劉夢蝶 ，唐慧 ，李潔 ，嚴(yán)守雷 ，王清章

（1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，武漢，430070；2.湖北省水生蔬菜保鮮加工工程技術(shù)研究中心）

空氣放電對尖孢鐮刀菌的活力及其超微結(jié)構(gòu)的影響

劉夢蝶1，唐慧1，李潔2，嚴(yán)守雷1，王清章1

（1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，武漢，430070；2.湖北省水生蔬菜保鮮加工工程技術(shù)研究中心）

采用空氣放電技術(shù)對尖孢鐮刀菌進行體外抑菌試驗。試驗結(jié)果表明，空氣放電對菌絲生長和孢子萌發(fā)有顯著的抑制作用（P＜0.05），且抑制效果與處理時間呈正相關(guān)；通過掃描電鏡和透射電鏡觀察，發(fā)現(xiàn)空氣放電處理后的菌絲體干癟褶皺且表面粗糙，外層結(jié)構(gòu)不完整；菌絲細胞和孢子細胞形態(tài)不規(guī)則，細胞壁內(nèi)陷或者突起，厚薄不均勻，其中孢子細胞內(nèi)出現(xiàn)大量液泡且液泡體積較大，細胞質(zhì)失去緊致結(jié)構(gòu)；利用AO/EB熒光染料標(biāo)記孢子細胞，結(jié)果顯示空氣放電處理顯著促進孢子凋亡（P＜0.05）。

空氣放電；尖孢鐮刀菌；抑制作用；超微結(jié)構(gòu)

利用空氣放電生成氣對尖孢鐮刀菌進行體外抑菌試驗，研究空氣放電處理對尖孢鐮刀菌菌絲和孢子的生長、凋亡及超微結(jié)構(gòu)的影響，為空氣放電抑制尖孢鐮刀菌的機理研究提供試驗依據(jù)。

圖1 尖孢鐮刀菌菌絲生長抑制率

1 材料與方法

1.1 試驗材料與設(shè)備

①菌種 尖孢鐮刀菌（F.oxysporum）由本實驗室對蓮藕貯藏期病原菌進行分離保存。

②試劑 馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（PDA）：北京陸橋責(zé)任技術(shù)有限公司；AO/EB染料：上海貝博生物公司。

③儀器 臭氧變送器MIC-O3，負離子發(fā)生器XA-1：深圳市藍月測控技術(shù)有限公司；掃描電鏡：日本NTC公司；透射電鏡：日本HITACHI公司；熒光顯微鏡：日本Olympus公司。

圖2 尖孢鐮刀菌孢子萌發(fā)率

1.2 試驗方法

①試驗設(shè)計 F.oxysporum置于PDA平板上培養(yǎng)6 d后，在菌落邊緣打出直徑6mm的菌餅移至新的PDA平板中央，當(dāng)密閉空氣放電設(shè)備內(nèi)氣體中ozone和NAI生成氣達到設(shè)定濃度后，將樣品放入ozone（濃度 3 500 mg/m3）、NAI（濃度 6×106ions/cm3）、ozone＋NAI同時處理（3 500 mg/m3＋6×106ions/cm3），處理時間分別為 6、12、18、24、30、36 h，處理完畢后立即將平板倒置于26℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每個處理重復(fù)3次，以不做任何處理為對照。

②抑菌率的測定 培養(yǎng)3 d后，用“十”字交叉法測定其菌落擴展直徑，計算其抑菌率[3，4]。抑菌率（%）=（a-b）/a，a 為對照菌落的平均直徑，b 為處理菌落的平均直徑。

③孢子萌發(fā)抑制率的測定 培養(yǎng)6 d后，采用凹玻片法測孢子的萌發(fā)率[5]，將上述經(jīng)不同處理后的培養(yǎng)皿上的分生孢子用無菌水洗下，離心（1 500 r/min，5 min）洗滌得到純凈孢子，加適量無菌水使其濃度達到在顯微鏡下每個視野中有30～50個孢子，另設(shè)空白對照，每組重復(fù)3次，26℃ 恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h，觀察孢子的萌發(fā)情況。每個玻片按5點取樣法觀察5個視野，計算孢子的萌發(fā)抑制率。

