謝小紅 許雷來(lái) 顧錫冬

三陰性乳腺癌患者miR-155的表達(dá)及在新輔助化療中的意義

謝小紅 許雷來(lái) 顧錫冬

目的分析三陰性乳腺癌患者miR-155的表達(dá)及在新輔助化療中的意義。方法 選取采用表柔比星+環(huán)磷酰胺方案新輔助化療4個(gè)周期并成功實(shí)施乳腺癌改良根治術(shù)的女性三陰性乳腺癌患者23例，收集其在新輔助化療前后的腫瘤組織標(biāo)本和臨床基本資料，采用RT-PCR法檢測(cè)患者新輔助化療前后癌組織的miR-155表達(dá)水平，并分析其在不同臨床病理學(xué)特征患者中的表達(dá)情況。結(jié)果 新輔助化療后miR-155表達(dá)水平較化療前明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。Ki-67高表達(dá)的三陰性乳腺癌患者miR-155的表達(dá)水平顯著高于Ki-67低表達(dá)的患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而在不同年齡、原發(fā)灶分期、TNM分期、組織學(xué)分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況患者之間比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。結(jié)論 miR-155可作為判斷三陰性乳腺癌新輔助化療療效及預(yù)后的腫瘤分子標(biāo)志物，臨床上miR-155、Ki-67高表達(dá)的三陰性乳腺癌患者可能從新輔助化療中得到更多獲益。

三陰性乳腺癌 miR-155 Ki-67 臨床病理學(xué)特征

目前乳腺惡性腫瘤占世界婦女惡性腫瘤的第一位，全世界每年約有超過(guò)100萬(wàn)婦女被查出患有乳腺癌，占所有婦女新發(fā)惡性腫瘤的29%[1-2]。臨床上常用免疫組化技術(shù)檢測(cè)乳腺癌組織中雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）、原癌基因人類(lèi)表皮生長(zhǎng)因子受體2（HER-2）、增殖指數(shù)（Ki-67）的表達(dá)狀況，以此將乳腺癌分成5個(gè)亞型。其中三陰性乳腺癌為ER、PR、HER-2均為陰性的乳腺癌，因其無(wú)法進(jìn)行內(nèi)分泌及靶向治療，化療不敏感且易復(fù)發(fā)、預(yù)后差而成為臨床上研究的熱點(diǎn)之一[3]。miRNA是近幾年才被發(fā)現(xiàn)的一類(lèi)小分子短鏈非編碼RNA，它的表達(dá)可能調(diào)控著腫瘤發(fā)生、發(fā)展及變異。除此之外，miRNA作為細(xì)胞調(diào)控的一員，調(diào)控著細(xì)胞及個(gè)體的各項(xiàng)生命活動(dòng)，包括細(xì)胞增殖與分化、細(xì)胞凋亡、個(gè)體的發(fā)育及器官的形成等[4-6]。本課題組前期的研究發(fā)現(xiàn)miR-155在體外實(shí)驗(yàn)及腫瘤組織中表達(dá)明顯上調(diào)[2]，而有關(guān)miR-155與三陰性乳腺癌新輔助化療的關(guān)系的報(bào)道目前較少。本研究旨在探索miR-155在新輔助化療前后三陰性乳腺癌組織中的表達(dá)情況及其在不同乳腺癌臨床病理學(xué)特征患者中的表達(dá)情況，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 選取2016年6至12月采用表柔比星+環(huán)磷酰胺（EC）方案新輔助化療4個(gè)周期并成功實(shí)施乳腺癌改良根治術(shù)的女性三陰性乳腺癌患者23例，年齡36～61歲，中位年齡49歲；所有入組患者均為首次確診乳腺癌，且符合本課題組臨床入組標(biāo)準(zhǔn)。入組標(biāo)準(zhǔn)：（1）女性，年齡18～70歲；（2）臨床高度疑似乳腺癌的患者，經(jīng)空心針穿刺活檢病理學(xué)上確診為原發(fā)浸潤(rùn)乳腺腺癌，且免疫組化結(jié)果ER、PR、Her-2均為陰性；（3）患者至少具有1個(gè)及以上可測(cè)量的腫瘤病灶，并按照《美國(guó)AJCC癌癥分期手冊(cè)》進(jìn)行臨床TNM分期；（4）患者符合新輔助化療指征[7]；（5）先前未接受過(guò)放化療等針對(duì)乳腺癌的治療；（6）心、肺、肝、腎功能正常，生命體征無(wú)異常。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）不愿意接受化療或拒絕完成既定化療周期的；（2）哺乳期或孕期乳腺癌；（3）心、肺、肝、腎功能異常；（4）除乳腺癌之外具有其他腫瘤病史的。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)和患者知情同意。

