江流，范文來，徐巖

(教育部工業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江南大學(xué) 生物工程學(xué)院釀造微生物與應(yīng)用酶學(xué)研究室，江蘇 無錫， 214122)

芝麻香型機(jī)械化和手工工藝酒醅發(fā)酵過程中的糖與糖苷

江流，范文來*，徐巖

(教育部工業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江南大學(xué) 生物工程學(xué)院釀造微生物與應(yīng)用酶學(xué)研究室，江蘇 無錫， 214122)

采用六甲基二硅氮烷(HMDS)作為衍生劑，結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜(gas chromatography-mass spectrometry ，GC-MS)技術(shù)研究了機(jī)械化和手工工藝酒醅中的糖類化合物(糖、糖苷和糖醇)在發(fā)酵過程中的變化。研究結(jié)果表明，酒醅發(fā)酵過程中，糖總量呈下降趨勢(shì)，糖醇總含量呈上升趨勢(shì)，糖苷呈現(xiàn)先上升再下降趨勢(shì)。手工酒醅中葡萄糖、糖苷、糖醇含量均明顯高于機(jī)械化酒醅，但機(jī)械化酒醅中阿拉伯糖含量比手工酒醅高；2種工藝酒醅中的二糖含量差異不明顯。

酒醅；糖醇；糖；糖苷；硅烷化；氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)；發(fā)酵

白酒酒醅發(fā)酵過程中，原料淀粉被微生物分解為葡萄糖等糖類，還原糖進(jìn)一步被微生物轉(zhuǎn)化為各種小分子物質(zhì)，這些小分子物質(zhì)在常溫、長期發(fā)酵時(shí)發(fā)生各種化學(xué)反應(yīng)(如糖與氨基酸的反應(yīng))，產(chǎn)生風(fēng)味物質(zhì)。糖是微生物的重要碳源，能影響微生物的生長、繁殖[1]。

目前我國酒醅中糖的研究主要集中在還原糖[2-3]和總糖[4]方面，較少涉及糖及糖醇的研究，未見糖苷研究的報(bào)道。唐潔[5]曾利用高效液相色譜法(HPLC)測(cè)定了清香型酒醅發(fā)酵過程中葡萄糖的變化；2015年孫潔等人[6]應(yīng)用離子色譜方法測(cè)定了酒醅中的赤蘚糖醇、木糖醇、葡萄糖等10種糖和糖醇；而被大量研究的國外飲料酒發(fā)酵過程中的糖苷，則未見在我國白酒酒醅中的進(jìn)行過相關(guān)報(bào)道。

測(cè)定糖類物質(zhì)(糖、糖醇、糖苷)的方法主要有高效液相色譜法(HPLC)[7]、毛細(xì)管電泳法(CE)[8]、氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)[9]、離子色譜法[6]等。硅烷化衍生結(jié)合GC-MS法是檢測(cè)多羥基化合物的常用方法[9-11]，常見硅烷化試劑有六甲基二硅氮烷(HMDS)、三甲基氯硅烷(TMCS)、N-(特丁基二甲基硅)-N-甲基三氟乙酰胺(MTBSTFA)、N,O-雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(BSTFA)等。硅烷化HMDS因其與糖反應(yīng)時(shí)間短，響應(yīng)較好，在葡萄酒研究中獲得廣泛應(yīng)用[10]。

本研究以芝麻香型機(jī)械化和手工2種不同工藝的酒醅為研究對(duì)象，采用HMDS衍生化結(jié)合GC-MS方法對(duì)糖、糖醇、糖苷進(jìn)行定性、定量分析，分析酒醅發(fā)酵過程中糖、糖醇和糖苷的變化，以便于更進(jìn)一步研究發(fā)酵過程中微生物及其代謝情況。

1 材料和方法

1.1材料和儀器

芝麻香型酒醅由山東某酒廠提供，機(jī)械化酒醅發(fā)酵期49 d，手工酒醅發(fā)酵期52 d，堆積結(jié)束取1次樣，發(fā)酵前5天每天取1次樣，之后每隔5天取1次樣，直至發(fā)酵結(jié)束。

