shè)置300、500、700、1 000、1 200、1 400 mg/L 6個梯度，溫度為30 ℃，pH為7；測定最適pH時，設(shè)置pH為6、7、8、9、10，萘初始質(zhì)量濃度為1 000 mg/L，溫度為30 ℃；測定菌株耐鹽性時，設(shè)置NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%、2%、4%、6%、8%，萘初始質(zhì)量濃度為1 000 mg/L，溫度為30 ℃，pH為7。以上試驗(yàn)均于250 mL的三角搖瓶(含90 mL無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基)中進(jìn)行，180 r/min搖床振蕩培養(yǎng)96 h，每隔12 h用紫外可見分光光度計在600 nm波長處測光密度(OD600)，每組試驗(yàn)平行3次。生長曲線測定于250 mL三角搖瓶(含90 mL無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基，萘初始質(zhì)量濃度為1 000 mg/L)中進(jìn)行，按10%(體積分?jǐn)?shù)，下同)的接種量接種菌株DGN9到90 mL無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中，30 ℃、180 r/min、pH=7條件下振蕩培養(yǎng)96 h，每隔8 h測一次OD600，平行3次，以不接種菌液作為空白(CK)對照。

1.2.4 菌株的萘降解效率測定

將對數(shù)期菌株按10%接種量接種到100 mL無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中(萘初始質(zhì)量濃度為1 000 mg/L)，30 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)，每隔24 h取培養(yǎng)液3 mL，測OD600并用正己烷按1∶1(體積比)萃取，無水硫酸鈉脫水，待GC/MS分析。色譜條件:載氣為He；進(jìn)樣量為1 μL；升溫程序?yàn)?0 ℃保持2 min，以15 ℃/min升至190 ℃保持2 min，3 ℃/min升至300 ℃保持2 min；質(zhì)譜條件：離子源溫度為230 ℃，檢測器溫度為315 ℃。

1.2.5 菌株的萘降解途徑

通過萘雙加氧酶的鐵硫蛋白質(zhì)大亞基基因(nahAC)[14]、水楊醛脫氫酶基因(nahF)[15]、水楊酸羥基化酶基因(nahG)[16]和兒茶酚2,3-雙加氧酶基因(nahH)[17]考察菌株的萘降解途徑。4種關(guān)鍵酶基因的PCR體系參照1.2.2，相應(yīng)的引物見表1。擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，32個循環(huán)后72 ℃修復(fù)延伸7 min。

表1 關(guān)鍵酶基因引物

1.2.6 菌株的底物特異性測定

將對數(shù)期菌株按10%接種量分別接種到30 mL含蒽、菲、芘、聯(lián)苯、對苯二甲酸、鄰苯二酚、苯酚、苯甲酸鈉、水楊酸、鄰苯二甲酸的無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中(質(zhì)量濃度均為500 mg/L)，在pH=7、30 ℃、180 r/min下振蕩培養(yǎng)7 d，測定OD600，平行3次。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株的鑒定

DGN9菌落呈圓形，表面輕微隆起，淡黃色，濕潤，半透明，邊緣整齊，光滑。革蘭氏染色為陰性，在光學(xué)顯微鏡下呈桿狀，SEM觀察如圖1所示。

16S rDNA的測序分析得到的系統(tǒng)發(fā)育樹表明，菌株DGN9與Achromobacterxylosoxidanssubsp. (GU0145)的同源性達(dá)到98.6%，與Achromobacterpulmonis(KT808881.1)的同源性為97.4%，可鑒定為無色桿菌。

圖1 DGN9的SEM圖Fig.1 SEM image of DGN9

2.2 菌株DGN9的生長特性

由圖2(a)可見，30 ℃的生長曲線OD600高于其他溫度，因此30 ℃為最適生長溫度；圖2(b)表明，萘初始質(zhì)量濃度為1 000 mg/L時，生長曲線的OD600高于其他濃度，因此最適萘初始質(zhì)量濃度為1 000 mg/L；圖2(c)表明，當(dāng)pH為7～9時，菌株DGN9生長良好，最適pH為7；如圖2(d)所示，NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%、2%條件下DGN9生長良好，說明DGN9具有一定的耐鹽性，但當(dāng)鹽濃度過高時菌株生長受到抑制。

