代娟，田艷萍，張小春，袁亞

(成都醫(yī)學(xué)院 檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院，四川 成都，610500)

蕨菜中原蕨苷含量的測(cè)定及加工過(guò)程對(duì)原蕨苷含量的影響

代娟，田艷萍，張小春，袁亞*

(成都醫(yī)學(xué)院 檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院，四川 成都，610500)

建立蕨菜及其制品中原蕨苷的HPLC檢測(cè)方法，探討加工工藝對(duì)蕨菜中原蕨苷含量的影響。蕨菜及其制品液氮研磨后，以體積分?jǐn)?shù)30%甲醇作為提取溶劑，按固液比5∶ 40(g∶mL)室溫下渦旋振蕩提取30 min，提取液經(jīng)聚酰胺6柱凈化后，在堿性和酸性環(huán)境下將原蕨苷轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定性較強(qiáng)的蕨素B，通過(guò)HPLC法檢測(cè)蕨素B的含量來(lái)計(jì)算樣品中原蕨苷含量，并以此方法考察熱燙和熱風(fēng)干燥加工對(duì)蕨菜中原蕨苷含量的影響。在該色譜條件下線性范圍為1～10 μg/mL，r=0.999，線性良好，對(duì)蕨素B的回收率為92.3%～102.4%，RSD均小于5.00%。蕨菜經(jīng)熱燙加工后原蕨苷含量顯著降低，經(jīng)熱風(fēng)干燥后原蕨苷含量卻顯著升高。該方法靈敏度高、定量準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好，可用于蕨菜及其制品中原蕨苷含量的檢測(cè)，熱燙加工可有效降低蕨菜中原蕨苷的含量。

蕨菜；原蕨苷； HPLC； 熱燙；熱風(fēng)干燥

蕨菜，又叫拳頭菜、貓爪、龍頭菜、鹿蕨菜、是蕨的嫩芽。英文名Pteridiumaquilinum，屬于鳳尾蕨科，在我國(guó)各省區(qū)均有分布[1-2]。由于蕨菜營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富[3]，具有軟化血管、降低膽固醇等功效[4]，近年來(lái)國(guó)內(nèi)外對(duì)蕨菜及其深加工產(chǎn)品需求量急劇增加。在我國(guó)多個(gè)地區(qū)已將蕨菜作為特色農(nóng)產(chǎn)品進(jìn)行產(chǎn)業(yè)化發(fā)展，據(jù)保守估計(jì)每年的產(chǎn)值達(dá)數(shù)十億元。

但在目前國(guó)內(nèi)的蕨菜應(yīng)用研究中，普遍忽視了蕨菜食用安全的問(wèn)題。事實(shí)上在很多蕨類大量生長(zhǎng)的地區(qū)也出現(xiàn)了家畜因食用蕨類而造成急慢性中毒癥狀的報(bào)道[5-7]。在隨后的研究中發(fā)現(xiàn)，在蕨菜喂養(yǎng)的不同種試驗(yàn)動(dòng)物如小鼠[8-11]、豚鼠[12]、蟾蜍[13]和大鼠[14-16]中均能產(chǎn)生多種腫瘤，并由此可以認(rèn)定蕨菜的致癌性。研究發(fā)現(xiàn)蕨菜中的主要致癌物質(zhì)是一種被稱為原蕨苷(ptaquiloside ，PTA，CAS：87625-62-5)的化合物[17-18]，該物質(zhì)在體內(nèi)外的研究表明與腫瘤的發(fā)生直接相關(guān)[19-22]。而流行病學(xué)研究也證明人群在蕨類生長(zhǎng)密集的地區(qū)居住時(shí)間與患胃癌死亡的風(fēng)險(xiǎn)正相關(guān)[23-24]。目前，原蕨苷被世界癌癥組織評(píng)級(jí)為2B類致癌物，而原蕨苷在蕨類植物的嫩芽中含量最高。目前，我國(guó)還沒(méi)有針對(duì)蕨菜及其制品中PTA含量的檢測(cè)方法和相關(guān)的食品安全標(biāo)準(zhǔn)，存在著潛在的食品安全風(fēng)險(xiǎn)。