1.2 新輔助化療方案 本組患者均選擇EC方案，即每周期表柔比星75mg/m2，環(huán)磷酰胺600mg/m2，21d為1個(gè)周期，共4個(gè)周期。本組患者均在完成4個(gè)EC周期化療、評(píng)估療效后實(shí)施乳腺癌改良根治術(shù)。

1.3 新輔助化療前后評(píng)估指標(biāo) 入組患者術(shù)前按照實(shí)體瘤的療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行臨床療效評(píng)估，并收集入組患者住院期間的臨床資料，包括年齡、原發(fā)灶分期、TNM分期、組織學(xué)分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、Ki-67表達(dá)水平（Ki-67≥14% 為高表達(dá)，Ki-67＜14%為低表達(dá)）。

1.4 標(biāo)本收集 收集23例乳腺癌患者新輔助化療前后的組織標(biāo)本共46例。新輔助化療前標(biāo)本為采用8G麥默通穿刺活檢獲取的新鮮乳腺癌組織標(biāo)本，置于EP凍存管中，液氮速凍之后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存。新輔助化療后標(biāo)本為術(shù)中取新鮮乳腺癌組織標(biāo)本，置于EP凍存管中，液氮速凍之后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存。所有標(biāo)本的HE染色及免疫組織化學(xué)EnVison染色均由本院病理科檢測(cè)。

1.5 主要試劑和儀器

1.5.1 主要儀器 電子分析天平（FA2004N型，上海滬粵明科學(xué)儀器有限公司）；Millipore Direct-Q5超純水系統(tǒng)（美國(guó)密理博公司）；冷凍離心機(jī)（Multifuge 3R plus，美國(guó)賽默飛世爾公司）；-80℃超低溫冰箱（Ultra Freeze 3410，美國(guó)賽默飛世爾公司）；TOMY SX-500高壓滅菌鍋（日本SeikoCo公司）；微量移液器（美國(guó)吉爾森公司）；PCR儀（型號(hào)9700，美國(guó)ABI公司）；LightCycler?480Ⅱ型熒光定量PCR儀（美國(guó)羅氏公司）；NanoDrop 2000分光光度計(jì)（美國(guó)賽默飛世爾公司）。

1.5.2 主要試劑 mirVanaTMRNA Isolation Kit試劑盒（批號(hào)：AM1561，美國(guó)賽默飛世爾公司）；miScriptⅡReverse Transcription Ki（t批號(hào)：218161，德國(guó)凱杰公司）；QuantiFast?SYBR?Green PCR Ki（t批號(hào)：204054，德國(guó)凱杰公司）；Universal prime（r德國(guó)凱杰公司）；microRNA-specific prime（r上海捷瑞公司）；0.2ml PCR管（批號(hào)：PCR-02-C，美國(guó)愛(ài)思進(jìn)公司）；384孔板（批號(hào)：04729749001，美國(guó)羅氏公司）；10μl、200μl、1ml tip（s美國(guó)愛(ài)思進(jìn)公司）。

1.6 miR-155表達(dá)水平檢測(cè) 采用RT-PCR法，miR-155及內(nèi)參5S的引物序列見(jiàn)表1。取-80℃冰箱保存的冷凍乳腺癌組織0.1g，在液氮中研磨勻漿，將組織懸液按照mirVanaTMRNA Isolation Kit試劑盒的操作說(shuō)明提取總RNA，然后采用NanoDrop 2000分光光度計(jì)評(píng)估提取RNA的濃度和純度。利用miScriptⅡReverse Transcription Kit將待測(cè)RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。逆轉(zhuǎn)錄體系：總 RNA，0.5μg；5×miScript HiSpec Buffer，2μl；10×Nucleics Mix，1μl；miScript Reverse Transcriptase Mix，0.5μl；Nuclease-free H2O加至10μl。反應(yīng)條件為37℃ 60min，95℃ 5min。逆轉(zhuǎn)錄完畢后加入90μl Nuclease-free H2O儲(chǔ)存在-20℃冰箱備用。利用QuantiFast?SYBR?Green PCR Kit試劑盒在LightCycler?480Ⅱ型熒光定量PCR儀上進(jìn)行反應(yīng)。體系：2×QuantiFast?SYBR?Green PCR Master Mix，5μl；10μM Universal primer，0.2μl；10μM microRNA-specific primer，0.2μl；cDNA，1μl；Nuclease-free H2O，3.6μl。PCR 反應(yīng)條件為 95℃5min，95℃ 10s，60℃ 30s，40 個(gè)循環(huán)。循環(huán)結(jié)束后利用熔解曲線檢測(cè)產(chǎn)物特異性：從60℃緩慢升溫至97℃，每攝氏度采集5次熒光信號(hào)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。miR-155表達(dá)水平計(jì)算方法：以 5S 作為內(nèi)參，采用 2-ΔΔCt法：ΔCt=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因，ΔΔCt= ΔCt實(shí)驗(yàn)組樣品-ΔCt對(duì)照組樣品，相對(duì)表達(dá)量=2-ΔΔCt。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，新輔助化療前后miR-155表達(dá)水平比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，不同臨床病理特征患者miR-155表達(dá)水平比較采用方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 miR-155及內(nèi)參5S的引物序列

