韓松芳,金文標(biāo),涂仁杰,周 旭,陳洪一

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細(xì)菌對城市污水中斜生柵藻生長與產(chǎn)脂的影響

韓松芳,金文標(biāo)*,涂仁杰,周 旭,陳洪一

(哈爾濱工業(yè)大學(xué)深圳研究生院,深圳微藻生物能源工程實(shí)驗(yàn)室,廣東深圳 518055)

研究并分析了EM菌和LAS菌對斜生柵藻()生長和油脂積累的促進(jìn)作用.結(jié)果表明:添加上述2種細(xì)菌對城市污水中斜生柵藻的干重和油脂產(chǎn)量有顯著的促進(jìn)作用,其油脂產(chǎn)量分別提高了36.2%和21.5%.通過對生成的脂肪酸甲酯進(jìn)行氣相色譜分析,結(jié)果顯示EM菌的添加提升了斜生柵藻單不飽和脂肪酸的含量,有利于提升所得生物柴油的質(zhì)量.培養(yǎng)結(jié)束后污水的菌群結(jié)構(gòu)分析顯示投加細(xì)菌會增加污水中菌群的豐富度和多樣性,且相比于對照組,加菌后的試驗(yàn)組中-、-豐度有所提高,而擬桿菌門()豐度有所降低.

斜生柵藻；城市污水；細(xì)菌；產(chǎn)脂

隨著能源危機(jī)與環(huán)境污染的加劇,微藻生物柴油越來越受到各國研究者的關(guān)注[1-3].微藻培養(yǎng)是其中一個重要環(huán)節(jié),在微藻培養(yǎng)過程中,利用淡水培養(yǎng)微藻需消耗大量淡水資源,有悖于當(dāng)前淡水資源緊缺的背景.同時(shí),營養(yǎng)物質(zhì)的投加進(jìn)一步提高了微藻的培養(yǎng)成本[4-6].利用城市污水培養(yǎng)微藻可為微藻的生長提供豐富的氮磷等營養(yǎng)物質(zhì),有利于污水的資源化利用.

城市污水中含有大量的細(xì)菌,微藻與細(xì)菌之間存在互生、拮抗等復(fù)雜的相互關(guān)系[7].目前,關(guān)于菌藻的研究多集中在利用菌藻改善污水水質(zhì)方面[8],如王冰等[9]研究表明小球藻和光合細(xì)菌共培養(yǎng)對污水中氨氮有較好的去除效果,氨氮去除率在4h內(nèi)可達(dá)到80%.此外關(guān)于菌藻的研究多集中在利用細(xì)菌促進(jìn)微藻在人工培養(yǎng)基中的生長與產(chǎn)脂方面.如Gonzalez等[10]構(gòu)建了巴西固氮螺菌－普通小球藻共生系統(tǒng),有效促進(jìn)了藻細(xì)胞重量的大幅增加;Mayali等[11]發(fā)現(xiàn)甲藻()藻株NOAA1 共棲細(xì)菌群落中的某種細(xì)菌與一種殺藻的細(xì)菌41-DBG2競爭營養(yǎng)物質(zhì)并占有優(yōu)勢,因而間接地保護(hù)了微藻免受殺藻細(xì)菌的攻擊,從而促進(jìn)了微藻的生長.但目前的研究中,將菌藻共生系統(tǒng)同時(shí)應(yīng)用于實(shí)際城市污水處理與微藻培養(yǎng)制備生物柴油的研究報(bào)道較少,也極少關(guān)注微藻培養(yǎng)后菌群結(jié)構(gòu)的變化情況[12-13].