PTA是一種結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定的化合物，其標(biāo)準(zhǔn)品難以獲取，且存在樣品處理過(guò)程中易降解的問(wèn)題。目前的研究尚無(wú)直接通過(guò)PTA標(biāo)品以外標(biāo)法來(lái)建立PTA的檢測(cè)方法。但PTA經(jīng)過(guò)堿性和酸性條件處理可以等摩爾比的轉(zhuǎn)化為蕨素B(pterosine B, PTB, CAS：34175-96-7 )[25-27](見(jiàn)圖1)。而PTB具有較好的穩(wěn)定性，且PTB的標(biāo)準(zhǔn)品可通過(guò)商業(yè)途徑獲得。本研究通過(guò)優(yōu)化PTB的色譜分離測(cè)試條件及PTA的提取、凈化和轉(zhuǎn)化為PTB的前處理方法，建立了通過(guò)HPLC檢測(cè)樣品中PTB的變化量來(lái)反映樣品中PTA含量的檢測(cè)方法，并對(duì)該方法進(jìn)行了方法學(xué)評(píng)價(jià)?；诖朔椒▽?duì)蕨菜加工前后PTA含量的變化進(jìn)行了考察。

圖1 PTA轉(zhuǎn)化PTB結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Structure of ptaquiloside and the transformation product pterosin B

1 材料與方法

1.1材料與試劑

新鮮蕨菜及其制品，市售；NaOH、HCl、聚酰胺6、甲醇(色譜純)，美國(guó)Tedia公司；PTB標(biāo)準(zhǔn)品(純度>98%)，上海瀚香生物科技有限公司。

1.2儀器與設(shè)備

TB-214電子天平型，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；LC20A液相色譜儀(配二極管陣列檢測(cè)器)，日本島津公司；MS3渦旋混勻器，德國(guó)IKA公司；MTN2800氮吹儀，天津奧特賽恩斯儀器有限公司。

1.3PTA檢測(cè)方法的條件優(yōu)化與評(píng)價(jià)

1.3.1 色譜分離檢測(cè)條件優(yōu)化

通過(guò)PTB標(biāo)準(zhǔn)品的光譜圖選擇適合的檢測(cè)波長(zhǎng)，并在該波長(zhǎng)下比較不同比例流動(dòng)相、流速和柱溫的對(duì)PTB分離效果，從而篩選出適合的色譜分離條件。

1.3.2 PTA提取條件的優(yōu)化

為優(yōu)化樣品破碎方式，分別用勻漿機(jī)破碎和液氮研磨2種破碎方法對(duì)新鮮蕨菜進(jìn)行處理，采用體積分?jǐn)?shù)30%甲醇溶液提取、凈化并轉(zhuǎn)化后，比較PTA提取量，從而選擇適合的樣品破碎方式。

為優(yōu)化提取溶劑種類，分別比較體積分?jǐn)?shù)30%甲醇溶液和100%純水提取新鮮蕨菜中的PTA的效果，樣品經(jīng)液氮研磨后，精密稱取5.000 g，加入40 mL提取溶劑提取、凈化并轉(zhuǎn)化后，通過(guò)比較提取液中PTA的含量，從而選擇適合的提取溶劑。

1.3.3 提取液凈化驗(yàn)證與PTA轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化

由于本方法是通過(guò)PTB的轉(zhuǎn)化量來(lái)反映樣品中PTA的含量，為保證檢測(cè)方法的準(zhǔn)確性，需對(duì)凈化前后提取液中本底PTB的含量進(jìn)行考察。通過(guò)檢測(cè)不同pH值和轉(zhuǎn)化時(shí)間下，PTB的生成量以及轉(zhuǎn)化過(guò)程中PTB標(biāo)品的穩(wěn)定性，來(lái)優(yōu)化對(duì)PTA的轉(zhuǎn)化條件。

