王海波，高 永，辛 胡

(1.曲靖師范學(xué)院，云南高原生物資源保護(hù)與利用研究中心，生物資源與食品工程學(xué)院，云南 曲靖 655011；2.曲靖師范學(xué)院，云南省高校云貴高原動(dòng)植物多樣性及生態(tài)適應(yīng)性進(jìn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 曲靖 655011)

小桐子HXT基因家族的全基因組鑒定及表達(dá)分析

王海波1，2，高 永1，2，辛 胡1

(1.曲靖師范學(xué)院，云南高原生物資源保護(hù)與利用研究中心，生物資源與食品工程學(xué)院，云南 曲靖 655011；2.曲靖師范學(xué)院，云南省高校云貴高原動(dòng)植物多樣性及生態(tài)適應(yīng)性進(jìn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 曲靖 655011)

為了進(jìn)一步理解己糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因家族的結(jié)構(gòu)特征以及其在植物逆境信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中的作用，基于小桐子基因組數(shù)據(jù)，鑒定到15個(gè)小桐子己糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因，并對(duì)其基因結(jié)構(gòu)、進(jìn)化關(guān)系、密碼子偏性及低溫表達(dá)特性進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，15個(gè)小桐子HXT基因聚類(lèi)為5個(gè)亞組，包含2～5個(gè)外顯子，且在基因上游調(diào)控區(qū)包含ABA、乙烯、干旱及低溫等逆境響應(yīng)元件。編碼蛋白質(zhì)都富含疏水性氨基酸，具有典型的12個(gè)α-螺旋跨膜區(qū)。另外，部分小桐子HXT基因存在交叉共線性關(guān)系及基因倍增現(xiàn)象，且密碼子的第3位堿基偏好使用U或A。熒光定量分析顯示，JcHXT_13L與JcHXT_C基因在小桐子的各器官中都有表達(dá)，其中，JcHXT_13L在莖中表達(dá)量較高，而JcHXT_C在根中表達(dá)量較高，JcHXT_13L與JcHXT_C在根與葉片中受低溫誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)明顯，與小桐子的抗冷性形成直接相關(guān)。為進(jìn)一步探索小桐子HXT基因的生物學(xué)功能及參與小桐子抗冷分子機(jī)制奠定了理論基礎(chǔ)。

小桐子；己糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白；己糖信號(hào)；基因組；表達(dá)分析

大量積累己糖等可溶性糖從而降低細(xì)胞的滲透勢(shì)是植物在逆境下緩解次生水分脅迫的重要途徑[1]。植物體一般通過(guò)促進(jìn)淀粉降解與胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)2種方式積累己糖，且轉(zhuǎn)運(yùn)方向與轉(zhuǎn)運(yùn)速率受到嚴(yán)格的調(diào)節(jié)。植物己糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Hexose transporter，HXT)作為一種單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Monosaccharide transporter，MST)主要執(zhí)行植物己糖等單糖的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程，其屬于主要易化子超家族(Major facilitator superfamily，MFS)，與酵母己糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ScHxts、ScGal2)、哺乳動(dòng)物葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(GLUTs)以及植物蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(SUTs)有較高的同源性[2-4]。具有典型的MFS家族成員特征，從N端到C端存在連續(xù)12次同源性較高的跨膜結(jié)構(gòu)，可能來(lái)源于具有6個(gè)跨膜區(qū)的蛋白家族在進(jìn)化中的分子擴(kuò)增[5]，而其他區(qū)域氨基酸序列保守性較差。

己糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的己糖轉(zhuǎn)運(yùn)能力依賴(lài)膜上H+-ATPase所建立的跨膜質(zhì)子動(dòng)力勢(shì)能，與pH值變化直接相關(guān)，且Boorer等[6]的研究表明己糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)己糖時(shí)，己糖與H+是有次序分2步連續(xù)完成的，這與哺乳動(dòng)物的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白機(jī)制不同。根據(jù)己糖與H+轉(zhuǎn)運(yùn)方向的差異，HXT包括H+/同向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、H+/異向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、己糖單向易化轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、H+/同向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白定位細(xì)胞膜、H+/異向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白定位液泡膜，都對(duì)外界pH值與跨膜質(zhì)子梯度解偶聯(lián)劑(羰基氰化物間氯苯腙CCCP、四苯基磷TPP+)敏感，而己糖單向易化轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白定位液泡膜，對(duì)外界pH值不敏感且具有雙向運(yùn)輸性[7]。

第一個(gè)高等植物的HXT基因來(lái)自于小球藻(Chlorellakessleri)[8]。迄今已經(jīng)從擬南芥中鑒定到己糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族的14個(gè)基因(AtSTP1～AtSTP14)[9]，但對(duì)于其家族分類(lèi)、進(jìn)化特征、己糖轉(zhuǎn)運(yùn)的差異性及功能調(diào)節(jié)還沒(méi)有進(jìn)行詳細(xì)研究，而對(duì)于小桐子己糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白以及其與抗冷性的關(guān)系研究也未見(jiàn)報(bào)道。小桐子屬大戟科(Euphorbiaceae)多年生木本油料植物，因其種子含油量高可生產(chǎn)生物柴油而備受關(guān)注[10]，本研究基于最新GenBank小桐子基因組數(shù)據(jù)庫(kù)，利用生物信息學(xué)方法共鑒定到15個(gè)小桐子HXT基因，在此基礎(chǔ)上對(duì)該家族基因及蛋白的基因結(jié)構(gòu)、系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系及低溫表達(dá)特性進(jìn)行了分析，為進(jìn)一步研究小桐子HXT基因的生物學(xué)功能提供了理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1試驗(yàn)材料及處理

選取飽滿的小桐子種子(采自云南省楚雄州元謀縣)，按照李忠光等[11]的方法進(jìn)行發(fā)芽處理，將發(fā)芽的種子播于消毒的培養(yǎng)土中并于恒溫培養(yǎng)箱(溫度26 ℃、相對(duì)濕度(RH)75%、光周期16 h/8 h)中生長(zhǎng)15 d至第2片真葉展開(kāi)，每天用無(wú)菌水潤(rùn)濕培養(yǎng)土。將生長(zhǎng)15 d的小桐子幼苗置于12 ℃、相對(duì)濕度75%、16 h/8 h光周期的低溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行低溫脅迫處理，分別取低溫脅迫0.5，3.0，12.0，24.0，48.0 h與對(duì)照(CK，正常培養(yǎng))的小桐子第2片真葉、莖及根，液氮速凍后保存于-80 ℃冰箱中用于RNA的提取。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1 小桐子HXT基因家族的鑒定 通過(guò)模式植物擬南芥數(shù)據(jù)庫(kù)(http：//www.arabidopsis.org/)檢索并下載擬南芥已經(jīng)鑒定出的14個(gè)HXT基因的蛋白序列，以此序列為種子序列對(duì)GenBank小桐子基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(登錄號(hào)：915)進(jìn)行tBlastN相似性檢索(閾值設(shè)置E<1e-10，序列相似性50%)，得到候選的小桐子HXT蛋白序列，通過(guò)Excel工具去除重復(fù)序列，之后將非冗余的HXT蛋白序列利用Pfam與GenBank CDD在線工具進(jìn)行結(jié)構(gòu)域鑒定，得到鑒定的小桐子HXT家族的蛋白序列，同時(shí)下載其對(duì)應(yīng)基因序列與mRNA序列。

