范友芬 樂欣 晉國營 虞耀華

●論 著

脂肪間充質(zhì)干細胞復(fù)合人工真皮修復(fù)大鼠深度燒傷創(chuàng)面的研究

范友芬 樂欣 晉國營 虞耀華

目的探討脂肪間充質(zhì)干細胞（ADSCs）復(fù)合人工真皮（皮耐克）修復(fù)大鼠深度燒傷創(chuàng)面的作用。方法 用膠原酶法消化SPF級綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因大鼠腹股溝脂肪，獲得ADSCs，用流式細胞儀分析鑒定其表面特異性標志物，并觀察ADSCs向成骨細胞、成脂細胞分化的潛能。建立大鼠深度燒傷模型，將大鼠對稱的左、右創(chuàng)面分為實驗組和對照組。實驗組采用人工真皮+ADSCs治療，對照組采用人工真皮+0.9%氯化鈉注射液治療。分別于術(shù)后7、14、21d觀察創(chuàng)面最大直徑以評估創(chuàng)面愈合情況，術(shù)后21d時熒光顯微鏡下觀察創(chuàng)面冷凍切片評估實驗組與對照組創(chuàng)面情況。結(jié)果 成功獲得大鼠ADSCs，具有較強的增殖能力及多向分化能力。ADSCs對間充質(zhì)干細胞標志物CD29、CD90、CD44呈現(xiàn)高表達；對造血干細胞表面標志物CD34、白細胞共同抗原CD45則呈低表達。治療后14d時，實驗組創(chuàng)面最大直徑明顯小于對照組（P＜0.05），即實驗組創(chuàng)面愈合速度比對照組明顯增快。治療后21d，實驗組創(chuàng)面可見散在點狀綠色熒光，而對照組未觀察到明顯熒光。結(jié)論 ADSCs聯(lián)合人工真皮作用于深度燒傷創(chuàng)面可顯著促進創(chuàng)面愈合，是一種有效的治療深度燒傷的方法。

深度燒傷 人工真皮 脂肪間充質(zhì)干細胞

大面積深度燒傷是一種極易導(dǎo)致患者死亡和創(chuàng)面修復(fù)后功能障礙的創(chuàng)傷，隨著醫(yī)療水平的提高，此類患者的病死率已明顯下降[1-2]，但創(chuàng)面修復(fù)仍是世界范圍的難題[3]。主要原因是這類燒傷患者通常需要移植大量自體皮，而燒傷面積過大往往導(dǎo)致自體可用的供皮區(qū)極少[3]。近年來隨著生物醫(yī)學(xué)工程和分子生物學(xué)的迅猛發(fā)展，世界范圍內(nèi)已出現(xiàn)大量商品化、臨床化、不同功能的人工皮膚替代品，但目前尚無一種特別有效的人工皮膚替代品能達到自體皮移植的成活率和效果。造成這一問題的主要原因是人工真皮缺乏細胞支持，自體細胞生長速度過慢導(dǎo)致血管生成周期長，膠原蛋白生成不足，無法形成毛囊和汗腺等皮膚附屬結(jié)構(gòu)[4]。

與此同時，近年來有學(xué)者針對各種間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cells,MSC）的深入研究已證明，MSC能顯著加快慢性創(chuàng)面和放射性創(chuàng)面的愈合，并且在創(chuàng)面愈合的炎癥期、增生期、重塑期3個階段持續(xù)發(fā)揮調(diào)控作用[5-9]。脂肪間充質(zhì)干細胞（adipose-derived stem cells,ADSCs）作為生物成體MSC的一種，廣泛分布于各物種不同部位的脂肪組織中，數(shù)量巨大且取材方便，體外擴增和自我更新能力強，這使得同種異體之間的ADSCs移植變?yōu)榭尚?，從而為深度燒傷的治療提供一種新思路?；诖?，本研究以大鼠作為研究對象，將ADSCs與人工真皮進行生物復(fù)合，以期解決人工真皮缺乏細胞支持這一問題，使其達到更好的修復(fù)效果，從而為燒傷創(chuàng)面皮膚再生提供新參考。