斜生柵藻是一種具有高產(chǎn)脂效率的微藻[14].鑒于城市污水含有大量的原生菌類,且微藻與細(xì)菌之間存在著互生、拮抗等復(fù)雜的相互關(guān)系.本研究將基于城市污水系統(tǒng)中菌藻共生體系,篩選出能夠有效促進(jìn)斜生柵藻生長和油脂積累的細(xì)菌,并對微藻培養(yǎng)后城市污水中菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析,以期為微藻培養(yǎng)與污水資源化利用耦合技術(shù)的推廣應(yīng)用奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)藻種、菌種及培養(yǎng)

試驗(yàn)所用藻種斜生柵藻()購買于中國科學(xué)院(武漢)水生生物研究所淡水藻種庫,藻種采用BG11培養(yǎng)基[15]進(jìn)行傳代培養(yǎng)保藏.所選取的細(xì)菌共有兩個來源:水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域常用的對水質(zhì)具有凈化作用的光合細(xì)菌(廣東省菌種保藏中心)、EM菌和枯草芽孢桿菌(河南中廣集團(tuán)天義生物谷);課題組前期從污水中篩選的高效氨化菌[16]、聚磷菌、陰離子洗滌劑降解菌(LAS菌)[17]、二甲基甲酰胺降解菌(DMF菌)[18].

試驗(yàn)所用城市污水取自深圳大學(xué)城市政污水井,經(jīng)潛污泵抽取除去粗大懸浮物后使用,污水水質(zhì)COD、TP、TN、NH4+-N分別為 140~200, 5.0~6.5,20~45,20~40mg/L.初步篩選對斜生柵藻產(chǎn)脂有促進(jìn)作用的菌種時(shí),將不同種類菌液分別投加于城市污水中,使投加后扣除基質(zhì)吸光度值細(xì)菌懸液的吸光度值為600=0.02.進(jìn)一步優(yōu)化菌液投加量時(shí),使投加菌液后扣除基質(zhì)吸光度值細(xì)菌懸液的吸光度值600為 0、0.002、0.02、0.04、0.06.以BG11培養(yǎng)基培養(yǎng)處于對數(shù)生長期的斜生柵藻為種子液,等量分別接種于各試驗(yàn)組中,使接種后培養(yǎng)體積為600mL,以相應(yīng)的未加斜生柵藻,投加菌劑的城市污水為空白對照,使扣除空白后藻液初始吸光度為680=0.1.于氣泡柱式光生物反應(yīng)器(直徑為5cm、長度50cm、容積大小約為1L)培養(yǎng),以僅接種斜生柵藻,未投加細(xì)菌組作為試驗(yàn)對照組,于培養(yǎng)溫度(25±1)℃,光照強(qiáng)度100mmol/(m2·s),光暗比(L:D)為12:12h條件下,連續(xù)通氣培養(yǎng)(空氣流速為120mL/min,由底部通入).取培養(yǎng)達(dá)到穩(wěn)定期的藻液測定扣除空白后藻細(xì)胞的干重、油脂產(chǎn)量.每組試驗(yàn)設(shè)3個平行對照.

1.2 微藻干重的測定

微藻的干重采用重量法測定,10mL藻液經(jīng)預(yù)稱重(1)的微孔濾膜(0.45μm)過濾、洗滌,于105℃下烘至恒重(2),不加微藻的空白對照組過濾烘干前后的質(zhì)量差為0,微藻干重DW(g/L)的計(jì)算公式如下:

DW=(2-1-0)/ 0.01 (1)

1.3 微藻油脂產(chǎn)量與脂肪酸組成的測定

微藻油脂提取采用氯仿甲醇共溶劑提取法[19].待提取結(jié)束后,收集氯仿相,轉(zhuǎn)移至預(yù)稱重的錫紙盤中,待有機(jī)溶劑揮發(fā)完全后,于80℃烘箱中烘至恒重,得到微藻油脂產(chǎn)量,微藻細(xì)胞油脂含量為微藻油脂產(chǎn)量與微藻干重的百分比.

微藻脂肪酸分析,首先對提取的油脂進(jìn)行甲酯化[20],將5mL藻液中脂肪酸轉(zhuǎn)化成相對應(yīng)的脂肪酸甲酯.采用賽里安456-GC氣相色譜儀進(jìn)行分析,色譜柱為BR-2560柱,100m′0.25mm(內(nèi)徑)′0.20μm(膜厚),FID檢測器,分流方式進(jìn)樣,分流比為30:1,進(jìn)樣量為1μL.

