姜麗，楊子平，包怡敏

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銀杏酮酯對(duì)急性血瘀證大鼠血流動(dòng)力學(xué)及心肌組織腫瘤壞死因子-α通路的影響

姜麗，楊子平，包怡敏

上海中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，上海 201203

觀察銀杏酮酯（GBE50）對(duì)急性血瘀證大鼠血流動(dòng)力學(xué)和心肌組織腫瘤壞死因子（TNF）-α通路的影響，探討其作用機(jī)制。采用皮下注射鹽酸腎上腺素復(fù)合冰水浴法制作大鼠急性血瘀證模型。將雄性SD大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組和GBE50組，灌胃相應(yīng)藥物干預(yù)11 d后造模。次日觀察各組血流動(dòng)力學(xué)變化，RT-PCR檢測(cè)心肌組織TNF-α、TNFR1、TNFR2 mRNA表達(dá)，放免法檢測(cè)心肌組織TNF-α蛋白表達(dá)，免疫組化檢測(cè)心肌組織TNFR1和TNFR2蛋白表達(dá)。模型組血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)呈現(xiàn)低于正常組的趨勢(shì)；與模型組比較，GBE50組左心室收縮峰壓平均值、左室發(fā)展壓明顯增大，室內(nèi)壓最大上升速率時(shí)間明顯減少（＜0.05），GBE50組心肌組織TNF-α、TNFR1、TNFR2蛋白表達(dá)明顯升高，TNFR2 mRNA表達(dá)明顯升高（＜0.05）。GBE50能改善急性血瘀證大鼠血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)，并對(duì)心肌組織TNF-α通路具有調(diào)控作用，增加保護(hù)性受體TNFR2表達(dá)可能是其保護(hù)心功能的機(jī)制之一。

銀杏酮酯；血瘀證；血流動(dòng)力學(xué)；腫瘤壞死因子-α；腫瘤壞死因子受體；大鼠

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血瘀證是臨床常見證型，與心腦血管疾病、腫瘤發(fā)生等密切相關(guān)。目前研究認(rèn)為，血瘀證生物學(xué)病理變化多反映在血液流變學(xué)方面，包括全血黏度、血漿黏度、血小板聚集性增強(qiáng)，體外血栓形成的干濕量及長(zhǎng)度增加，纖維蛋白原增高等[1]，但對(duì)血瘀證血流動(dòng)力學(xué)變化報(bào)道較少。臨床研究表明，血瘀證患者存在過度的炎癥反應(yīng)，且炎癥與血瘀證的病理、病機(jī)和治療等方面關(guān)系密切[2]。作為血瘀證發(fā)展過程中的炎癥反應(yīng)和心功能的橋梁因子，腫瘤壞死因子（TNF）-α在一定程度上決定血瘀證內(nèi)在病理機(jī)制的發(fā)展變化與轉(zhuǎn)歸[3]；而TNF-α主要通過與細(xì)胞表面的2種TNF受體（TNFR1、TNFR2）的結(jié)合，發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)[4]。銀杏酮酯（Ginkgo biloba extract 50，GBE50）是一種新型銀杏葉提取物制劑，具有活血化瘀、通脈舒絡(luò)的功效，臨床上主要用于各種疾病的血瘀證。我們前期實(shí)驗(yàn)研究顯示，GBE50能夠抗心肌缺血[5]、抗心律失常[6]、抗心肌缺血再灌注損傷[7]和抗衰老[8]等；對(duì)于急性血瘀證大鼠，GBE50能改善血液黏、濃、凝、聚狀態(tài)，降低血清TNF-α含量，調(diào)節(jié)免疫功能[9]。GBE50的作用機(jī)制與抗氧化應(yīng)激[10]、抑制炎癥反應(yīng)[11]和抗凋亡[12]等有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)觀察GBE50對(duì)急性血瘀大鼠血流動(dòng)力學(xué)和心肌組織TNF-α及其受體（TNFR1、TNFR2）的影響，探討GBE50改善血瘀證心功能和TNF-α通路在其中的作用。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物

清潔級(jí)健康雄性SD大鼠72只，38～40日齡，體質(zhì)量180～200 g，上海中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（滬）2008-0016。飼養(yǎng)于溫度（23±2）℃、相對(duì)濕度（55±10）%環(huán)境，自由攝食飲水。

1.2 藥物

GBE50，上海上藥杏靈科技藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)071008。其有效成分中銀杏總黃酮含量≥44%，黃酮醇苷≥24%，游離黃酮≥20%，銀杏內(nèi)酯≥6%，銀杏酸含量≤1 PPM；鹽酸腎上腺素注射液，天津金耀氨基酸有限公司，批號(hào)1107161。

