徐國鑫 ，尹靜靜 ，王茜 ，李效尊 ，高潔 ，陰筱 ，吳修

（1.山東省水稻研究所/山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水生生物研究中心，濟(jì)南，250100；2.山東濟(jì)寧市微山縣農(nóng)業(yè)局）

蓮初生葉發(fā)育過程顯微觀察

徐國鑫1，尹靜靜1，王茜2，李效尊1，高潔1，陰筱1，吳修1

（1.山東省水稻研究所/山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水生生物研究中心，濟(jì)南，250100；2.山東濟(jì)寧市微山縣農(nóng)業(yè)局）

利用樹脂切片技術(shù)，分析了蓮初生葉不同發(fā)育時(shí)期的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)初生葉的腹面具有乳突結(jié)構(gòu)，乳突細(xì)胞下層具有結(jié)構(gòu)特殊的柵欄狀細(xì)胞；靠近下表皮的部分細(xì)胞特化為分泌細(xì)胞，其液泡中的分泌物質(zhì)經(jīng)歷了先積累再消耗的變化過程。

蓮；初生葉；發(fā)育；顯微結(jié)構(gòu)

蓮（Nelumbo nucifera Gaertn.），又名蓮藕、荷、水芙蓉等，是蓮科蓮屬多年生水生植物，主要分布于我國熱帶、亞熱帶和溫帶淡水資源豐富的湖泊和沼澤等地區(qū)。蓮的葉片又稱為荷葉，其顏色青綠，氣味芬芳，含有蓮堿（Roemerine）、原荷葉堿（Pronuciferine）和荷葉堿（Nuciferine）等多種生物堿及維生素，自古就是藥膳中經(jīng)常選用的原料。傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為，荷葉苦平，歸肝、脾、胃，具有清解暑熱、升發(fā)清陽、涼血止血的作用，可以用于暑熱煩渴、暑濕泄瀉、便血便漏[1]。近代研究表明，荷葉有良好的降血脂、降膽固醇和減肥的作用[2～4]。

近年來，對(duì)荷葉的研究主要集中于其物質(zhì)成分和藥用價(jià)值方面，關(guān)于荷葉結(jié)構(gòu)和發(fā)育過程的研究較少，陳維培等[5]和李長春等[6]研究認(rèn)為蓮的葉片有3種形式，分別為沉水葉、浮水葉和挺水葉，3種類型葉片的顯微結(jié)構(gòu)有不同。刁英等[7]對(duì)10份蓮屬植物進(jìn)行了研究，認(rèn)為蓮屬植物的葉片均有明顯的柵欄組織和海綿組織之分，但細(xì)胞結(jié)構(gòu)緊密度（CTR）有一定的差別。目前尚缺少關(guān)于蓮葉片（荷葉）發(fā)育過程和精細(xì)結(jié)構(gòu)的研究。本研究利用樹脂切片結(jié)合組織化學(xué)技術(shù)，分析了蓮初生葉不同發(fā)育時(shí)期的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，觀察了蓮初生葉中特殊的柵欄狀細(xì)胞和分泌細(xì)胞的發(fā)育過程，并對(duì)其功能進(jìn)行了討論。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

蓮野生品種微山紅蓮種植于山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院飲馬泉試驗(yàn)基地水泥池中，于2016年秋季采收成熟的蓮籽。將蓮籽破殼后浸泡于4～5 cm深的清水中，置于28℃的培養(yǎng)箱中，16 h光照、8 h黑暗培養(yǎng)。 取吸漲后2、4、6、8 d的初生葉（第一片真葉）為材料。

1.2 試驗(yàn)方法

①試劑 a.戊二醛固定液。2.5%戊二醛溶液，用0.1mol/L的磷酸緩沖液（pH值6.8）配制。

b.番紅染色液。1 g番紅溶于10%乙醇，加入4mL苯胺油，用10%乙醇定容至100mL，50℃加熱溶解，冷卻至室溫后用濾紙過濾。

c.改良甲苯胺藍(lán)染色液。稱取0.5 g甲苯胺藍(lán)，加入 100 mL 30%的乙醇，加熱至 65℃，攪拌30min，濾紙過濾后避光保存。

②制片與染色 樹脂切片方法參照Wei等[13]的方法，將蓮藕葉片切成邊長1 mm的小塊，經(jīng)脫水、樹脂包埋后獲得3μm厚的切片。將粘附有樹脂切片的載玻片浸入番紅染色液中染色6 h，自來水沖洗，蒸餾水浸洗2次，每次3 min；再浸入甲苯胺藍(lán)染色液中，染色10min，自來水沖洗，蒸餾水浸洗2次，每次5min，35℃烘干。中性樹膠封片，鏡檢拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 蓮初生葉發(fā)育過程