1.4 菌群結(jié)構(gòu)分析方法

微生物菌群結(jié)構(gòu)的研究主要是通過對細(xì)菌16S rRNA的V4V5高可變區(qū)基因進(jìn)行測序,并基于測序結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)篩選以及微生物菌群信息的分析.主要包括:細(xì)菌組DNA提取、PCR擴(kuò)增、電泳驗(yàn)證、PCR產(chǎn)物純化與濃度測定、高通量測序以及測序結(jié)果分析.

1.5 數(shù)據(jù)分析方法

數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS21.0進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA),采用LSD法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)(<0.05).

2 結(jié)果與討論

2.1 細(xì)菌促進(jìn)斜生柵藻產(chǎn)脂的初步優(yōu)化

菌藻間存在著共生、拮抗等復(fù)雜的相互關(guān)系,不同細(xì)菌對斜生柵藻干重與產(chǎn)脂的影響如圖1所示.從圖1中可以看出,所投加的細(xì)菌,其中大多數(shù)對斜生柵藻干重影響不大,說明了斜生柵藻對環(huán)境良好的適應(yīng)性.其中投加EM菌的情況下斜生柵藻干重增加最為顯著,相比未投加細(xì)菌的試驗(yàn)對照組(WW)提高了16.8%(<0.05).微藻的脂肪產(chǎn)量由微藻干重和微藻油脂含量共同決定,總體表現(xiàn)為EM菌、LAS菌對斜生柵藻的油脂產(chǎn)量增長有促進(jìn)作用(<0.05),油脂產(chǎn)量相比于試驗(yàn)對照組提高了36.9%、19.6%,其他細(xì)菌對斜生柵藻的油脂產(chǎn)量無顯著影響.故選取EM菌、LAS菌作為后續(xù)進(jìn)一步優(yōu)化的對象.

圖1 斜生柵藻在投加不同細(xì)菌城市污水中的產(chǎn)脂情況

2.2 細(xì)菌促進(jìn)斜生柵藻產(chǎn)脂的進(jìn)一步優(yōu)化

圖2 斜生柵藻在添加不同量細(xì)菌城市污水中油脂產(chǎn)量

2.2.1 菌種最佳濃度的確定 細(xì)菌可以分解有機(jī)物為微藻生長提供所需碳源,但細(xì)菌與微藻間亦存在著空間與營養(yǎng)物質(zhì)的競爭,因此對EM菌、LAS菌在城市污水中的投加量進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化,以尋求最佳的細(xì)菌投加量.從圖2中可以看出,EM菌與LAS菌600值均為0.02時(shí),對斜生柵藻的產(chǎn)脂促進(jìn)作用最大,斜生柵藻油脂產(chǎn)量分別可達(dá)0.17 和0.15g/L,相較于試驗(yàn)對照組顯著提高了36.2%和21.5%(<0.05).因此選取初始吸光度600為0.02的EM菌和LAS菌作為后續(xù)研究對象.