DGN9在萘初始質(zhì)量濃度為1 000 mg/L的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中30 ℃、180 r/min、pH=7條件下培養(yǎng)96 h的生長曲線如圖3所示。前8 h為遲緩期，8～40 h為對數(shù)增長期，40～80 h為穩(wěn)定期，80 h后進(jìn)入衰亡期。

2.3 菌株DGN9的底物特異性

分別以蒽、菲、芘、聯(lián)苯、對苯二甲酸、鄰苯二酚、苯酚、苯甲酸鈉、水楊酸、鄰苯二甲酸為碳源，在pH=7、30 ℃、180 r/min條件下振蕩培養(yǎng)7 d后，培養(yǎng)基由透明變混濁，OD600明顯升高，測定結(jié)果如表2所示。由此可見，菌株DGN9可以不同有機(jī)物為碳源，具有底物生長廣譜性。

表2 DGN9的底物特異性

2.4 菌株DGN9的萘降解途徑

4種萘降解途徑的關(guān)鍵酶基因PCR擴(kuò)增結(jié)果如圖4所示。nahAC和nahG擴(kuò)增產(chǎn)物條帶清晰可見，nahF條帶比較模糊，沒有觀察到nahH的擴(kuò)增產(chǎn)物條帶。目前，已知的萘降解途徑主要有兩種：一種為水楊酸降解途徑；另一種為龍膽酸降解途徑，但龍膽酸降解途徑比較罕見[18-21]。由關(guān)鍵酶PCR擴(kuò)增結(jié)果可以判斷，菌株DGN9對萘的降解可能為水楊酸降解途徑，但不排除存在其他未知的降解途徑，有待進(jìn)一步深入研究。

圖2 菌株DGN9的生長特性Fig.2 Growth characteristics of DGN9

圖3 DGN9 的生長曲線Fig.3 Growth curve of DGN9

3 結(jié) 論

菌株DGN9鑒定為無色桿菌，其最佳生長條件為：最適生長溫度30 ℃、最適萘初始質(zhì)量濃度1 000 mg/L、最適pH為7，在NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%、2%的條件下可以生長良好。此外，菌株DGN9具有底物生長廣譜性，對萘降解途徑可能為水楊酸降解途徑。

圖4 萘降解途徑的關(guān)鍵酶基因PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.4 PCR amplification of key enzyme genes

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Isolation,identification,growthcharacteristicsanddegradationpathwayofnaphthalenedegradingbacteria

ZHUXing,WANGRuoyu,WANGRui,BAIXue,RENLongfei,SHAOJiahui,ZHANGXiaofan.

(SchoolofEnvironmentalScienceandEngineering,ShanghaiJiaoTongUniversity,Shanghai200240)

A naphthalene degrading bacteria DGN9 was isolated from Dagang Oil Field in Tianjin. Through morphological analysis and 16S rDNA sequence analysis,DGN9 was identified asAchromobactersp. Its optimum growth temperature was 30 ℃,optimum initial concentration of naphthalene was 1 000 mg/L,and optimum growth pH was 7. DGN9 could grow well when NaCl mass percentage was up to 1% or 2%. The possible degradation pathway might be salicylic acid pathway. The strain could also degrade anthracene,phenanthrene,pyrene,biphenyl,p-phthalic acid,catechol,phenol,sodium benzoate,salicylic acid and phthalic acid,covering a wide variety of substrates.

naphthalene;Achromobactersp.; growth characteristics; degradation pathway

10.15985/j.cnki.1001-3865.2017.04.007

2016-06-20)

朱 星，女，1992年生，碩士研究生，主要從事萃取生物膜反應(yīng)器處理難降解有機(jī)物的研究。#

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*國家自然科學(xué)基金資助項目(No.21577089)；上海交通大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新項目(No.IPP12175)。