1.3.4 方法學(xué)評(píng)價(jià)

為評(píng)價(jià)儀器精密度，取同一樣品重復(fù)進(jìn)樣5次，每次20 μL，計(jì)算PTB峰面積的RSD值。為評(píng)價(jià)該方法的重現(xiàn)性，取5份平行樣品，根據(jù)樣品處理和檢測(cè)條件測(cè)定PTA的含量，計(jì)算其RSD值。

由于無(wú)法取得PTA標(biāo)品，在準(zhǔn)確度檢驗(yàn)中只對(duì)PTB轉(zhuǎn)化和檢測(cè)過(guò)程的加標(biāo)回收率進(jìn)行計(jì)算，即分別取1 mL過(guò)聚酰胺6柱凈化后的樣品提取液，按高中低濃度，分別加入1、5、10 mg PTB標(biāo)準(zhǔn)品。按本研究所確定的PTB轉(zhuǎn)化方法和檢測(cè)條件，對(duì)每個(gè)加標(biāo)濃度樣品進(jìn)行5次平行試驗(yàn)，計(jì)算其加標(biāo)回收率和RSD值。

1.4樣品的前處理方法

稱取3～5 g新鮮蕨菜加入液氮研磨成粉狀，再精密稱取5.000 g置于50 mL離心管內(nèi)加入40 mL 30%甲醇溶液，室溫下渦旋振蕩提取30 min后。于4 ℃ 6 000 r/min離心5 min，移取上清液，通過(guò)聚酰胺6柱(2 g聚酰胺6干法裝柱)凈化除去提取液中本底的PTB，收集過(guò)濾液待用。

1.5PTA轉(zhuǎn)化為PTB的方法

從凈化后的過(guò)濾液中移取1 mL，加入1 mol/L的NaOH溶液50 μL(使pH>11)，于40 ℃水浴30 min，再加入5 mol/L的HCl 50 μL(使pH<2)酸化，以50%甲醇定容至2 mL，過(guò)濾待測(cè)。

1.6標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制

精密稱取PTB標(biāo)準(zhǔn)品10 mg(精確到0.01 mg)，用體積分?jǐn)?shù)50%甲醇稀釋到10 mL，配制濃度約為1 000 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。以50%甲醇為溶劑，采用逐步稀釋法，配制5個(gè)濃度在1～10 mg/mL范圍的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.7HPLC分析測(cè)試條件

色譜柱：Agilent XDB-C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm) ；以V(甲醇)∶V(水)=50∶50為流動(dòng)相；柱溫為50 ℃；流速1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)263 nm；進(jìn)樣量20 μL。

1.8樣品中PTA含量的定量分析

以PTB的保留時(shí)間和目標(biāo)峰光譜圖定性。以外標(biāo)法定量，分別以各標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積及對(duì)應(yīng)濃度建立標(biāo)準(zhǔn)曲線及回歸方程，再根據(jù)樣品中PTB的峰面積，計(jì)算樣品提取液中PTB的濃度，并按下式計(jì)算樣品中PTA的含量(mg/kg)：

(1)

式中：CPTA，樣品中PTA的含量，mg/kg；CPTB，轉(zhuǎn)化后樣品液中PTB的質(zhì)量濃度，μg/mL；2，1 mL樣品提取液轉(zhuǎn)化后定容至2 mL, 被稀釋了2倍；40，提取液體積，mL；Ms，取樣量，g；398.449，PTA的摩爾質(zhì)量；218.292，PTB的摩爾質(zhì)量。