1.2.2 小桐子HXT基因家族的序列分析 利用在線軟件GSDS(Gene Structure Display Server，http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/)進(jìn)行小桐子mRNA與基因序列比對(duì)以確定基因內(nèi)含子與外顯子的結(jié)構(gòu)并繪制基因結(jié)構(gòu)圖。將鑒定的小桐子HXT蛋白序列與擬南芥的HXT蛋白序列利用ClustalX(Version 2.0)進(jìn)行序列相似性比對(duì)，然后用MEGA 6.0軟件通過(guò)鄰接法(NJ)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，并采用自展法(Bootstrap)進(jìn)行檢驗(yàn)，同時(shí)利用GenDOC軟件對(duì)比對(duì)文件進(jìn)行結(jié)構(gòu)域分析。另外，利用ExPaSy提供的在線工具ProtParam(http：//web.expasy.org/protparam/)對(duì)得到的小桐子HXT蛋白質(zhì)序列進(jìn)行基本參數(shù)的分析。根據(jù)HXT的編碼區(qū)序列(Coding sequence，CDS)對(duì)小桐子基因組序列進(jìn)行BlastN相似性檢索得到各HXT基因起始密碼子ATG上游1 500 bp的調(diào)控序列，并通過(guò)PlantCARE(http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)對(duì)其順式作用元件進(jìn)行鑒定。利用軟件CodonW(Version1.4.2)對(duì)小桐子HXT基因的CDS序列進(jìn)行密碼子偏性分析，計(jì)算簡(jiǎn)并密碼子的相對(duì)使用度(Relative synonymous codon usage，RSCU)值。利用Mauve(Version 2.4)進(jìn)行小桐子HXT家族基因的復(fù)制共線性分析，同時(shí)利用Circos繪制HXT家族基因在小桐子基因組(JatCur_1.0)Scaffold的位置及基因間的共線性關(guān)系。

1.2.3 小桐子HXT基因家族的表達(dá)分析 利用兩步裂解法提取各組織材料的總RNA，并利用DNase Ⅰ(TianGen公司)消化RNA中的殘余基因組DNA，得到純化的總RNA。分別取3 μg總RNA，以混合逆轉(zhuǎn)錄引物(Random primer 0.1 μg/μL與Anchored Oligo(dT)18primer 0.5 μg/μl各占50%)，利用TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix(TransGen公司)合成第一鏈cDNA。以18SrRNA為內(nèi)參(GenBank登錄號(hào)：AY823528)，進(jìn)行小桐子HXT基因的RT-qPCR擴(kuò)增(表1)，20 μL反應(yīng)體系，每個(gè)樣品重復(fù)3次。擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性30 s；94 ℃變性10 s，53 ℃退火15 s，72 ℃延伸15 s，45個(gè)循環(huán)，之后增加溶解曲線程序：95 ℃ 10 s，65 ℃ 60 s，97 ℃ 1 s，連續(xù)檢測(cè)信號(hào)。采用2-ΔΔCt法進(jìn)行相對(duì)表達(dá)量分析。

表1 小桐子HXT基因RT-qPCR表達(dá)分析引物序列Tab.1 Primers used in J.curcas HXT gene expression analysis