1 材料和方法

1.1 材料 實驗級雌性Sprague Dawley（SD）大鼠40只，成年SPF級雌性綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因大鼠3只，均購于寧波大學(xué)實驗動物中心。人工真皮（商品名：皮耐克PELNAC），購于杭州瑞騰醫(yī)療器械有限公司；FBS高糖DMEM完全培養(yǎng)液、干細胞完全培養(yǎng)液、成脂誘導(dǎo)液A、成脂誘導(dǎo)液B、成骨誘導(dǎo)液，均購于美國Thermo Fisher Scientific公司；PBS、Ⅱ型膠原酶、胰蛋白酶、抗大鼠CD34PE、CD90FITC、CD44PE、CD45PE、CD29PE 單 抗 、PE-IgG1、FITC-IgG1、茜素紅染色劑、油紅O染色劑等其他試劑，均購于大連TaKaRa公司；流式細胞分析儀購于美國貝克曼庫爾特公司。

1.2 方法

1.2.1 大鼠ADSCs的分離、培養(yǎng) （1）ADSCs的分離：取綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因大鼠，腹腔注射5%水合氯醛麻醉，麻醉滿意后行腹部、雙下肢消毒，無菌超凈工作臺內(nèi)作腹部正中切口并向雙側(cè)腹股溝內(nèi)側(cè)分離取雙側(cè)脂肪組織并剝除血管組織，縫合切口；以無菌PBS沖洗取出的脂肪組織2次后，用PBS預(yù)配1%Ⅱ型膠原酶37℃振蕩消化30min，沉淀5min后小心取中層液體過200目細胞篩后，按1∶3比例加入10%FBS高糖DMEM完全培養(yǎng)液終止反應(yīng)，種于培養(yǎng)皿內(nèi)。（2）ADSCs的培養(yǎng)：ADSCs分離后第2天PBS沖洗換液，10%FBS高糖DMEM完全培養(yǎng)液培養(yǎng)，隔天換液；待細胞生長100%后進行傳代。

1.2.2 大鼠ADSCs的細胞流式表型鑒定 取第3代的ADSCs，用胰蛋白酶進行消化，將其制備成單細胞懸液。1×106/ml細胞分別加入抗大鼠 CD34PE、CD90FITC、CD44PE、CD45PE、CD29PE 單抗各 1μl，PE-IgG1、FITCIgG1為陰性對照。4℃避光孵育30min，以流式細胞分析儀檢測細胞表型。

1.2.3 大鼠ADSCs向成骨細胞、成脂細胞誘導(dǎo)分化及鑒定 （1）成骨細胞誘導(dǎo)及鑒定：待ADSCs達到80%～90%融合時，用胰蛋白酶消化后將其接種于六孔板中，每孔約3×103個細胞，按2ml/孔劑量加入干細胞完全培養(yǎng)液，放入溫度37℃、5%二氧化碳孵箱中培養(yǎng)，24h后移去培養(yǎng)液，按2ml/孔劑量加入成骨誘導(dǎo)液；每3d換液1次，如此誘導(dǎo)2～3周；2～3周后，待鈣結(jié)節(jié)形成，進行茜素紅染色。倒置電子顯微鏡下觀察并記錄。（2）成脂細胞誘導(dǎo)及鑒定：待ADSCs達到80%～90%融合時，用胰蛋白酶消化后將其接種于六孔板中，每孔約2×104個細胞，按2ml/孔劑量加入干細胞完全培養(yǎng)液，放入溫度37°C、5%二氧化碳孵箱中培養(yǎng)、每3d更換干細胞完全培養(yǎng)液，直至細胞達到100%融合。隨后移去培養(yǎng)液，按2ml／孔劑量加入成脂誘導(dǎo)液A開始誘導(dǎo)，3d后更換為成脂誘導(dǎo)液B維持，24h后再次更換為成脂誘導(dǎo)液A誘導(dǎo)，如此循環(huán)3次；當細胞內(nèi)脂滴數(shù)量增多，但體積相對較小時，可用成脂誘導(dǎo)液B維持3～5d，至脂滴增大，進行油紅O染色；倒置光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照記錄。

1.2.4 大鼠皮膚深度燒傷模型的建立 將SD大鼠用10%水合氯醛（劑量0.3ml/100g）腹腔注射麻醉，麻醉滿意后用電推剪和脫毛劑去盡大鼠背部體毛；常規(guī)消毒鋪單，在大鼠背部兩側(cè)分別暴露直徑約25mm圓形皮膚，其余皮膚覆蓋隔熱板保護，在皮膚暴露處涂抹固體酒精，迅速點火燃燒30s達Ⅲ°燒傷；醫(yī)用無菌手術(shù)剪沿大鼠背部焦痂邊緣將其全層剪除；模型建立過程見圖1。