④菌絲超微結(jié)構(gòu)的觀察 a.菌絲形態(tài)掃描電鏡的觀察。將對照菌絲和處理18 h后培養(yǎng)6 d的菌絲刮下，離心（1 500 r/min，5 min，4℃）勾取菌絲并洗滌。用2.5%戊二醛溶液固定2.5 h；0.1mol/L磷酸鹽緩沖液（Phosphate buffered saline，PBS）沖洗 4 次，每次15min；用30%、50%、70%、80%、90%、100%系列濃度梯乙醇各脫水10min，醋酸異戊酯置換25min，真空干燥后鍍金[6]。制好的掃描電鏡樣品在掃描電鏡下觀察、拍照。

b.菌絲細胞透射電鏡的觀察。同上得到純凈的菌絲。在4℃ 下用3%的戊二醛固定2 h，0.1mol/L PBS沖洗3次，每次10 min，浸泡于1%鋨酸溶液中，4℃ 放置 1 h，0.1 mol/L PBS緩沖液沖洗 3次，每次10min，50%、70%、90%系列濃度梯度的乙醇脫水15min，再用100%的丙酮脫水3次，每次10min，最后用環(huán)氧樹脂作為包埋劑進行包埋，包埋后將樣品放入恒溫箱中進行聚合，制成超薄切片，分別用醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛各染色30min[7]。制備好的樣品置于透射電鏡下觀察并記錄。

⑤孢子超微結(jié)構(gòu)的觀察 將對照組孢子和處理18 h后培養(yǎng)6 d的孢子用無菌水洗下，離心（1 500 r/min，5 min，4℃）棄上清液并洗滌得到純凈的孢子。采取相同方法制備透射電鏡樣品并觀察。

⑥AO/EB（吖啶橙/溴乙錠）熒光標(biāo)記檢測細胞凋亡 將對照組孢子和處理18 h后培養(yǎng)6 d的孢子用無菌水洗下，離心（1 500 r/min，5 min，4℃）洗滌得到純凈孢子，加1.5mL無菌水重新懸浮。取各處理孢子懸浮液 50μL，分別加入 AO/EB染料2μL混勻，30 s后于熒光顯微鏡下觀察結(jié)果并計數(shù)200 個細胞[8]。

1.3 數(shù)據(jù)分析及處理

所有試驗重復(fù)3次，試驗所得數(shù)據(jù)用Data Processing System（DPS 7.05）軟件進行顯著性分析，采用Origin 8.0軟件進行數(shù)據(jù)處理和圖表制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 空氣放電對尖孢鐮刀菌菌絲生長的影響

由圖 1可以看出，ozone、NAI、ozone＋NAI 3 種處理方式對菌絲的生長均有抑制作用，處理時間越長抑菌效果越好，兩者呈正相關(guān)關(guān)系。其中ozone＋NAI的抑制作用最明顯，其次是ozone處理組，NAI處理抑制作用最弱，說明 ozone＋NAI處理組較 ozone和NAI單獨處理組有明顯的增效作用。由圖1可看出，24 h前ozone＋NAI的抑菌效果顯著強于ozone和 NAI單獨處理組 （P<0.05），24 h后這種差異逐漸減小，30 h后各組間差異不顯著。

圖3 空氣放電對尖孢鐮刀菌菌絲形態(tài)的影響

2.2 空氣放電對尖孢鐮刀菌孢子萌發(fā)的影響

由圖 2可以看出，ozone、NAI、ozone＋NAI 3 種處理方式對孢子萌發(fā)均有明顯抑制作用，孢子萌發(fā)率與處理時間呈負相關(guān)，處理時間越長孢子萌發(fā)率越低，即處理時間越長對孢子細胞損傷越大，降低其萌發(fā)率。ozone＋NAI處理對孢子細胞損傷最大，其次為ozone和NAI單獨處理組。結(jié)合圖 2 可知，ozone＋NAI的抑菌效果最強，ozone單獨作用的抑菌效果優(yōu)于NAI單獨作用（P<0.05）。