2 結(jié)果

2.1 新輔助化療前后三陰性乳腺癌組織中miR-155表達(dá)情況 新輔助化療前miR-155相對(duì)表達(dá)量為0.036±0.048，化療后相對(duì)表達(dá)量為0.010±0.014，新輔助化療后miR-155表達(dá)水平較化療前明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見(jiàn)圖 1。

圖1 新輔助化療前后三陰性乳腺癌組織中miR-155表達(dá)情況

2.2 不同臨床病理特征三陰性乳腺癌患者miR-155表達(dá)水平比較 Ki-67高表達(dá)的三陰性乳腺癌患者miR-155的表達(dá)水平顯著高于Ki-67低表達(dá)的患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而在不同年齡、原發(fā)灶分期、TNM分期、組織學(xué)分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況患者之間比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＞0.05)，見(jiàn)表2。

表2 不同臨床病理特征三陰性乳腺癌患者miR-155表達(dá)水平比較

3 討論

三陰性乳腺癌是ER、PR、HER-2均陰性表達(dá)的乳腺癌亞型，其占所有乳腺癌亞型的15%～20%[8]。由于其免疫組化的特點(diǎn)注定該種亞型不適合接受內(nèi)分泌治療和分子靶向治療，因此，化療就成為治療三陰性乳腺癌的唯一手段。隨著對(duì)新輔助化療研究的越來(lái)越深入，其臨床應(yīng)用也越來(lái)越廣泛，新輔助化療己成為三陰性乳腺癌個(gè)體化治療中一個(gè)新的治療手段，并取得較好的療效[9]。三陰性乳腺癌患者達(dá)到病理完全緩解（pCR）意味著更長(zhǎng)的生存獲益，未達(dá)pCR的患者往往預(yù)后較差，腫瘤和淋巴結(jié)的殘留導(dǎo)致這部分患者和其他亞型乳腺癌患者相比具有更高的復(fù)發(fā)率以及更差的生存期[10]。因此，尋找一種新輔助化療療效相關(guān)的腫瘤標(biāo)志物迫在眉睫，該腫瘤標(biāo)志物可用于指導(dǎo)三陰性乳腺癌的診斷、治療和判斷預(yù)后。

一項(xiàng)關(guān)于三陰性乳腺癌的大規(guī)模研究顯示與正常乳腺組織相比，三陰性乳腺癌組織中共有116個(gè)miRNA表達(dá)失調(diào)，其中miR-155表達(dá)上調(diào)[11]，可見(jiàn)miR-155與三陰性乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展存在一定的關(guān)系。本課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)，與乳腺增生組織比較，miR-155在三陰性乳腺癌組織中表達(dá)也明顯上調(diào)[12]。miRNAs主要分為兩大類(lèi)：一類(lèi)是具有促癌功能的miRNA，另一類(lèi)是具有抑癌功能的miRNA。黃選東等[13]研究顯示miR-155可歸為癌基因這一類(lèi)，并且參與細(xì)胞的多種生理病理過(guò)程。miR-155的功能主要包括調(diào)控腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、炎癥的產(chǎn)生以及對(duì)免疫的調(diào)節(jié)，其表達(dá)上調(diào)在諸多不同種類(lèi)的腫瘤中被驗(yàn)證[14-15]。本研究發(fā)現(xiàn)miR-155在新輔助化療后表達(dá)明顯下調(diào)，說(shuō)明miR-155有可能作為預(yù)測(cè)新輔助化療療效的腫瘤標(biāo)志物。另外，本研究也探討了不同臨床病理特征三陰性乳腺癌患者miR-155表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)Ki-67高表達(dá)的三陰性乳腺癌患者miR-155的表達(dá)水平顯著高于Ki-67低表達(dá)的患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；但其在不同年齡、原發(fā)灶分期、TNM分期、組織學(xué)分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況患者之間比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。由此提示miR-155的表達(dá)與Ki-67的表達(dá)有一致性，與預(yù)后相關(guān)，這與邵營(yíng)波等[16]的研究類(lèi)似。