1.9不同加工方法對(duì)蕨菜中PTA含量的影響

為了解不同加工方法對(duì)PTA含量的影響，對(duì)市售蕨菜及其主要制品中PTA含量進(jìn)行考察。為進(jìn)一步了解熱燙和熱風(fēng)干燥兩種主要工藝對(duì)蕨菜中PTA含量的影響，分別對(duì)在沸水浴熱燙和70 ℃熱風(fēng)干燥過(guò)程中蕨菜樣品PTA含量的變化進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果與討論

2.1色譜分離檢測(cè)條件優(yōu)化

從PTB標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)紫外可見(jiàn)光譜掃描可知(見(jiàn)圖2-A)，PTB在218、263、306 nm 處均有吸收峰，雖然在218 nm除吸收值最高，但是該波長(zhǎng)處也有較高的雜質(zhì)吸收，在樣品檢測(cè)時(shí)影響分離度。 而306 nm吸收值較低，影響檢測(cè)的靈敏度。綜合選擇263 nm為最佳吸收波長(zhǎng)。在該波長(zhǎng)下比較不同比例流動(dòng)相、流速和柱溫的分離效果，經(jīng)比較發(fā)現(xiàn)流動(dòng)相：V(甲醇)∶V(水)=50∶50、柱溫：50 ℃、流速：1 mL/min時(shí)，目標(biāo)化合物的柱效(大于2 000)和分離度(大于2.5)較高，同是具有適宜的保留時(shí)間(24.55 min)，對(duì)樣品的分析時(shí)間在30 min完成(見(jiàn)圖2-B，見(jiàn)圖2-C)。

A-PTB標(biāo)品光譜圖；B-PTB標(biāo)品色譜圖；C-樣品色譜圖圖2 PTB色譜分離檢測(cè)條件優(yōu)化Fig.2 Optimization of PTB chromatographic separation and detection conditions

分別取1、2.5、5、7.5、10 mg/mL的PTB標(biāo)準(zhǔn)液20 mL精密進(jìn)樣,根據(jù)峰面積之和與相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)液濃度建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(見(jiàn)圖2),所得回歸方程為：Y=62 797X-15 474,r=0.999。結(jié)果表明，PTB濃度在1～10 μg/mL，線性良好。據(jù)此確定該儀器對(duì)PTB的最小檢出限(LOD)為 0.25 mg/mL。

圖3 PTB標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Standard curve of PTB

2.2PTA提取條件的優(yōu)化

在不同的破碎方法下樣品中PTA提取量差異極大，采有勻漿機(jī)破碎的樣品中PTA的提取量顯著低于液氮研磨破碎(見(jiàn)圖4-A)。這可能是由于PTA主要存在于蕨菜的表層，采用勻漿機(jī)很難將植物表皮充分破碎，而液氮研磨可將樣品研磨成粉，不僅破碎充分還為提取提供了較大的比表面積。因此選用液氮研磨作為樣品破碎方法。

采用不同的溶劑提取PTA的效果差異明顯，30%甲醇溶液提取PTA的量顯著高于純水提取。在未凈化提取液中，純水中PTB的本底含量顯著高于30%甲醇溶液(data no show)，可能的原因是采用純水提取的過(guò)程中PTA轉(zhuǎn)化成了PTB，且純水中溶解了樣品中大量多糖類物質(zhì)，增大了提取液黏度使得凈化過(guò)柱過(guò)程十分緩慢(大于30 min)。此外隨著提取時(shí)間的增加，提取液中PTA的含量液也增加，當(dāng)提取時(shí)間達(dá)到30 min 后PTA含量趨于穩(wěn)定(見(jiàn)圖4-B)。因此確定固液比為1∶8的30%甲醇溶液，室溫下渦旋振蕩提取30 min為樣品提取條件。

A-樣品破碎方式優(yōu)化；B-提取溶劑與時(shí)間優(yōu)化圖4 PTA提取條件優(yōu)化Fig.4 Optimization of PTA extraction condition