1.3 主要試劑與儀器

焦碳酸二乙酯（DEPC，上海生物工程技術(shù)公司），羧甲基纖維素鈉（CMC-Na，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），cDNA合成試劑盒（Fermentas公司），Trizol（Invitrogen公司），SYBRGreen PCR試劑盒（上海捷瑞生物工程公司），TNF-α放射免疫分析試劑盒（北京普爾偉業(yè)生物科技有限公司），rabbit anti-TNFR1（Gene Tex，Irvine，CA），rabbit anti-TNFR2（CST，Danvers，MA）。RM6240BD生物信號(hào)采集系統(tǒng)（成都儀器廠），GC-911型放射免疫計(jì)數(shù)器（科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司），BH2顯微鏡（日本OLYMPUS），E4500數(shù)碼相機(jī)（日本NIKON），7500型RT-PCR檢測(cè)儀（美國ABI）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 分組和給藥

大鼠隨機(jī)分為正常組（21只）、模型組（28只）和GBE50組（23只）。正常組和模型組給予1%CMC-Na蒸餾水溶液灌胃，GBE50組給予GBE50混懸液100 mg/（kg?d）灌胃。每只大鼠灌胃劑量為10 mL/（kg?d），1次/d，連續(xù)12 d。

2.2 造模

參照文獻(xiàn)[13]方法。第11日灌胃1 h后，皮下注射0.1%鹽酸腎上腺素0.8 mg/kg，間隔4 h再給予等劑量鹽酸腎上腺素，2次皮下注射期間將大鼠置于冰水浴中浸泡5 min，造成急性血瘀證模型。造模結(jié)束后禁食不禁水，次日灌胃1 h后腹腔注射20%烏拉坦麻醉，右頸總動(dòng)脈插管至左心室，記錄左心室內(nèi)壓（LVP）曲線，最后摘取心臟。

2.3 血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)測(cè)定

右頸總動(dòng)脈插管記錄動(dòng)脈血壓，之后插管至左心室，記錄LVP曲線，測(cè)量心率（HR）、左心室收縮峰壓平均值（mLVSP）、左心室舒張壓平均值（mLVDP）、左室內(nèi)壓最大變化速率（±dp/dtmax）、左心室開始收縮至達(dá)到室內(nèi)壓最大上升速率時(shí)間（t-dp/dtmax），計(jì)算左室發(fā)展壓（DP），DP＝mLVSP－mLVDP。

2.4 放免法檢測(cè)心肌組織腫瘤壞死因子-α蛋白表達(dá)

10%心肌組織勻漿，4 ℃、3000 r/min離心15 min，取上清液按試劑盒說明操作，測(cè)定各管沉淀的放射性計(jì)數(shù)（cpm）。由自動(dòng)γ計(jì)數(shù)器直接給出有關(guān)參數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)曲線及樣品濃度，再根據(jù)稱取的組織量，計(jì)算出每1 mg組織中的量。

2.5 免疫組化檢測(cè)心肌組織腫瘤壞死因子受體1、2蛋白表達(dá)

所取心肌甲醛固定，石蠟包埋，切片，EnVision法免疫組化測(cè)定。棕黃色或棕褐色區(qū)域?yàn)殛栃员磉_(dá)，每張切片隨機(jī)選取3個(gè)視野。通過IMS細(xì)胞圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)算陽性區(qū)域面積與光密度（OD）。顯微鏡、圖像采集卡和數(shù)碼相機(jī)采集圖像。

2.6 RT-PCR檢測(cè)心肌組織腫瘤壞死因子-α及其相關(guān)受體mRNA表達(dá)

各組心肌樣本進(jìn)行總RNA提取，濃度測(cè)定，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，Real-time PCR反應(yīng)。引物序列見表1。以GAPDH為管家基因，校正每個(gè)樣本Ct值。采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

表1 RT-PCR反應(yīng)基因序列

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

4 結(jié)果

4.1 大鼠死亡率

造模過程中由于應(yīng)激損傷，模型組死亡率較高，而GBE50組死亡率明顯低于模型組，見表2。提示GBE50具有提高模型動(dòng)物存活率的作用。

表2 實(shí)驗(yàn)過程各組大鼠死亡情況（只）

4.2 GBE50對(duì)血瘀證大鼠血流動(dòng)力學(xué)的影響

模型組大鼠HR顯著低于正常組（＜0.05），提示心臟活動(dòng)降低，GBE50可在一定程度上改善HR的減慢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＞0.05），見表3。模型組和GBE50組收縮壓與舒張壓皆呈現(xiàn)低于正常組的趨勢(shì)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＞0.05）。GBE50組脈壓差顯著低于正常組（＜0.05），見表4。GBE50組mLVSP和DP顯著高于正常組和模型組（＜0.05），提示GBE50可增強(qiáng)心肌收縮力，見表5。與正常組比較，模型組±dp/dtmax有減小的趨勢(shì)，提示心臟的收縮與舒張功能下降。GBE50能穩(wěn)定大鼠±dp/dtmax，且t-dp/dtmax顯著低于正常組和模型組（＜0.05），見表6，提示GBE50治療后血瘀證大鼠的心肌收縮性能增強(qiáng)。