圖1 大鼠Ⅲ°燒傷模型建立過程（a：大鼠背部對稱備皮；b：固體酒精燒傷，可見創(chuàng)面基底白色皮革樣變；c：焦痂切除術(shù)后）

1.2.5 大鼠深度燒傷治療模型分組 根據(jù)自身對照實驗要求，將大鼠深度燒傷治療模型分成兩組。實驗組為人工真皮+ADSCs治療，取ADSCs細胞懸液（濃度為1×106個/ml）多點注射于大鼠背部左側(cè)創(chuàng)面及創(chuàng)周皮下，將人工真皮修剪至與大鼠背部創(chuàng)面等大，將其海綿層緊貼創(chuàng)面，用5-0絲線縫合硅膠膜與創(chuàng)緣?？p合固定。對照組為人工真皮+0.9%氯化鈉注射液治療，0.9%氯化鈉注射液多點注射于大鼠背部右側(cè)創(chuàng)面及創(chuàng)周皮下，將人工真皮修剪至與大鼠背部創(chuàng)面等大，將其海綿層緊貼創(chuàng)面，用5-0絲線縫合硅膠膜與創(chuàng)緣。分別于治療后7、14、21d用數(shù)碼相機拍攝大鼠背部創(chuàng)面并測量、記錄其創(chuàng)面最大直徑以評估創(chuàng)面愈合情況。

1.2.6 大鼠創(chuàng)面皮膚取材及處理 在術(shù)后21d時處死大鼠，常規(guī)消毒鋪單，沿大鼠背部創(chuàng)面范圍用無菌手術(shù)剪剪開皮膚，充分游離皮下后取下雙側(cè)創(chuàng)面皮膚組織，用于冷凍切片。在熒光顯微鏡下觀察冷凍切片評估實驗組與對照組創(chuàng)面情況。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用GraphPad Prism5.0統(tǒng)計軟件；計量資料以表示，組間比較采用配對t檢驗；P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠ADSCs的分離、培養(yǎng)結(jié)果 光鏡下可見，ADSCs 1次傳代后細胞呈梭形生長，原代及第2代細胞還有少量血細胞混雜，到第3代則較前明顯純凈，第3～10代內(nèi)細胞基本按對數(shù)生長，形態(tài)均一，見圖2。

圖2 大鼠第3代ADSCs光鏡下所見（a：×40；b:×100）

2.2 大鼠ADSCs細胞表型鑒定結(jié)果 大鼠ADSCs高表達MSC標記物CD29、CD90、CD44，對于造血干細胞表面標志物CD34、白細胞共同抗原CD45則呈現(xiàn)低表達。大鼠ADSCs流式細胞圖見圖3。

圖3 大鼠ADSCs流式細胞圖

2.3 大鼠ADSCs多向分化能力鑒定結(jié)果 光學(xué)顯微鏡下可見，ADSCs經(jīng)成骨誘導(dǎo)后茜素紅染色下顯現(xiàn)出深色鈣結(jié)節(jié)，表明成骨細胞分化成功，見圖4（插頁）。ADSCs經(jīng)成脂誘導(dǎo)后油紅O染色下，可見細胞質(zhì)內(nèi)有大小不一的橘黃色脂滴，見圖5（插頁），表明成脂細胞分化成功?？梢?，ADSCs具有向成骨細胞、脂肪細胞分化的能力。

圖4 大鼠ADSCs成骨分化光學(xué)顯微鏡下所見（茜素紅染色；a:×100；b:×200；c:×400；d:油鏡）

圖5 大鼠ADSCs成脂分化光學(xué)顯微鏡下所見（油紅O染色；a:×100；b:×200；c:×400；d:油鏡）

圖6 實驗組與對照組創(chuàng)面愈合情況比較（a：治療后；b：治療后7d；c：治療后14d；d：治療后21d）

2.4 實驗組與對照組創(chuàng)面愈合情況比較 治療后7、14、21d兩組創(chuàng)面愈合情況見圖6（插頁）；治療后14d時，實驗組創(chuàng)面最大直徑明顯小于對照組（P＜0.05），即實驗組創(chuàng)面愈合速度比對照組明顯增快，見圖7。