2.3提取液凈化驗(yàn)證與PTA轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化

由于缺乏PTA的標(biāo)準(zhǔn)品或其他適合的內(nèi)標(biāo)物對(duì)轉(zhuǎn)化過(guò)程進(jìn)行矯正，為保證檢測(cè)方法的準(zhǔn)確性，對(duì)提取液的凈化和PTA經(jīng)過(guò)堿性和酸性條件轉(zhuǎn)化為PTB的過(guò)程優(yōu)化顯得十分重要。通過(guò)PTB的轉(zhuǎn)化量來(lái)準(zhǔn)確反映樣品中PTA的含量，需要保證提取液中本底的PTB經(jīng)凈化后被完全除去，提取液中PTA應(yīng)完全轉(zhuǎn)化為PTB，且生成的PTB在轉(zhuǎn)化過(guò)程中不發(fā)生降解。由于PTA在堿性條件下脫去葡萄糖基的過(guò)程是整個(gè)轉(zhuǎn)化過(guò)程的關(guān)鍵步驟。因此本研究對(duì)提取液的凈化效果，不同pH和轉(zhuǎn)化時(shí)間下，PTB的生成量以及轉(zhuǎn)化過(guò)程中PTB標(biāo)品的穩(wěn)定性進(jìn)行了考察。結(jié)果表明提取液經(jīng)過(guò)柱凈化后本底PTB被完全除去(見(jiàn)圖5-A)。在pH值大于11的條件下40 ℃轉(zhuǎn)化30 min 后，PTB的含量達(dá)到穩(wěn)定并基本一致(見(jiàn)圖5-B)。由于在1 mL提取液中加入1 mol/L的NaOH溶液 45 μL以上即可使反應(yīng)體系的pH值大于11，為便于實(shí)驗(yàn)操作通過(guò)加入50 μL 1 mol/L的NaOH溶液作為堿性條件。而在此條件下轉(zhuǎn)化時(shí)間大于40 min后，不論是提取液中轉(zhuǎn)化所得的PTB還是PTB標(biāo)品均出現(xiàn)了不同程度的降解(見(jiàn)圖5-C)。因此綜合考慮將轉(zhuǎn)化時(shí)間確定為40 ℃下轉(zhuǎn)化30 min。

A-提取液凈化效果；B-堿性轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化；C-轉(zhuǎn)化時(shí)間優(yōu)化圖5 提取液凈化驗(yàn)證與PTA轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化Fig.5 Purification verification of extraction solution and optimization of PTA transformation conditions

2.4方法學(xué)評(píng)價(jià)

該方法儀器精密度的RSD為1.63%，方法重現(xiàn)性的RSD為4.73%。方法的加標(biāo)回收率和RSD值見(jiàn)表1。由于該檢驗(yàn)方法對(duì)PTB的回收率為92.3%～102.4%，RSD均小于5%，再結(jié)合本方法針對(duì)蕨菜中PTA的提取、凈化和PTB轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化結(jié)果，說(shuō)明本方法具有良好的準(zhǔn)確度和重現(xiàn)性，滿足用于檢測(cè)蕨菜及其制品中PTA含量的要求。

表1 回收率和RSD值表

2.5不同加工出方法對(duì)蕨菜中PTA含量的影響

目前在市場(chǎng)上銷售的蕨菜加工產(chǎn)品主要包括蕨菜經(jīng)泡漬或腌制后真空包裝滅菌的預(yù)包裝產(chǎn)品和直接烘干的蕨菜干。兩類產(chǎn)品經(jīng)檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，與新鮮蕨菜相比經(jīng)泡漬或腌制后的蕨菜制品中PTA的含量大大降低，而蕨菜干中PTA含量卻大大高于新鮮蕨菜(見(jiàn)表2)。