2 結(jié)果與分析

2.1小桐子HXT的鑒定及系統(tǒng)進(jìn)化分析

以報(bào)道的擬南芥14個(gè)STP蛋白[9]為查詢(xún)序列對(duì)GenBank小桐子蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BlastP相似性檢索，共鑒定到15個(gè)小桐子HXT基因(JcHXT)(表2)，基因家族進(jìn)化分析(圖1)與擬南芥聯(lián)合進(jìn)化分析(圖2)顯示，HXT基因家族共分支為3個(gè)亞家族及5個(gè)亞組，除JcHXT_10L單獨(dú)為1個(gè)亞組外，其他4個(gè)亞組都包含3～4個(gè)成員，同時(shí)，存在少數(shù)基因串聯(lián)排列及原始基因復(fù)制進(jìn)化的現(xiàn)象，如JcHXT_CL(GenBank ID：105646066)與JcHXT_CL1(105646067)。GSDS基因結(jié)構(gòu)分析表明，小桐子HXT基因家族屬于小型基因，長(zhǎng)度分布在1 800(JcHXT_CL)～3 498 bp(JcHXT_13L)，具有2～5個(gè)外顯子(11個(gè)基因具有4個(gè)外顯子、JcHXT_6L具有2個(gè)外顯子、JcHXT_13L具有5個(gè)外顯子)(表2)，其中有10個(gè)基因包含5′-UTR或3′-UTR區(qū)域(JcHXT_6L1與JcHXT_8僅含有3′-UTR)。另外，各亞組內(nèi)基因的UTR區(qū)域有逐漸丟失的進(jìn)化趨勢(shì)，如亞組Ⅱ中，JcHXT_C具有5′-UTR與3′-UTR區(qū)，而組內(nèi)JcHXT_CL與JcHXT_CL1的第1與第4外顯子長(zhǎng)度與JcHXT_C剔除5′-UTR與3′-UTR的長(zhǎng)度基本相同，說(shuō)明其在進(jìn)化中失去了5′-UTR與3′-UTR區(qū)；亞組V中，JcHXT_13L具有5′-UTR與3′-UTR區(qū)，JcHXT_8丟失了5′-UTR 區(qū)，而JcHXT_8L卻丟失了5′-UTR與3′-UTR區(qū)(圖1)。

圖1 小桐子HXT 基因家族的基因結(jié)構(gòu)及進(jìn)化關(guān)系Fig.1 Gene structure and phylogenetic relationship of HXT gene family in J.curcas

2.2小桐子HXT的理化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)特征分析

小桐子15個(gè)HXT蛋白單體序列長(zhǎng)度為501～528 aa，與擬南芥報(bào)道的STP蛋白長(zhǎng)度范圍相似[9]。除JcHXT_8(等電點(diǎn)為7.05)外，等電點(diǎn)為8.71(JcHXT_14L2)～9.60(JcHXT_5L1)(表2)。聚類(lèi)及多序列比對(duì)顯示，小桐子HXT蛋白都包含典型的12個(gè)α-螺旋跨膜區(qū)，α-螺旋內(nèi)氨基酸殘基數(shù)量為19～23個(gè)，與ProtParam分析的小桐子HXT蛋白序列富含疏水性氨基酸(Val、Leu、Ile、Ala及Gly)的結(jié)果吻合。 TMHMM分析表明，第1，2 α-螺旋、第6，7 α-螺旋之間分別存在38，65個(gè)氨基酸殘基(以JcHXT_C為例)的長(zhǎng)蛋白序列，其中，第1，2 α-螺旋之間還存在一段-MFGYDVGISGGV-保守序列。可能與HXT蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)底物特異性有關(guān)[7]。而6次跨膜N端與6次跨膜C端α-螺旋序列存在較高的同源性(圖3)，推測(cè)小桐子HxT基因家族可能是由編碼6次跨膜蛋白基因的復(fù)制而形成的[5，12]。

表2 小桐子HXT蛋白的理化性質(zhì)及基因調(diào)控元件Tab.2 Physicochemical property and gene cis-acting elements of HXT in J.curcas

注：A.脫落酸ABA應(yīng)答元件；B.乙烯應(yīng)答元件；C.干旱脅迫應(yīng)答元件；D.低溫脅迫應(yīng)答元件；+.有；-.無(wú)。

Note：A. ABA responsive element (ABRE)；B. Ethylene responsive element (ERE)；C. Drought responsive element (MBS)；D. Cold responsive element (LTR)；+. Yes ；-.None.