表1 添加細(xì)菌組與對照組脂肪酸分析

2.2.2 細(xì)菌對斜生柵藻脂肪酸甲酯的影響 投加EM菌、LAS菌與空白對照組的斜生柵藻脂肪酸組成如表1所示.由表1可知,各試驗(yàn)組斜生柵藻脂肪酸組成均以C16、C18為主,為綠藻中常見脂肪酸[21-22].Song等[23]和Ma等[24]的研究表明,適合制備生物柴油的原料應(yīng)含有較多的C16~C18脂肪酸,主要包括十六烷酸(C16:0)、十八烷酸(C18:0)、十八烯酸(C18:1)、十八碳二烯酸(C18:2)、十八碳三烯酸(C18:3).對照組與投加EM菌、LAS菌的試驗(yàn)組中該5種脂肪酸在總脂肪酸中的含量占比分別可達(dá)94.65%、94.49%、95.46%,適宜于作為制備生物柴油的原料.同時(shí),脂肪酸甲酯的結(jié)構(gòu)會對生物柴油的性能(十六烷值、低溫流動性、氧化安定性等)產(chǎn)生影響.研究表明,生物柴油的十六烷值隨著飽和脂肪酸甲酯含量的增加而增加,多不飽和脂肪酸甲酯含量的增加而降低[25].生物柴油低溫流動性隨著飽和脂肪酸甲酯尤其是長碳鏈質(zhì)量分?jǐn)?shù)增高而變差.生物柴油的氧化安定性隨著不飽和脂肪酸不飽和度增高而變差.高品位的生物柴油應(yīng)盡量少的含有多不飽和脂肪酸甲酯和飽和脂肪酸甲酯,盡量多的含有單不飽和脂肪酸,以改善其十六烷值、低溫流動性、氧化安定性、運(yùn)動粘度等性能[26].從表1中可以看出,投加LAS菌后,各成分含量變化不大,但投加EM菌的試驗(yàn)組中單不飽和脂肪酸的含量相比于對照組提高了251%,有利于提升所得生物柴油的質(zhì)量.

2.3 細(xì)菌對菌群結(jié)構(gòu)影響

取培養(yǎng)達(dá)到穩(wěn)定期的試驗(yàn)對照組與投加細(xì)菌(EM菌、LAS菌)的試驗(yàn)組藻液,通過DNA提取、16S V4V5高變區(qū)PCR擴(kuò)增,高通量測序考察藻液中菌群的組成與多樣性.

2.3.1 菌群多樣性分析 菌群多樣性是指某個集合群落內(nèi),不同類型微生物的變化以及它們之間的相對豐度.一般而言,系統(tǒng)中微生物菌群多樣性越高,越有利于抵抗外界環(huán)境的變化,較快的進(jìn)行系統(tǒng)自我調(diào)整和更新.

表2 不同樣品的生物多樣性

Alpha多樣性主要關(guān)注局域均勻生境下的物種數(shù)目,因此也被稱為生境內(nèi)的多樣性.多樣性指數(shù)是反映豐富度和均勻度的綜合指標(biāo),與以下兩個因素有關(guān):(1)種類數(shù)目,即豐富度;(2)種類中個體分配上的均勻性.群落豐富度指數(shù),包括Chao1指數(shù)和observed species指數(shù),數(shù)值越大,說明樣品中物種越豐富;群落多樣性的指數(shù),包括PD whole tree指數(shù)、Shannon指數(shù)和 Simpson指數(shù),數(shù)值越大,說明樣品群落多樣性越高.所得試驗(yàn)組與對照組樣品的Alpha多樣性參數(shù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表2所示.從表2可以看出,投加EM菌、LAS菌的試驗(yàn)組各項(xiàng)指數(shù)均大于對照組,表明投加細(xì)菌會提高斜生柵藻藻液中菌群的豐富度和多樣性,有利于系統(tǒng)穩(wěn)定.