圖7 實驗組與對照組創(chuàng)面愈合情況（最大直徑）比較（a：治療后7d；b：治療后14d；c：治療后21d）

2.5 治療后21d實驗組與對照組創(chuàng)面冷凍切片觀察比較 治療后21d，實驗組創(chuàng)面在熒光顯微鏡下可見散在點狀綠色熒光，而對照組未觀察到明顯熒光，見圖8（插頁）。

圖8 治療后21d實驗組與對照組創(chuàng)面冷凍切片熒光顯微鏡下所見（a：實驗組；b：對照組；×40）

3 討論

ADSCs作為生物成體MSC的一種，廣泛分布于各物種不同部位的脂肪組織中，其數(shù)量巨大，取材方便，體外擴增和自我更新能力很強；更重要的是其具有多向分化潛能，如分化為脂肪、骨、軟骨、骨骼肌、平滑肌、心肌、表皮、肝細胞、造血細胞以及神經(jīng)元細胞等[10]，ADSCs是真正意義上的具有多向分化潛能的干細胞。本研究結(jié)果顯示，來源于大鼠的ADSCs具備良好的分化能力，可向成骨細胞、成脂細胞分化。

ADSCs具有MSC這一類細胞的特異性表面標志，表達大量的黏附分子，如持續(xù)表達CD9、整合素β1和α4、細胞間黏附分子1、CD105、血管細胞黏附分子和活化淋巴細胞黏附分子，表達Ⅰ類組織相容性蛋白HLA-ABC，但ADSCs并不表達造血細胞表面標志如CD14、CD34或CD45，不表達Ⅱ類組織相容性抗原HLA-DR及內(nèi)皮細胞標志CD31，不表達共刺激因子B7-1、B7-2和CD40。ADSCs不表達MHC2Ⅱ類分子和B7-1、B7-2和CD40等共刺激分子，這樣會導(dǎo)致效應(yīng)性T細胞無法激活，使輔助性T細胞無反應(yīng)性而促成免疫耐受，從而表現(xiàn)出這一更為重要的生物學(xué)特性——低免疫原性，這就使同種異體ADSCs移植變?yōu)榭赡?，從而擺脫了必須自體干細胞回植的局限，大大提高了實用性。本研究中，流式細胞分析結(jié)果證明分離出的ADSCs表面標志物符合相關(guān)文獻報道。同時，移植了ADSCs的大鼠創(chuàng)面并未出現(xiàn)嚴重的排異反應(yīng)，亦有力地證明了ADSCs的低免疫原性。

近年來關(guān)于ADSCs促進燒傷創(chuàng)面愈合的研究已有了長足的進展[11]，如Lu等[12]發(fā)現(xiàn)直接將ADSCs注射到移植皮瓣下有助于創(chuàng)面愈合，然而類似治療有諸多弊端，如排異反應(yīng)明顯、效果不穩(wěn)定等，但其中最嚴重的是當干細胞離開創(chuàng)面局部環(huán)境進入血液循環(huán)后將表現(xiàn)出極高的癌變性進而造成腫瘤，這與干細胞本身的生物學(xué)特性有密切的關(guān)系[13]。

基于以上發(fā)展，近年來不少學(xué)者嘗試以各種人工皮膚或真皮支架作為載體，將ADSCs種植于其表面或內(nèi)部后應(yīng)用于各種創(chuàng)面的治療[14-18]，如Altman等[15]將ADSCs種植于兩種細胞外基質(zhì)支架（小腸黏膜基質(zhì)支架、脫細胞真皮基質(zhì)支架）及另外一種膠原-硫酸軟骨素-透明質(zhì)酸復(fù)合物支架，而Meruane等[18]將ADSCs種植于商品化的生物支架上，后將它們應(yīng)用到了各種皮膚疾病模型的創(chuàng)面治療上并收到了滿意的療效，并各自闡述了ADSCs在此種環(huán)境下促進創(chuàng)面愈合的機制。