小桐子的GenBank登錄號(hào)：XP_012091482、XP_012087224、XP_012087225、XP_012067145、XP_012067863、XP_012090476、XP_012090768、XP_012071435、XP_012069672、XP_012088637、XP_012077517、XP_012069596、XP_012069594、XP_012068718、XP_012068027；擬南芥的GenBank登錄號(hào)：NP_172592.1、NP_172214.5、NP_200960.2、NP_188627.1、NP_174718.1、NP_187247.1、NP_192114.1、NP_197997.1、NP_175449.1、NP_188628.1、NP_197718.1、NP_193879.4、NP_198006.1、NP_177845.1。

GenBank accession number ofJatrophacurcas(Jc)：XP_012091482，XP_012087224，XP_012087225，XP_012067145，XP_012067863，XP_012090476，XP_012090768，XP_012071435，XP_012069672，XP_012088637，XP_012077517，XP_012069596，XP_012069594，XP_012068718，XP_012068027；GenBank accession number ofArabidopsisthaliana(At)：NP_172592.1，NP_172214.5，NP_200960.2，NP_188627.1，NP_174718.1，NP_187247.1，NP_192114.1，NP_197997.1，NP_175449.1，NP_188628.1，NP_197718.1，NP_193879.4，NP_198006.1，NP_177845.1.

圖2通過(guò)鄰接法構(gòu)建的小桐子與擬南芥HTX蛋白進(jìn)化樹(shù)
Fig.2PhylogeneticanalysisofJ.curcasHXTproteinwithArabidopsisthaliana

螺旋線表示HXT蛋白的12個(gè)α-螺旋區(qū)(α-螺旋1～α-螺旋12)；三角形(▲)表示影響己糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性的關(guān)鍵氨基酸殘基Asp(位于第1與第2 α-螺旋區(qū)之間)。Helical lines indicate 12 alpha helical regions (α-helix1-α-helix12) of J.curcas HXT protein；Key Asp residue associated with HXT activity is marked by triangle (located between 1th and 2nd α-helix).

簡(jiǎn)并密碼子的相對(duì)使用度(RSCU)表示同一氨基酸的不同簡(jiǎn)并密碼子實(shí)際使用個(gè)數(shù)與理論使用個(gè)數(shù)的比值，RSCU=1(表示密碼子不存在偏好性)；RSCU1(表示密碼子偏性較強(qiáng))，是出現(xiàn)頻率較高的密碼子；RSCU<1(表示密碼子偏性較低)，是基因較少使用的密碼子。利用CodonW軟件計(jì)算15個(gè)小桐子HXT基因62個(gè)密碼子(去除編碼甲硫氨酸與色氨酸的密碼子)的RSCU值(表3)。結(jié)果表明，RSCU1的密碼子有26個(gè)，且多以U(14個(gè))或A(10個(gè))結(jié)尾，說(shuō)明小桐子HXT基因偏好使用以U或A結(jié)尾的密碼子。另外，計(jì)算結(jié)果還顯示，小桐子HXT基因終止密碼子偏好使用UAA(RSCU=1.40)。統(tǒng)計(jì)編碼小桐子HXT蛋白的氨基酸的密碼子總數(shù)表明，疏水性氨基酸如Leu(823個(gè))、Gly(743個(gè))、Ala(657個(gè))、Ile(649個(gè))、Val(624個(gè))的密碼子數(shù)量較高，這與HXT蛋白包含12段α-螺旋疏水跨膜區(qū)域相一致。

將15個(gè)小桐子HXT基因在小桐子基因組Scaffold上定位，結(jié)果表明，小桐子HXT基因在基因組中分布較為分散，15個(gè)HXT基因分布于10條Scaffold上，其中Scaffold119分布有3個(gè)，Scaffold660、Scaffold906、Scaffold23各分布有2個(gè)，其余6條Scaffold各分布1個(gè)。共線性分析顯示，部分HXT基因存在交叉共線性關(guān)系及復(fù)制關(guān)系，如JcHXT_C與JcHXT_8、JcHXT_6L、JcHXT_5L1，JcHXT_5L1與JcHXT_6L、JcHXT_14L2、JcHXT_8L1等(圖4)，表明小桐子HXT基因在進(jìn)化過(guò)程中，含有這些HXT基因的Scaffold或染色體片段發(fā)生了倍增(Paleopolyploidy)[5]。

表3 利用CodonW程序分析小桐子HXT家族基因密碼子偏性

注：下劃線加粗?jǐn)?shù)字(RSCU1)表示該密碼子使用頻率高；*.終止密碼子。

Note：Bold numbers with underline(RSCU 1)means codon usage with high frequency；*.The stop codon of UAA，UAG，and UGA.