圖4 空氣放電對尖孢鐮刀菌菌絲細胞形態(tài)的影響

2.3 空氣放電對尖孢鐮刀菌菌絲形態(tài)的影響

通過掃描電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)（圖3），對照組菌絲形態(tài)正常，菌絲較為飽滿，菌絲體表面光滑，粗細均勻一致，無褶皺或凹陷出現(xiàn)；經(jīng)ozone、NAI、ozone+NAI處理后的菌絲形態(tài)發(fā)生了明顯的變化，菌絲體干癟褶皺且表面粗糙，外層結(jié)構(gòu)不完整，其中ozone+NAI處理組菌絲體變形嚴(yán)重，說明ozone+NAI處理組較ozone和NAI單獨處理組抑菌效果更為明顯。

2.4 空氣放電對尖孢鐮刀菌菌絲細胞的影響

通過透射電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)（圖4），對照組菌絲細胞呈圓形或者橢圓形，細胞較為正常飽滿； 經(jīng) ozone、NAI、ozone+NAI處理后的菌絲細胞發(fā)生較為明顯的變化，細胞形態(tài)極不規(guī)則，細胞壁內(nèi)陷或者突起。ozone+NAI處理對菌絲細胞的損傷比ozone和NAI單獨作用明顯，ozone處理對菌絲細胞的傷害大于NAI處理，以上結(jié)果說明空氣放電能夠?qū)е戮z細胞形態(tài)發(fā)生明顯變化。

2.5 空氣放電對尖孢鐮刀菌孢子細胞的影響

通過透射電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)（圖5），對照組孢子細胞形態(tài)正常，呈橢圓形，細胞壁厚薄均勻，細胞內(nèi)容物如線粒體、細胞核等細胞器結(jié)構(gòu)較為完整，均勻分布在細胞質(zhì)中且細胞質(zhì)較為緊致，細胞壁、細胞膜無破損，胞外無外滲物， 經(jīng) ozone、NAI、ozone+NAI處理后的孢子細胞形態(tài)不規(guī)則，細胞壁內(nèi)陷或者突起，細胞壁厚薄不均勻，且經(jīng)ozone+NAI處理后的孢子細胞壁更薄，細胞內(nèi)出現(xiàn)大量液泡且液泡體積較大，細胞質(zhì)失去緊致結(jié)構(gòu)，說明空氣放電破壞了細胞的細胞器及完整結(jié)構(gòu)。

圖5 空氣放電對尖孢鐮刀菌孢子細胞形態(tài)的影響

2.6 AO/EB熒光標(biāo)記檢測細胞凋亡

由圖6可以看出，未經(jīng)空氣放電處理的孢子細胞核染色質(zhì)大都呈現(xiàn)綠色熒光，說明孢子細胞結(jié)構(gòu)完整，細胞界限清晰，因為吖啶橙（AO）能自由透過細胞膜與DNA結(jié)合。而溴乙錠（EB）只能穿透破損細胞膜與DNA結(jié)合呈現(xiàn)橘紅色熒光，經(jīng)空氣放電處理后的孢子細胞橘紅色熒光明顯增多，說明孢子細胞膜受損，通透性發(fā)生變化，孢子可能失去了正常萌發(fā)的能力。

圖6 尖孢鐮刀菌孢子細胞AO/EB熒光標(biāo)記

2.7 空氣放電對孢子細胞凋亡的影響

根據(jù)正常孢子和凋亡孢子所標(biāo)記的吖啶橙和溴乙錠激發(fā)后的顏色差異，利用image pro plus 6.0對AO/EB熒光圖像進行分析得到不同處理組在18 h處理下的孢子細胞凋亡情況（圖7），可看出空氣放電處理組孢子凋亡率顯著高于未處理組 （P<0.05），且ozone+NAI處理組孢子凋亡率顯著高于ozone 和 NAI單獨處理組（P＜0.05），而 ozone 單獨作用效果優(yōu)于NAI單獨處理組，說明空氣放電能夠引起細胞凋亡，有明顯的抑菌作用。