蓮籽吸漲后2 d，初生葉開始突出果皮，葉柄為彎曲狀態(tài)；吸漲后4 d，初生葉及葉柄伸出果皮5～10 cm，葉片為卷曲狀態(tài)；吸漲后6 d，葉柄伸出果皮10～20 cm，葉片仍為卷曲狀態(tài)。吸漲后8 d，初生葉展開，直徑4～5 cm。

圖1 蓮初生葉表皮及葉肉細(xì)胞發(fā)育過程

2.2 蓮初生葉發(fā)育過程顯微結(jié)構(gòu)

在顯微鏡下觀察吸漲后2 d的初生葉橫切面，可以看到腹面的第一層細(xì)胞高度約為15μm，表面已經(jīng)發(fā)育出小乳突。第二層細(xì)胞截面呈較規(guī)則的正方形，這層細(xì)胞之下有2～3層排列較為緊密的葉肉細(xì)胞，形狀呈不太規(guī)則的多邊形，之后的4～6層細(xì)胞具有比較明顯的海綿組織特征，細(xì)胞間形成10～20μm的空隙；初生葉背面的2層細(xì)胞形狀規(guī)則，葉片背面無乳突（圖1A）。

吸漲后4 d，葉片腹面第1層乳突細(xì)胞的高度達(dá)到約20μm；第2層細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)濃厚，細(xì)胞核位于細(xì)胞中央，細(xì)胞內(nèi)未見明顯的淀粉粒。葉肉細(xì)胞體積增大，內(nèi)部可見較多的淀粉粒，小液泡開始融合。海綿組織間的空隙擴(kuò)大到50μm以上?？拷卤砥さ囊粚尤~肉細(xì)胞中，有大約一半細(xì)胞開始在液泡內(nèi)部積累染色較深的分泌物質(zhì)，特化為分泌細(xì)胞（圖 1B、E，圖 2A）。

圖2 蓮初生葉分泌細(xì)胞發(fā)育過程

吸漲后6 d，腹面的第2層細(xì)胞伸長為短棒狀，液泡位于細(xì)胞兩端，細(xì)胞核位于細(xì)胞中央，這層細(xì)胞排列緊密、形似柵欄，由于細(xì)胞質(zhì)濃厚被染成深藍(lán)色。葉片內(nèi)部的葉肉細(xì)胞形成中央大液泡。分泌細(xì)胞液泡中的分泌物質(zhì)累積呈液滴狀 （圖1C、F，圖 2B）。

吸漲后8 d，初生葉完全展開，腹面的乳突細(xì)胞膨大呈水滴狀。腹面第2層細(xì)胞的細(xì)胞核仍位于細(xì)胞中央，并且含有較濃厚的細(xì)胞質(zhì)。葉肉細(xì)胞被大液泡充滿，細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核被推擠到細(xì)胞邊緣。分泌細(xì)胞液泡中染色較深的物質(zhì)基本消失，葉片表現(xiàn)為成熟葉片的結(jié)構(gòu) （圖1D、G，圖 2C）。

3 討論與結(jié)論

有研究認(rèn)為，蓮有3種類型的葉片，分別為沉水葉、浮水葉和挺水葉[5,6]，但我們?cè)趯?duì)蓮長期的種植及研究中并沒有觀察到沉水葉的存在。蓮籽萌發(fā)后，子葉并不突破果皮，第1、2片真葉依次突出種皮，并在節(jié)上著生不定根；從第一片真葉開始，前期的數(shù)張葉片均為浮水葉，后期出現(xiàn)的葉片均為挺水葉。據(jù)此我們認(rèn)為，蓮只有浮水葉和挺水葉2種類型的葉片，所謂的“沉水葉”可能是一些浮水葉尚未穿透水面的早期生長階段。浮水葉和挺水葉結(jié)構(gòu)差異尚需進(jìn)一步研究。