綜上所述，本研究初步探索了miR-155與三陰性乳腺癌新輔助化療的關(guān)系，結(jié)果提示miR-155作為預(yù)測(cè)三陰性乳腺癌新輔助化療療效存在一定的可能性，并且miR-155的表達(dá)在不同Ki-67的表達(dá)狀態(tài)下具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示臨床上miR-155、Ki-67高表達(dá)的三陰性乳腺癌患者，可能從新輔助化療中得到更多的獲益。但本研究入組的三陰性乳腺癌患者過(guò)少，仍存在一定的局限性，相信在本研究初步探索的基礎(chǔ)上，增大樣本量，能為miR-155在三陰性乳腺癌新輔助化療方面的運(yùn)用提供更加有力的實(shí)驗(yàn)支持。

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《浙江醫(yī)學(xué)》對(duì)圖表的要求

稿件中若有圖表，分別按其在正文中出現(xiàn)的先后次序連續(xù)編碼。每幅圖應(yīng)冠有圖題。說(shuō)明性的文字應(yīng)置于圖下方注釋中，并在注釋中標(biāo)明圖表中使用的全部非公知公用的縮寫(xiě)。線條圖應(yīng)墨繪在白紙上，高寬比例以5∶7為宜。以計(jì)算機(jī)制圖者應(yīng)提供激光打印圖樣。照片圖要求有良好的清晰度和對(duì)比度；圖中需標(biāo)注的符號(hào)（包括箭頭）請(qǐng)用另紙標(biāo)上，不要直接寫(xiě)在照片上。每幅圖的背面應(yīng)貼上標(biāo)簽，注明圖號(hào)、方向及作者姓名。若刊用人像，應(yīng)征得本人的書(shū)面同意，或遮蓋其能被辨認(rèn)出系何人的部分。大體標(biāo)本照片在圖內(nèi)應(yīng)有尺度標(biāo)記。病理照片要求注明染色方法和放大倍數(shù)。圖表中如有引自他刊者，應(yīng)注明出處。電子版投稿中圖片建議采用JPG格式。表格建議采用三橫線表（頂線、表頭線、底線），如遇有合計(jì)和統(tǒng)計(jì)學(xué)處理內(nèi)容（如t值、P值等），則在此行上面加一條分界橫線；表內(nèi)數(shù)據(jù)要求同一指標(biāo)有效位數(shù)一致，一般按標(biāo)準(zhǔn)差的1/3確定有效位數(shù)。

本刊編輯部

Expression of miR-155 in triple-negative breast cancer and its significance in neoadjuvant chemotherapy

XIE Xiaohong,XU Leilai,GU Xidong.Department of Breast Surgery,the First Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou 310006,China

ObjectiveTo investigate the expression of miR-155 in triple-negative breast cancer and its significance in neoadjuvant chemotherapy. Methods Twenty-three patients with triple-negative breast cancer,who

4 cycles of neoadjuvant chemotherapy with epirubicin+cyclophosphamide regimen and successfully underwent radical mastectomy,were enrolled in the study.The tumor specimens and clinical data were collected before and after neoadjuvant chemotherapy.The expression of miR-155 in cancer tissue was detected by RT-PCR technique and the result was compared before and after neoadjuvant chemotherapy.The correlation of miR-155 expression with clinical and pathological features of patients was analyzed. Results The expression of miR-155 after neoadjuvant chemotherapy was significantly lower than that before neoadjuvant chemotherapy(P＜0.05).The expression of miR-155 in patients with Ki-67 overexpressing was significantly higher than that in those with Ki-67 low expression(P＜0.05).There was no significant difference in the expression of miR-155 among patients with different age,histological grade,clinical stage and lymph node metastasis status(all P＞0.05). Conclusion The expression of miR-155 can be used as a molecular marker for the efficacy of neoadjuvant chemotherapy and the prognosis of patientswith triple-negative breast cancer.Clinically,triple-negative breast cancer patientswith miR-155 and Ki-67 over-expression may benefit from neoadjuvant chemotherapy.

Triple-negative breast cancer miR-155 Ki-67 Clinico-pathological conference

10.12056/j.issn.1006-2785.2017.39.19.2017-924

浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技計(jì)劃項(xiàng)目（2015KYB267）

310006 杭州，浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院乳腺外科

謝小紅，E-mail：xxh666857@163.com

2017-04-22）

（本文編輯：陳麗）