圖7 空氣放電對尖孢鐮刀菌孢子細胞凋亡率的影響

3 結(jié)論

空氣放電對菌絲生長和孢子萌發(fā)有顯著的抑制作用 （P＜0.05），且抑制效果與處理時間呈正相關(guān)。3種處理中，ozone＋NAI處理組抑菌作用最為明顯，ozone單獨處理組的抑菌效果要優(yōu)于NAI單獨處理組。通過對菌絲、孢子超微結(jié)構(gòu)的觀察發(fā)現(xiàn)，空氣放電處理后的菌絲體皺縮變形，同時處理后的菌絲細胞和孢子細胞形態(tài)發(fā)生變化，細胞壁內(nèi)陷或者突起，厚薄不均勻，其中孢子細胞內(nèi)出現(xiàn)大量液泡且液泡體積較大，細胞質(zhì)失去緊致結(jié)構(gòu)。AO/EB染色試驗表明空氣放電對細胞凋亡具有顯著促進作用（P＜0.05）。

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Effect on Vitality and Ultrastructure of Fusarium oxysporum by Air Discharge

LIU Mengdie1,TANG Hui1,LIJie2,YAN Shoulei1,WANG Qingzhang1
(1.College of Food Science and Technology,Huazhong Agricultural University,Wuhan 430070;2.Aquatic Vegetable Preservation and Processing Technology Engineering Research Center of Hubei Province)

In this study,air discharge technology was adopted to investigate the effects on the vitality and ultrastructure of Fusarium oxysporum by bacteriostatic test in vitro.The results showed that air discharge had significant inhibition on mycelial growth and spore germination of F.oxysporum (P＜0.05)and the inhibition ratio was positively correlated with treatment time.Structural damages were analyzed by scanning electron microscopy(SEM)and transmission electron microscopy(TEM).SEM observation indicated that,after air discharge treatments,the mycelium was dry and wrinkled with rough and incomplete surface.Cells of mycelia and spores were irregular in shape,and cell walls had invagination or protrusions with uneven thickness.In spore cells,a large number of vacuoles with a larger volume appeared and cytoplasm lost compact structure.The results by AO/EB fluorescent dye mark showed that air discharge significantly promoted the spore apoptosis(P＜0.05).

Air discharge;Fusarium oxysporum;Inhibition;Ultrastructure

S477+.3

A

1001-3547（2017）18-0147-05

10.3865/j.issn.1001-3547.2017.18.046

蓮藕是我國最重要的水生蔬菜，也是一種典型的經(jīng)濟作物[1]，全國栽培面積大，產(chǎn)量高。但由于蓮藕組織含水量高、營養(yǎng)豐富，在貯藏期間容易發(fā)生腐敗霉?fàn)€從而失去其商品價值。本實驗室前期研究確認(rèn)尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）是造成蓮藕采后腐敗的優(yōu)勢病原菌之一[2]。

空氣放電抑菌法是通過采用非均電場無聲放電或電暈放電使空氣電離產(chǎn)生放電生成氣，主要是臭氧（ozone）和負離子（Negative air ions，NAI，包括O2-、H2O-、O3-等），使整個殺菌環(huán)境中保持一定濃度的放電生成氣對微生物進行短期或長期處理，從而抑制菌絲生長、孢子萌發(fā)，破壞細胞壁和細胞膜組分與結(jié)構(gòu)，阻礙病原菌物質(zhì)代謝、呼吸代謝、能量代謝，進而誘導(dǎo)病原菌細胞凋亡。

“十二五”國家科技支撐計劃項目（2012BAD27B03）

劉夢蝶（1992-），女，碩士，主要研究方向為微生物學(xué)，E-mail：1615344789@qq.com

李潔，通訊作者，副教授，主要研究方向為農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工質(zhì)量與安全，E-mail：lijie1976@mail.hzau.edu.cn

2017-07-20