表3 各組大鼠HR比較（±s，次/min）

注：與正常組比較，*＜0.05

表4 各組大鼠動(dòng)脈血壓比較（±s，mm Hg）

注：與正常組比較，*＜0.05

表5 各組大鼠左心室內(nèi)壓比較（±s，mm Hg）

注：與正常組比較，*＜0.05；與模型組比較，#＜0.05

表6 各組大鼠心肌力學(xué)指標(biāo)比較（±s）

注：與正常組比較，*＜0.05；與模型組比較，#＜0.05

4.3 GBE50對(duì)血瘀證大鼠心肌組織腫瘤壞死因子-α及其2種受體表達(dá)的影響

模型組和GBE50組心肌組織TNF-α蛋白表達(dá)高于正常組，且GBE50組升高顯著，與正常組和模型組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05，＜0.01），見表7。免疫組化檢測(cè)顯示，正常組心肌組織TNFR1、TNFR2少量表達(dá)，模型組和GBE50組TNFR1、TNFR2的表達(dá)均有所增加。從數(shù)值看，GBE50組TNFR1蛋白表達(dá)明顯高于正常組和模型組（＜0.05），結(jié)合切片觀察，陽性面積主要在血管周圍，心肌陽性表達(dá)少；模型組顯示心肌組織TNFR1蛋白的陽性表達(dá)較少，故GBE50對(duì)心肌組織TNFR1的蛋白表達(dá)變化尚不明確。GBE50組心肌組織TNFR2的蛋白表達(dá)明顯增加，與模型組比較OD值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05，＜0.001），見圖1、圖2、表8。TNF-α mRNA表達(dá)結(jié)果與蛋白變化一致，模型組和GBE50組均表現(xiàn)為TNF-α mRNA表達(dá)升高；模型組TNFR1基因表達(dá)較正常組略增加，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＞0.05），TNFR2基因表達(dá)明顯減少（＜0.05），GBE50組TNFR2基因表達(dá)較模型組明顯升高（＜0.05），見表9。

表7 各組大鼠心肌組織TNF-α含量比較（±s，pg/mg）

注：與正常組比較，**＜0.01；與模型組比較，#＜0.05

圖1 各組大鼠心肌組織TNFR1蛋白表達(dá)（免疫組化染色，×100）

圖2 各組大鼠心肌組織TNFR2蛋白表達(dá)（免疫組化染色，×100）

表8 各組大鼠心肌組織TNFR1、TNFR2蛋白表達(dá)比較（±s）

注：與正常組比較，*＜0.05；與模型組比較，#＜0.05，###＜0.001

表9 各組大鼠心肌組織TNF-α、TNFR1和TNFR2 mRNA表達(dá)比較（±s，%）

注：與正常組比較，*＜0.05；與模型組比較，#＜0.05

5 討論

本研究采用皮下注射大劑量腎上腺素復(fù)合冰水浴刺激，模擬暴怒與寒凝2個(gè)重要病因，造成急性血瘀證模型[14]。結(jié)果顯示，該模型能夠造成動(dòng)物全血黏度、血漿黏度、紅細(xì)胞聚集指數(shù)等血液流變學(xué)指標(biāo)發(fā)生變化，在一定程度上體現(xiàn)了血瘀證的部分臨床表征，而GBE50能夠改善上述變化[9]。有研究顯示，冠脈縮窄復(fù)制的慢性心肌缺血血瘀證模型和高脂飲食模擬的痰濁血瘀證模型都表現(xiàn)出心功能水平的降低[3，15]。本實(shí)驗(yàn)也觀察到，急性血瘀證大鼠血流動(dòng)力學(xué)各指標(biāo)呈現(xiàn)低于正常組的趨勢(shì)，左室收縮和舒張功能都受影響，而GBE50能夠改善血瘀證大鼠的心肌收縮性能。同時(shí)，還觀察到GBE50可降低血瘀證模型大鼠的死亡率。