2.3.2 主導(dǎo)菌群分析 對投加EM菌、LAS菌的試驗(yàn)組與試驗(yàn)對照組有效序列在不同物種分類水平上的豐度進(jìn)行分析.圖3(a)為樣品在門分類級別上的豐度.從圖中可以看出,對照組與試驗(yàn)組在門級別上,均以變形菌門()占主導(dǎo).這與世界各地分布的污水處理廠中微生物菌群結(jié)構(gòu)的相關(guān)報(bào)道一致[27].對污水中有機(jī)物具有較好降解作用,試驗(yàn)對照組與投加EM菌、LAS菌組,豐度分別高達(dá)62.3%、73.8%和87.2%,可為斜生柵藻生長提供所需二氧化碳.其他占主導(dǎo)的門為擬桿菌門()豐度分別為33.1%、24.4%和10.6%.有研究表明擬桿菌門是太湖中占主導(dǎo)的藻際微生物之一,除了可以降解復(fù)雜有機(jī)大分子外,還可裂解微囊藻細(xì)胞與藍(lán)藻細(xì)胞[28],加菌處理組相比于試驗(yàn)對照組斜生柵藻生物量增加,擬桿菌門豐度降低,可能與擬桿菌門對微藻的裂解作用有關(guān).圖3(b)為樣品在綱分類級別上的豐度,由于門的豐度高達(dá)62.3%~87.2%,且處理組比對照組有大幅度提高,因而分析了其下屬的-、-、-、-、-的豐度.結(jié)果表明,試驗(yàn)對照組-的豐度最大,為39.4%,其它依次為β-、-,豐度分別為12.9%、9.8%.而投加EM菌與LAS菌組,-的豐度(分別為32.1%、28.8%)均有所降低,-的豐度(分別為28.6%、31.4%)與-的豐度(分別為12.9%、26.9%)相較于對照組均有較大幅度增高.研究表明-、-均為水華期間占主導(dǎo)的藻際微生物[28],尤其是-是典型的植物(包括微藻)生長促進(jìn)細(xì)菌[29].此外,,對微藻絮凝有關(guān)鍵作用[30],加菌處理組的降低,可一定程度減少斜生柵藻的絮凝沉降,更有利于斜生柵藻與環(huán)境中營養(yǎng)物質(zhì)的充分接觸,從而有利于其生長.

(a)

(b)

圖3 樣品在不同層級上的豐度

Fig.3 The relative abundances of the samples

3 結(jié)論

3.1 城市污水中EM菌初始吸光度600為0.02, LAS菌初始吸光度600為0.02時(shí),對斜生柵藻的干重和油脂產(chǎn)量促進(jìn)作用最顯著,油脂產(chǎn)量分別可達(dá)0.17和0.15g/L,比試驗(yàn)對照組提高了36.2%和21.5%.通過對生成的脂肪酸甲酯進(jìn)行氣相色譜分析,結(jié)果顯示EM菌的添加可提升斜生柵藻單不飽和脂肪酸的含量,有利于提升所得生物柴油的質(zhì)量.

3.2 培養(yǎng)結(jié)束后污水的菌群結(jié)構(gòu)分析顯示投加細(xì)菌會增加污水中菌群的豐富度和多樣性,且加菌后的試驗(yàn)組中豐度有所降低,-、-豐度增加.

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Effects of bacteria on growth and lipid production ofcultivated in municipal wastewater.

HAN Song-fang, JIN Wen-biao*, TU Ren-jie, ZHOU Xu, CHEN Hong-yi

(Shenzhen Engineering Laboratory of Microalgal Bioenergy, Harbin Institute of Technology Shenzhen Graduate School, Shenzhen 518055, China)., 2017,37(10)：3867~3872

In the study, EM bacteria and LAS bacteria were found to enhance the growth and lipid production ofcultivated in municipal wastewater. The results showed that the lipid production ofwas increased by 36.2% and 21.5% after adding the above-mentioned bacteria, respectively. According to the GC analysis of the lipids, EM bacteria could increase the content of monounsaturated fatty acid in, and thus improving the grade of biodiesel. The analysis of microbial community structure in municipal wastewater showed that the richness and diversity of bacteria in wastewater were increased significantly. In addition, the abundances of-、-were increased, while the abundance ofwas decreased.

；municipal wastewater；bacteria；lipid production

X172

A

1000-6923(2017)10-3867-06

韓松芳(1989-),女,河南周口人,哈爾濱工業(yè)大學(xué)深圳研究生院博士研究生,主要從事微藻生物質(zhì)能源與污水資源化研究.

2017-03-22

深圳市科技計(jì)劃資助項(xiàng)目(JCYJ20150529114024234)

* 責(zé)任作者, 教授, jinwb@hit.edu.cn