試劑:阿拉伯糖、木糖、葡萄糖、松二糖、海藻糖、木糖醇、阿拉伯糖醇、核糖醇、半乳糖醇、甘露糖醇、山梨糖醇、肌醇、甘油、甲基-α-D-吡喃葡萄糖苷、水楊苷(內(nèi)標(biāo)，IS)、吡啶、三氟乙酸(TFA，色譜純)、HMDS(衍生劑，色譜純)，Sigma-Aldrich(上海)公司；0.22 μm 微孔濾膜(有機(jī)相)，上海泰坦科技。

儀器:Thermo Scientific GC TSQ8000-MSD Trace 1310，美國Thermo Fisher公司；N-EVAP 氮吹儀，美國Organomation公司；超純水儀，美國Millipore公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 糖類提取

使用改進(jìn)的PARTRICIA等[12]方法。取5.0 g酒醅于50 mL離心管中，加入25 mL超純水，振蕩均勻后，置于4 ℃冰箱中過夜，冰浴超聲15 min，取上清液，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，收集在25 mL容量瓶中，最后用超純水定容至25 mL，置于-20 ℃冰箱中備用。

1.2.2 HDMS衍生化

參考FRANCIS[13]的方法。取100 μL上述萃取液于2 mL樣品瓶中，加入100 μL 內(nèi)標(biāo)水楊苷，終含量為220 mg/L，輕輕振蕩搖勻，緩慢氮?dú)獯蹈伞４蹈珊?，加?00 μL吡啶、100 μL HMDS和10μL TFA，振蕩搖勻后，于45 ℃條件下反應(yīng)30 min，冷卻至室溫再進(jìn)行GC-MS分析。

1.2.3 GC-MS條件

根據(jù)石亞林等[14]的方法。取反應(yīng)后的樣品進(jìn)行GC-MS分析，進(jìn)樣量為1 μL。GC條件：色譜柱為TG-5MS(30 m×0.25 mm，0.25 μm)，進(jìn)樣口溫度為280 ℃; 載氣為氦氣，流速1. 3 mL/min，分流比為20∶1;升溫程序?yàn)?65 ℃保持2 min，以6 ℃/min 升溫至280 ℃，并保持15 min。MS 條件:EI 電離源，電子能量70 eV，掃描范圍:50～650 amu，離子源溫度:300 ℃。

測(cè)定結(jié)果與NIST08質(zhì)譜庫進(jìn)行比對(duì)，通過特征離子、保留時(shí)間、匹配度進(jìn)行初步鑒定，再用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行最終確認(rèn)。沒有標(biāo)準(zhǔn)品的化合物為臨時(shí)性鑒定的化合物。

1.2.4 定量分析

糖類物質(zhì)定量使用選擇離子模式(SIM)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：用煮沸過的超純水配制待測(cè)物質(zhì)的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，各物質(zhì)的最初含量為阿拉伯糖637 mg/L、木糖1 483 mg/L、葡萄糖2 394 mg/L、松二糖318 mg/L、海藻糖1 413 mg/L、赤蘚糖醇 916 mg/L、木糖醇 1 090 mg/L、阿拉伯糖醇1 029 mg/L、核糖醇 635 mg/L、半乳糖醇 823 mg/L、甘露糖醇 1 001 mg/L、山梨糖醇 804 mg/L、肌醇523 mg/L、甲基-α-D-吡喃葡萄糖苷1 297 mg/L，然后將混合標(biāo)準(zhǔn)溶液梯度稀釋(1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64、1/128、1/256、1/1 024)，各梯度溶液與樣品處理方式、反應(yīng)條件和測(cè)定條件完全相同。以糖類物質(zhì)與內(nèi)標(biāo)的含量比作為縱坐標(biāo)，糖類物質(zhì)峰面積與內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積比作為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。檢測(cè)限(LOD)：儀器信噪比為 3時(shí)可檢測(cè)到的化合物的質(zhì)量含量；定量限(LOQ)：取10倍信噪比。