外圈表示Scaffold；內(nèi)圈曲線表示基因間存在共線性。

2.3小桐子HXT基因家族的差異表達(dá)分析

PlantCARE分析表明，小桐子HXT基因的上游都包含大量調(diào)控序列，參與JcHXT基因的誘導(dǎo)表達(dá)。其中，有9個(gè)JcHXT基因包含干旱應(yīng)答元件，7個(gè)JcHXT基因包含ABA應(yīng)答元件，而JcHXT_13L與JcHXT_C基因都包含ABA應(yīng)答元件，響應(yīng)小桐子的低溫、干旱及其他逆境脅迫過(guò)程，并參與依賴(lài)ABA的低溫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程。熒光定量分析顯示，JcHXT_13L與JcHXT_C在小桐子的葉片中表達(dá)量都較低，而JcHXT_13L在莖中表達(dá)量較高，JcHXT_C在根中表達(dá)量較高(圖5)。另外，JcHXT_13L與JcHXT_C都屬于低溫誘導(dǎo)表達(dá)基因(圖6，7)，隨著低溫脅迫的進(jìn)行，與對(duì)照相比，JcHXT_13L在莖中24 h達(dá)到最大表達(dá)量，較對(duì)照提高6.67倍，JcHXT_C在葉片中12 h達(dá)到最大表達(dá)量，較對(duì)照提高363.56倍，而在根中，JcHXT_13L與JcHXT_C在低溫脅迫的初始階段(12 h以?xún)?nèi))上調(diào)表達(dá)都較弱，之后上調(diào)表達(dá)明顯，且表現(xiàn)出持續(xù)上調(diào)表達(dá)的趨勢(shì)。

圖5 小桐子不同組織中JcHXT_13L與JcHXT_C基因的差異表達(dá)分析

3 討論

研究表明：跨膜pH值變化(ΔpH)主要通過(guò)改變己糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)合己糖的Km值、調(diào)節(jié)己糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的活性、影響己糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的表達(dá)3個(gè)方面影響己糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對(duì)己糖的轉(zhuǎn)運(yùn)效率。對(duì)于高親和力己糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Km值為0.3 mmol/L)隨著pH值升高會(huì)降低對(duì)己糖的吸收，而低親和力己糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Km值為50 mmol/L)隨pH值升高會(huì)促進(jìn)對(duì)己糖的轉(zhuǎn)運(yùn)[7]，如轉(zhuǎn)擬南芥己糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因AtSTP1的非洲爪蟾卵母細(xì)胞隨外界pH值升高己糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對(duì)己糖的親和力增加[6]。而pH值對(duì)己糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性的影響可能與巰基/二硫鍵的互變相關(guān)，且連接第1，2個(gè)跨膜區(qū)的胞外環(huán)上的保守Asp具有重要的作用[12-13]，本研究中在所有小桐子HXT蛋白的第1，2 α-螺旋區(qū)也發(fā)現(xiàn)了保守的Asp殘基，且該Asp殘基存在于保守序列(-MFGYDVGISGGV-)之中，推測(cè)可能參與HXT蛋白的活性調(diào)節(jié)，也與HXT蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)底物特異性相關(guān)[7]。

圖6 小桐子JcHXT_13L基因在低溫脅迫下的相對(duì)表達(dá)量Fig.6 Relative expression levels of J.curcas JcHXT_13L under low chilling stress