隨著血瘀證炎癥反應(yīng)學(xué)說的提出，TNF-α作為炎癥反應(yīng)的啟動(dòng)因子和關(guān)鍵促炎因子日益受到重視。有學(xué)者認(rèn)為TNF-α可視為血瘀證發(fā)展過程中炎癥反應(yīng)和心功能之間的橋梁因子[3]；血清TNF-α表達(dá)水平與左室舒張末容積、左室收縮末容積呈負(fù)相關(guān)，隨心功能的惡化，其表達(dá)量升高[16]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，血瘀證大鼠心肌組織TNF-α表達(dá)增加，但是GBE50組TNF-α水平增加更明顯，基因表達(dá)也有所升高。有研究表明，TNF-α在心肌缺血/再灌注損傷中具有“雙刃劍”作用，即TNF-α可通過與不同的受體結(jié)合，介導(dǎo)不同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，對(duì)心肌具有損傷或保護(hù)作用[17]。

TNF-α通過與細(xì)胞表面的受體結(jié)合實(shí)現(xiàn)生物學(xué)功能，其受體有TNFR1（55 kD）和TNFR2（75 kD）2種類型[18]。TNFR1含有一個(gè)約80個(gè)氨基酸殘基組成的死亡結(jié)構(gòu)域（DD），DD是介導(dǎo)抗病毒活性和細(xì)胞死亡以及激活核因子-κB所必需的，TNFR1及其下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活將引起細(xì)胞應(yīng)激與炎性反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡甚至死亡；而TNFR2不含DD，其激活引起的細(xì)胞內(nèi)生存信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活可對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生保護(hù)作用，包括促進(jìn)心肌細(xì)胞鈣轉(zhuǎn)運(yùn)而增強(qiáng)其收縮功能、抑制心肌細(xì)胞凋亡、減緩再灌注心肌的纖維化、激活心肌中干細(xì)胞以修復(fù)心肌損傷等[19]。故TNFR1和TNFR2激活不同的信號(hào)通路，對(duì)心肌產(chǎn)生不同的生物學(xué)效應(yīng)[20]。本實(shí)驗(yàn)觀察到GBE50增加心肌組織TNF-α表達(dá)后，進(jìn)一步檢測(cè)其2種受體的基因與蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示，GBE50能明顯增加血瘀證大鼠心肌組織TNFR2的基因與蛋白表達(dá)，結(jié)合血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)變化，提示GBE50通過調(diào)控TNF-α-TNFR2通路對(duì)血瘀證大鼠起心肌保護(hù)作用。免疫組化結(jié)果顯示，GBE50組TNFR1蛋白表達(dá)也明顯高于正常組和模型組，但陽性面積主要在血管周圍，心肌的陽性表達(dá)少，故GBE50對(duì)TNFR1的作用仍有待明確。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)觀察到，GBE50可改善急性血瘀證大鼠血流動(dòng)力學(xué)，降低動(dòng)物死亡率，并且可能是通過上調(diào)TNFR2表達(dá)，及TNF-α-TNFR2通路發(fā)揮保護(hù)心肌作用。

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Effects of GBE50 on Hemodynamics and TNF-α Pathway in Myocardial Tissue of Rats with Acute Blood Stasis Syndrome

JIANG Li, YANG Zi-ping, BAO Yi-min

To observe the effects of Ginkgo biloba extract 50 (GBE50) on hemodynamics and myocardial tissue TNF-α pathway in rats with acute blood stasis syndrome; To discuss its mechanism of action.A model of acute blood stasis syndrome was established by subcutaneous injection of epinephrine hydrochloride and ice bath. Male SD rats were divided randomly into normal group, model group and GBE50 group. After medicine was administrated by gavage for 11 days, the acute blood stasis model was established. The hemodynamic changes were observed in the next day. The expressions of TNF-α, TNFR1 and TNFR2 mRNA were detected by RT-PCR. The expressions of TNF-α, TNFR1 and TNFR2 protein were tested by radioimmunoassay and immunohistochemistry.The hemodynamics of the model group was lower than that of the normal group. Compared with model group, GBE50 could increase mLVSP, DP and decrease t-dp/dtmax(<0.05). The protein expressions of TNF-α, TNFR1, and TNFR2 in GBE50 group were higher than those in model group, and TNFR2 mRNA expression increased significantly in GBE50 group (<0.05).GBE50 can ameliorate the decline of hemodynamics of rats with acute blood stasis syndrome, and regulate the myocardial TNF-α pathway. Increasing the expression of protective receptor TNFR2 may be one of the mechanisms of protecting cardiac function.

Ginkgo biloba extract 50; blood stasis syndrome; hemodynamics; TNF-α; TNF receptor; rats

10.3969/j.issn.1005-5304.2017.11.009

R285.5

A

1005-5304(2017)11-0034-05

（2017-04-12）

（2017-04-28；編輯：華強(qiáng)）

國家自然科學(xué)基金（81303256）

包怡敏，E-mail：yiminbao@163.com