2 結(jié)果與討論

2.1酒醅中糖類物質(zhì)定性和定量

本研究采用HMDS衍生化結(jié)合GC-MS方法對(duì)酒醅中的糖類物質(zhì)進(jìn)行了分析檢測(cè)，共定性了5種糖、8種糖醇和2種糖苷(1種是臨時(shí)性鑒定)，其中葡萄糖、赤蘚糖醇、甘露糖醇、木糖醇、山梨糖醇、半乳糖醇、阿拉伯糖醇已有文獻(xiàn)報(bào)道[6]，阿拉伯糖、木糖、松二糖、海藻糖、核糖醇、肌醇、甲基-α-吡喃葡萄糖苷、甘油葡萄糖苷(臨時(shí)性鑒定)等8種化合物是首次在酒醅中檢測(cè)到。甘油葡萄糖苷已經(jīng)在日本清酒中鑒定出[15]。由于沒有標(biāo)準(zhǔn)品，故采用其峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積比來計(jì)算其含量(半定量)。

因吡喃和呋喃環(huán)上的—OH 存在1α-和1β-立體異構(gòu)，故單糖和甲基-α-吡喃葡萄糖苷、甘油葡萄糖苷(臨時(shí)性鑒定)有2個(gè)色譜峰，計(jì)算峰面積時(shí)將2個(gè)色譜峰的面積相加[12]。

1-赤蘚糖醇；2，2*-阿拉伯糖；3，3*-核糖；4，4*-木糖；5-木糖醇；6-阿拉伯糖醇；7-核糖醇；8，8*-甲基-α-吡喃葡萄糖苷；9，9*-葡萄糖；10-甘露糖醇；11-山梨糖醇；12-半乳糖醇；13-肌醇；14，14*-甘油葡萄糖苷；IS-內(nèi)標(biāo)；15-松二糖；16-海藻糖圖1 酒醅中糖類物質(zhì)衍生化后總離子流圖(TIC)Fig.1 GC-MS total ion current of silylated carbohydrates in fermented grains

從表1可以看出，所有待測(cè)定化合物標(biāo)準(zhǔn)曲線R2在0.986～0.999之間，線性較好；相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)在2%～7%之間；回收率在89%～104%之間，該法能夠定量酒醅中的糖類物質(zhì)。

2.2發(fā)酵過程中糖類物質(zhì)變化

2.2.1 發(fā)酵過程中糖和糖苷變化

無論是手工工藝還是機(jī)械化工藝，隨著發(fā)酵進(jìn)行糖總含量呈下降趨勢(shì)，酒醅中糖最高含量為11.80 mg/g(濕重，下同)，發(fā)酵結(jié)束時(shí)僅有1.18 mg/g(見圖2和圖3)。酒醅發(fā)酵初期，原料中淀粉經(jīng)糖化酶作用產(chǎn)生葡萄糖等還原糖。第1天，葡萄糖含量最高，達(dá)9.38 mg/g，低于文獻(xiàn)報(bào)道值27.65 mg/g[6]；后葡萄糖含量開始下降，其他糖具有類似變化。含量第2高的糖是阿拉伯糖，在整個(gè)發(fā)酵過程中最高達(dá)1.18 mg/g；含量較高的糖還有木糖和核糖，最高含量分別為0.57 mg/g和0.59 mg/g。

表1 糖類物質(zhì)的定量離子、標(biāo)準(zhǔn)曲線、R2、LOD、LOQ、回收率、RSD(n=3)和線性范圍

圖2 機(jī)械化酒醅發(fā)酵過程中游離態(tài)單糖的變化Fig.2 Concentrations of free monosaccharides during fermentation of grains by mechanical production

圖3 手工酒醅發(fā)酵過程中游離態(tài)單糖的變化Fig.3 Concentrations of free monosaccharides during fermentation of grains by traditional production

首次檢測(cè)到的2種二糖即海藻糖和松二糖含量較低，最高含量分別為0.39 mg/g和0.20 mg/g，且發(fā)酵前后變化不明顯(圖4和圖5)。海藻糖是原料中淀粉水解產(chǎn)物[16]，也是某些酵母菌抵抗不良環(huán)境的應(yīng)激代謝產(chǎn)物[17]。松二糖是蔗糖的同分異構(gòu)體，在某些酶存在的條件下，蔗糖可轉(zhuǎn)化為松二糖[18]。