圖7 小桐子JcHXT_C基因在低溫脅迫下的相對(duì)表達(dá)量Fig.7 Relative expression levels of J.curcas JcHXT_C under chilling stress

此外，pH值變化可以作為信號(hào)影響己糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的表達(dá)，如擬南芥液泡單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因AtTMT1與AtTMT2，同時(shí)受到低溫脅迫的誘導(dǎo)[14]。另外，單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因受多種逆境脅迫的調(diào)節(jié)，Bourque等[15]研究表明，煙草葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在逆境下吸收葡萄糖受到抑制，加快細(xì)胞程序性死亡以增強(qiáng)抗逆性，與Mamun等[16]研究水稻在冷害中OsMST8基因表達(dá)受到抑制從而影響雄性配子體發(fā)育的結(jié)果類(lèi)似[16]，同時(shí)，Norholm等[17]發(fā)現(xiàn)擬南芥己糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白AtSTP13也有增加抗逆性的作用，而AtSTP3可被創(chuàng)傷誘導(dǎo)[18]，細(xì)菌角斑病可促進(jìn)AtSTP4與細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶(Cell wall invertase)的表達(dá)[19]，證明質(zhì)外體中蔗糖的水解和單糖的轉(zhuǎn)運(yùn)吸收與逆境應(yīng)答有密切的關(guān)系[20]。本研究中鑒定到的15個(gè)小桐子HXT基因都包含不同的逆境響應(yīng)元件，表明HXT基因廣泛參與小桐子多種逆境脅迫的應(yīng)答過(guò)程，而JcHXT_13L與JcHXT_C在小桐子不同器官中都受到低溫脅迫的誘導(dǎo)表達(dá)，且基因上游存在ABA響應(yīng)元件，推測(cè)其可能通過(guò)依賴(lài)ABA的低溫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑進(jìn)行調(diào)控。

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Genome-wideIdentificationandExpressionAnalysisofHXTGeneFamilyinJatrophacurcas

WANG Haibo1，2，GAO Yong1，2，XIN Hu1

(1.Qujing Normal University，Center for Yunnan Plateau Biological Resources Protection and Utilization，College of Biological Resource and Food Engineering，Qujing 655011，China；2.Qujing Normal University，Key Laboratory of Yunnan Province Universities of the Diversity and Ecological Adaptive Evolution for Animals and Plants on YunGui Plateau，Qujing 655011，China)

In order to further understand the structure characteristic of hexose transporter and its functions in plant stress signal transduction，15HXTgenes were identified based on complete genome data ofJatrophacurcas，then the gene structure，evolutionary relationship，codon bias，and chilling expression feature were analyzed. The results showed that 15J.curcasHXTgenes were classified to 5 subgroups，and owned 2-5 exons，cis-acting elements response to ABA，ethylene，drought and cold were found in the gene upstream. Encoding proteins with abundant hydrophobic amino acids possess typical 12 α-helix transmembrane regions. Gene location analysis revealed that someHXTgenes were observed the phenomenons of cross-collinearity and gene paleopolyploidy. Codon bias analysis showed thatHXTgenes inJ.curcaswere biased toward the synonymous codons with U or A at the third codon position. RT-qPCR analysis revealed thatJcHXT_13LandJcHXT_Cexpressed differently in different tissues，with abundant in stem and root，and remarkably cold-induced expression in root and leaf，respectively. This study laid a theoretical foundation for further dissection on biological function and chilling-resistance molecular mechanism ofHXTfamily inJ.curcas.

Jatrophacurcas；Hexose transporter；Hexose signal；Genome；Expression analysis

2017-07-08

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31460179)

王海波(1980-)，男，山西長(zhǎng)治人，副教授，博士，主要從事植物逆境分子生物學(xué)研究。

Q78

A

1000-7091(2017)05-0097-09

10.7668/hbnxb.2017.05.015