表2 樣品中PTA含量檢測(cè)結(jié)果

在泡漬或腌制的蕨菜制品生產(chǎn)工藝中都需要熱燙或蒸煮滅菌，而干蕨菜則需要自然晾曬或熱風(fēng)干燥。為進(jìn)一步了解2種主要加工工藝對(duì)蕨菜中PTA含量的影響，本研究分別檢測(cè)了在沸水浴熱燙和70 ℃熱風(fēng)干燥過(guò)程中蕨菜樣品PTA含量的變化。結(jié)果表明經(jīng)過(guò)沸水浴熱燙過(guò)程不僅起到滅酶和護(hù)色的作用，還使蕨菜中PTA含量顯著降低，在5% NaHCO3的弱堿性溶液中進(jìn)行熱燙則可以進(jìn)一步增強(qiáng)PTA的降解作用(見(jiàn)圖6-A)。而在熱風(fēng)干燥過(guò)程中蕨菜中PTA并未減少且隨著樣品中水分含量的減少，使PTA的含量被進(jìn)一步濃縮提高(見(jiàn)圖6-B)。以上的實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示了新鮮蕨素及其制品在食用前，如經(jīng)過(guò)時(shí)間更長(zhǎng)的水浴烹飪過(guò)程，將進(jìn)一步促進(jìn)蕨菜中PTA的降解，從而顯著降低蕨菜類食品的潛在致癌風(fēng)險(xiǎn)。

A-熱燙對(duì)PTA含量的影響；B-熱風(fēng)干燥對(duì)PTA含量的影響圖6 不同加工工藝對(duì)蕨菜中PTA含量的影響Fig.6 Effect of different processing technic on the content of PTA in bracken

3 結(jié)論

本研究采用30%甲醇溶液提取，聚酰胺6凈化并將PTA轉(zhuǎn)化為PTB后，經(jīng)HPLC分析，建立了蕨菜及其制品中PTA含量的檢測(cè)方法。利用該方法了解了目前蕨菜產(chǎn)品的加工工藝中，水浴熱燙或蒸煮可以顯著的降低樣品中PTA的含量，而干燥工藝則不能降低樣品中PTA含量，反而會(huì)因?yàn)樗趾拷档投a(chǎn)品中PTA含量被濃縮。

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DeterminationofptaquilosideinPteridiumaquilinumbyHPLCandtheeffectofptaquilosideduringprocessing

DAI Juan, TIAN Yan-ping, ZHANG Xiao-chun, YUAN Ya*

(School of Laboratory Medicine, Chengdu Medical College, Chengdu 610500, China)

To establish a method for determination ptaquiloside inPteridiumaquilinumby HPLC, and evaluate the effect of ptaquiloside during processing. Method: Bracken and its products were grinded in liquid nitrogen and extracted 30 min at room temperature with 30% methanol with solid-liquid ratio of 5 g∶40 mL. The extract was purified by polyamide column, and was converted into pterosin B in alkaline and acidic environment; by detecting the content of pterosin B using HPLC, the content of ptaquiloside was calculated. The content of ptaquiloside was used in the comparison of two drying method: hot water bleaching and hot air drying. Result: The method can effectively extract and purify the ptaquiloside in bracken fern and can convert all the ptaquiloside into the pterosin B. The linear range was 1-10 μg/mL,r=0.999 9. The recovery rate of ptaquiloside was between 92.3% and 102.4% and RSD was less than 5.00%. The content of ptaquiloside in bracken fern significantly decreased by blanching processing, and significantly increased by hot air drying processing. Conclusion: This method has good sensitivity, accuracy, and repeatability. It can be used for the evaluation of the content of ptaquiloside in bracken fern. The content of ptaquiloside in bracken fern could be effectively reduced by blanching processing.

bracken fern； ptaquiloside； HPLC; blanching processing; hot air drying processing

碩士，講師(袁亞碩士，講師為通訊作者，E-mail：scuyaya@163.com)。

成都醫(yī)學(xué)院校級(jí)“大學(xué)生創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)計(jì)劃”(CXJS201409)；西華大學(xué)食品生物技術(shù)省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放研究基金資組項(xiàng)目SZJJ2014-010

2017-02-03，改回日期：2017-05-31

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.013989