圖4 機(jī)械化酒醅發(fā)酵過程中二糖和糖苷的變化Fig.4 Concentrations of free disaccharides and glucoside during fermentation of grains by mechanical production

圖5 手工酒醅發(fā)酵過程中二糖和糖苷的變化Fig.5 Concentrations of free disaccharides and glucoside during fermentation of grains by traditional production

首次鑒定出的2個(gè)糖苷甲基-α-D-吡喃葡萄糖苷和甘油葡萄糖苷(臨時(shí)性鑒定)在2種工藝酒醅發(fā)酵過程中變化基本一致，總體呈下降趨勢(shì)(圖4和圖5)。手工酒醅中甲基-α-D-吡喃葡萄糖苷和甘油葡萄糖苷最高含量均比機(jī)械化中最高含量高，分別比機(jī)械化酒醅中含量高78.50%和139.69%，甲基-α-D-吡喃葡萄糖苷含量于第20天達(dá)到最大值，為0.83 mg/g；甘油葡萄糖苷第10天達(dá)到最高，為1.16 mg/g。

2.2.2 發(fā)酵過程中糖醇變化

不論是何種工藝，糖醇在酒醅發(fā)酵過程中的含量總體呈上升趨勢(shì)(見圖6和圖7)。機(jī)械化酒醅中糖醇總量在發(fā)酵第45天最高，達(dá)8.07 mg/g，手工酒醅糖醇總量發(fā)酵結(jié)束時(shí)，即第52天達(dá)到最高，為7.80 mg/g。酒醅中含量最高的糖醇為赤蘚糖醇，最高含量達(dá)2.08 mg/g，與文獻(xiàn)報(bào)道值類似[6]。其次為木糖醇、核糖醇和阿拉伯糖醇，最高含量依次為1.83 mg/g、1.66 mg/g和1.61 mg/g。從圖6和圖7可以看出，木糖醇和阿拉伯糖醇同步變化。木糖醇和阿拉伯糖醇含量都低于文獻(xiàn)報(bào)道芝麻香型酒醅中的含量(分別為4.31 mg/g和5.67 mg/g)[6]。

圖6 機(jī)械化酒醅發(fā)酵過程中游離態(tài)糖醇的變化Fig.6 Concentrations of free alditols during fermentation of grains by mechanical production

圖7 手工酒醅發(fā)酵過程中游離態(tài)糖醇的變化Fig.7 Concentrations of free alditols during fermentation of grains by traditional production

2.2.3 兩種工藝酒醅中糖類物質(zhì)比較

無論何種工藝，酒醅發(fā)酵過程中糖含量總體呈下降趨勢(shì)。比較2種工藝中糖類物質(zhì)，其變化存在差異。機(jī)械化和手工酒醅中葡萄糖在第1天同時(shí)達(dá)到最高值，但機(jī)械化酒醅中含量更高，比手工酒醅高30.78%。機(jī)械化酒醅中阿拉伯糖含量在第5天達(dá)到最高值(1.18 mg/g)，而手工酒醅第15天達(dá)到最高值(1.15 mg/g)。發(fā)酵結(jié)束時(shí)，手工酒醅中葡萄糖含量比機(jī)械化酒醅高4.62%；但機(jī)械化酒醅中阿拉伯糖含量比手工酒醅中高24.57%。

二糖在發(fā)酵過程總體呈下降趨勢(shì)(圖4和圖5)。發(fā)酵過程中，2種工藝酒醅中松二糖含量差異較小。第0～4天，2種工藝酒醅中海藻糖含量均先上升后下降再上升，機(jī)械化中海藻糖含量第2天達(dá)到最高值(0.46 mg/g)，相比第0天上升了76.50%，而手工酒醅中第1天達(dá)到最高值(0.38 mg/g)，相比第0天上升了4.63%。第4天之后，2種工藝中海藻糖含量都下降，機(jī)械化中下降得較快。發(fā)酵結(jié)束時(shí)2種工藝酒醅中海藻糖含量差異不大。