膠原人工真皮是用組織工程學(xué)方法構(gòu)建的可降解的真皮替代物，國際上最早形成商品并投入臨床應(yīng)用的是美國的Integra公司，隨后全世界陸續(xù)有數(shù)種同類型產(chǎn)品上市，包括本研究中使用的日本人工真皮皮耐克。皮耐克是一種新型的由膠原蛋白海綿和硅膠膜組成的雙層結(jié)構(gòu)人工真皮，其內(nèi)層海綿所含的膠原蛋白提取自豬肌腱，海綿厚度約3mm，具有多孔的三維結(jié)構(gòu)，可為真皮再生提供支架，誘導(dǎo)真皮重建；其外層的硅膠膜則能夠為創(chuàng)面提供機械保護和濕潤環(huán)境，利于肉芽組織生長。近年來，學(xué)者們對于皮耐克的臨床應(yīng)用已經(jīng)進行了大量實踐與研究，發(fā)現(xiàn)皮耐克在治療慢性創(chuàng)面[19]、皮膚撕脫傷[20]、深度組織缺損[21-22]等方面均有良好的臨床效果。

本研究使用ADSCs聯(lián)合人工真皮共同作用于創(chuàng)面，在治療后7d時，兩組創(chuàng)面最大直徑并無統(tǒng)計學(xué)差異，而在治療后14d時，實驗組創(chuàng)面愈合速度比對照組要快。該結(jié)果表明，在深度燒傷創(chuàng)面愈合的中后期，ADSCs聯(lián)合人工真皮能發(fā)揮更明顯的作用，這應(yīng)當與人工真皮內(nèi)層多孔的三維結(jié)構(gòu)和外層硅膠膜為細胞生長提供的良好空間、適宜微環(huán)境密不可分。同時，在本研究中，大鼠創(chuàng)面愈合后的皮膚組織冷凍切片在熒光顯微鏡下顯示，實驗組創(chuàng)面仍可見散在點狀綠色熒光，提示人工真皮中的ADSCs在深度燒傷創(chuàng)面可長期存活，從而保證其在創(chuàng)面愈合的炎癥期、增生期、重塑期持續(xù)發(fā)揮作用。

綜上所述，ADSCs和人工真皮共同作用于大鼠深度燒傷創(chuàng)面，可促進其創(chuàng)面愈合，為臨床深度燒傷的治療提供了一種新思路。本研究闡述了ADSCs與人工真皮共同促進深度燒傷創(chuàng)面愈合的可行性，但由于創(chuàng)面愈合是一個極其復(fù)雜的生物學(xué)過程，存在多種細胞間的相互作用，因此，ADSCs聯(lián)合人工真皮治療的具體生物學(xué)機制仍不十分明確，仍有待進一步深入研究探討。

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Adipose-derived mesenchymal stem cells combined with PELNAC for repairing deep burn wound in rats

FAN Youfen,LE Xin,JIN Guoying.Department of Burn Surgery,Ningbo No.2 Hospital,Ningbo 315000,China

ObjectiveTo assess the efficacy of adipose-derived mesenchymal stem cells(ADSCs)combined with artificial dermis(PELNAC?)for repairing deep burn wound in rats. Methods ADSCs were isolated from adult SPF grade green fluorescent protein-transgenic rats.The specific cell surface markers of ADSC were analyzed with flow cytometry,the differentiation of ADSCs to osteoblasts was induced and the multilineage differentiation potential was observed.The third-degree burn wound model was induced on the back of Spregue-Dawley(SD)rats.The model rats were randomly divided into two groups:rats in test group(n=20)

ADSCs+PELNAC?for wound repairing and those in control group(n=20)received saline+PELNAC?.The maximum diameter of wound on d7,d14 and d21 after burns was measured,respectively.On the d21 the skin samples of burn area were taken to evaluate wound healing by frozen section. Results The ADSCs were successfully isolated,cultured,and identified.The ADSCs had the ability to proliferate continuously and showed characteristics of multi-potent mesenchymal stem cells.The results of flow cytometry showed that CD44,CD90 and CD29 were highly expressed in ADSCs,while the hematopoietic cell surface marker CD34 and leukocyte common antigen CD45 were lowly expressed.On the d14 after burns,the maximum diameter of the wound was significantly lower in test group than that in control group(P＜0.05).On d21 after burns,fluorescence microscope showed scattered fluorescence was distributed in ADSCs-transplanted wound tissue in test group,but not in control group. Conclusion The combination of ADSCs with artificial dermis(PELNAC?)can significantly accelerate wound healing,indicating that it might be an effective method for treating deep burn.

Deep burn Artificialdermis ADSCs

10.12056/j.issn.1006-2785.2017.39.19.2017-1744

浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技計劃（2013KYB234）

315000 寧波市第二醫(yī)院燒傷科

范友芬，E-mail：13906683613@163.com

2017-07-22）

（本文編輯：李媚）