已有報(bào)道蓮屬植物的葉片均有明顯的柵欄組織和海綿組織之分[7,9]，但是尚未見對(duì)蓮葉片結(jié)構(gòu)的詳細(xì)描述。本研究發(fā)現(xiàn)，蓮初生葉腹面的第一層細(xì)胞形成乳突，第二層細(xì)胞逐漸發(fā)育為短棒狀，其排列緊密、形似柵欄，但是這層細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)比較特殊，其細(xì)胞質(zhì)濃厚，細(xì)胞核位于細(xì)胞中央而液泡位于細(xì)胞兩端，在光鏡下未觀察到淀粉粒，目前不能確定是否含有葉綠體（圖1C、F）。由此可見，除外形像柵欄細(xì)胞外，這層細(xì)胞的內(nèi)部結(jié)構(gòu)與常見的葉肉柵欄組織差別較大，有可能是復(fù)表皮（Multiple epidermis）結(jié)構(gòu)的一部分，其超微結(jié)構(gòu)需進(jìn)一步借助透射電鏡進(jìn)行觀察。

靠近下表皮的分泌細(xì)胞的液泡中，在吸漲后第3～4 d可以觀察到分泌物質(zhì)的積累，到葉片展開前達(dá)到最多，葉片展開后分泌物質(zhì)減少。分泌物質(zhì)的積累過程恰好是初生葉不斷生長、穿過水層的階段，推測(cè)這些分泌物質(zhì)可能參與蓮初生葉穿透水層階段的防御，但分泌物質(zhì)的成分尚需要進(jìn)一步研究。

[1]國家藥典委員會(huì)．中國藥典（一部）[M]．北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2000：231．

[2]范婷婷，法魯克，方芳，等.荷葉總生物堿降脂減肥作用的體內(nèi)外試驗(yàn)[J].浙江大學(xué)學(xué)報(bào)：農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版，2013，39（2）：141-148.

[3]王俊杰，舒洋，龍婷，等.荷葉黃酮治療小鼠非酒精性脂肪肝的研究[J].中藥藥理與臨床，2011（2）：61-64.

[4]Zeng Z H,Yun Xu,Zhang B.Antidiabetic activity of a lotus leaf Selenium (Se)-polysaccharide in rats with gestational diabetes mellitus[J].Biological Trace Element Research,2017,176(2)：321-327.

[5]陳維培，張四美.蓮的生態(tài)解剖學(xué)研究[J].生態(tài)學(xué)報(bào)，1988，8（3）：277-282.

[6]李長春，黃天芳.蓮的形態(tài)結(jié)構(gòu)及個(gè)體發(fā)育概述[J].生物學(xué)教學(xué)，2013，38（1）：4-5.

[7]刁英，胡蓉，游永寧，等.蓮屬植物葉片及花瓣的比較解剖學(xué)研究[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，52（13）：3 059-3 061.

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Microscopic Observation on Development of Primary Leaves of Lotus Seed lings

XU Guoxin1,YIN Jingjing1,WANG Qian2,LIXiaozun1,GAO Jie1,YIN Xiao1，WU Xiu1
(1.Shandong Rice Research Institute/Hydrobiology Research Center,Shandong Academy of Agricultural Sciences,Jinan 250100;2.Agricultural Bureau of Weishan County in Jining City of Shandong)

In this study,the tissue and cell structure of lotus primary leaves at different development stages were clearly analyzed by semi-thin sections.The results showed that papilla structure only existed on the dorsal side of primary leaves,and beneath that was one layer of palisade cells with special structure inside.Somemesophyll cells were adjacent to lower epidermis specialized to secretory cells,with secretory material inside firstly accumulated and then consumed.

Lotus;Primary leaves;Development;Microstructure

S645.4

A

1001-3547（2017）18-0108-03

10.3865/j.issn.1001-3547.2017.18.032

山東省自然科學(xué)基金（ZR2016CP23，ZR2015PC017）資助

徐國鑫（1985-），男，博士，主要研究方向?yàn)橹参锛?xì)胞生物學(xué)，E-mail：xuguoxin1985@163.com

吳修，男，通訊作者，研究員，主要研究方向?yàn)樽魑镌耘鄬W(xué)，電話：0531-83179090，E-mail：wuxiu9090@163.com

2017-08-21