2種工藝中糖苷變化趨勢(shì)一致，總體而言，手工酒醅中含量高于機(jī)械化酒醅。第0～5天，2種工藝中糖苷變化較小，第5～10天大幅上升，且手工酒醅中上升得更快；之后則逐漸下降。機(jī)械化酒醅中甲基-α-D-吡喃葡萄糖苷含量在第10天達(dá)到最高值0.46 mg/g，而手工酒醅第20天達(dá)最高值0.83 mg/g。2種工藝中甘油葡萄糖苷含量都在第10天達(dá)到最高，機(jī)械化和手工酒醅中分別為0.48 mg/g和1.16 mg/g。發(fā)酵結(jié)束時(shí)，手工酒醅中甲基-α-D-吡喃葡萄糖苷和甘油葡萄糖苷含量均高于機(jī)械化酒醅，前者高57.79%，后者高172.10%(圖4和圖5)。理論上講，糖苷在酸性的酒醅中應(yīng)該處于水解狀態(tài)，但本研究卻發(fā)現(xiàn)在酒醅發(fā)酵前10天處于上升趨勢(shì)，是反應(yīng)產(chǎn)生的，還是其他原因造成的，值得深入研究。

手工生產(chǎn)時(shí)酒醅中糖醇含量較高。發(fā)酵前后，機(jī)械化酒醅中糖醇總含量上升了53.86%，而手工酒醅中糖醇總含量上升了84.97%，機(jī)械化酒醅中赤蘚糖醇在第35天達(dá)到最高2.08 mg/g，而手工酒醅在第40天達(dá)最高值1.97 mg/g。發(fā)酵結(jié)束時(shí)，手工酒醅中赤蘚糖醇含量比機(jī)械化酒醅高31.55%；此外，發(fā)酵結(jié)束時(shí)，手工酒醅中木糖醇、阿拉伯糖醇和核糖醇含量分別比機(jī)械化酒醅中高11.82%、59.58%和26.33%。

3 結(jié)論

本研究定性定量了芝麻香型酒醅發(fā)酵過程中的糖類物質(zhì)，首次在酒醅中檢測(cè)到阿拉伯糖、木糖、松二糖、海藻糖、核糖醇、肌醇、甲基-α-D-吡喃葡萄糖苷、甘油葡萄糖苷(臨時(shí)性鑒定)。發(fā)酵過程中糖總體呈下降趨勢(shì)，而糖醇總體呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，至發(fā)酵結(jié)束時(shí)，呈下降趨勢(shì)。甲基-α-D-吡喃葡萄糖苷和甘油葡萄糖苷(臨時(shí)性鑒定)是先上升，到第10天后再緩慢下降，且手工酒醅發(fā)酵過程中糖苷含量明顯高于機(jī)械化酒醅。至發(fā)酵結(jié)束時(shí)，手工酒醅中葡萄糖含量比機(jī)械化酒醅高，但機(jī)械化酒醅中阿拉伯糖含量比手工酒醅高；發(fā)酵結(jié)束時(shí)2種工藝酒醅中二糖含量差異不明顯；與機(jī)械化酒醅相比，手工酒醅中含有更多的糖苷、糖醇。

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CarbohydratesandglucosidesfromfermentedgrainsduringmechanicalandtraditionalproductioninChineseroasted-sesame-likearomatypeliquor

JIANG Liu,FAN Wen-lai*,XU Yan

(Key Laboratory of Industrial Biotechnology，Ministry of Education，Laboratory of Brewing Microbiology and Applied Enzymology，School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China)

Free soluble carbohydrates and glucosides in fermented grains during mechanical and traditional production were analyzed by gas chromatography-mass spectrometry(GC-MS) as their trimethylsilyl derivatives using hexamethyldisilazane (HMDS). The results suggested that the total content of sugar decreased and the total content of glucosides increased before reduction. The total content of alditols increased. The content of glucose, glucosides and altitols in fermented grains by traditional production was higher than that of fermented grains by mechanical production, but the content of arabinose was lower. There was no significant difference in the content of disaccharides between these two kinds of fermented grains.

fermentedgrains；alditols；sugars；glucosides；silylation；gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS)；fermentation

碩士研究生(范文來研究員為通訊作者，E-mail：wenlai.fan@163.com)。

國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃(National Key R&D Program,2016YFD0400503)；國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(863計(jì)劃)(2013AA102108)

2017-03-31，改回日期：2017-04-21

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.014421