王秋實，李鳳林

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學食品工程學院，長春130118；2.吉林農(nóng)業(yè)科技學院食品工程學院，吉林132101）

玉米須黃酮利用肝癌細胞降糖實驗研究

王秋實1，2，李鳳林2※

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學食品工程學院，長春130118；2.吉林農(nóng)業(yè)科技學院食品工程學院，吉林132101）

對肝癌HepG2細胞進行玉米須黃酮降糖實驗的研究。通過提取得到的黃酮分別設置低、中、高濃度的劑量組以及陽性、模型和空白實驗，通過細胞實驗得到中高濃度的玉米須黃酮對葡萄糖和甘油三酯進行消耗來起到降糖作用，對葡萄糖-6-磷酸的分解起到抑制來達到降糖作用，對葡萄糖激酶分解葡萄糖起到促進來達到降糖作用。為緩解糖尿病奠定了基礎。

黃酮；肝癌細胞；降糖

玉米須黃酮的提取工藝現(xiàn)階段比較完善，然而玉米須黃酮具有許多功能價值有待于研究。當今最為常見的一種疾病應當屬于糖尿病，糖尿病在全球的患病比例非常大，并且對其治療也沒有十分好的方法，本研究就針對降糖方面進行了細胞層次的實驗，通過實驗來驗證玉米須黃酮對降糖的效果[1-4]。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

選取提取好的玉米須黃酮作為樣品，并將其冷凍干燥成粉末，人肝癌細胞（HepG2）。

1.2 實驗儀器

電子顯微鏡（SK2009H）：賽克數(shù)碼有限公司，酶標儀（SPECTRA MAX 190）：上海普迪生物技術(shù)有限公司，CO2培養(yǎng)箱（BPN-50CH）：賽德儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 肝癌HepG2細胞的培養(yǎng)[5]（1）肝癌HepG2細胞的復蘇：從液氮罐中取出凍存的細胞凍存管，將其迅速放在37℃的水浴鍋中，靜止解凍1min，待完全溶解后，放入超凈工作臺中，將細胞懸液轉(zhuǎn)移至滅菌好的離心管中，以1000r/min離心10min，棄去培養(yǎng)液，再向離心管中加入10mL新的培養(yǎng)液，將其制成細胞懸液后，將細胞放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，每天再同一時間換細胞培養(yǎng)液進行培養(yǎng)，并觀察生長情況。（2）肝癌HepG2細胞的傳代培養(yǎng)：將復蘇培養(yǎng)好的細胞棄去培養(yǎng)液，向每個培養(yǎng)板的孔中加入2mL無鈣、鎂的PBS或HANKS溶液進行漂洗培養(yǎng)的貼壁肝癌HepG2細胞一次后棄去漂洗液。在每個培養(yǎng)孔中加入1mL胰蛋白酶進行消化，消化要在37℃條件下進行，輕輕搖動培養(yǎng)板，使細胞表面布滿消化液，在顯微鏡下觀察，當大約一半的細胞變圓時，加一定的完全培養(yǎng)液終止消化。用吸管反復吹洗每個培養(yǎng)板孔壁，吹洗時要慢，以免破壞細胞。然后以1100r/ min離心10min，棄去培養(yǎng)液，進行細胞計數(shù)。（3）肝癌HepG2細胞的凍存：先將細胞轉(zhuǎn)移到凍存管中，將凍存管放入4℃冰箱中40min，然后轉(zhuǎn)移到-20℃冰箱60min，置于-80℃冰箱中冷凍24h，最后可放入液氮罐中長期凍存。培養(yǎng)好肝癌HepG2細胞后，再分別加入黃酮，其濃度為100、200、500、1000μg/mL，進行培養(yǎng)，并且做空白、模型和陽性對照實驗。

1.3.2 玉米須黃酮對肝癌HepG2細胞增殖的毒性研究利用MTT法研究玉米須黃酮對肝癌HepG2細胞增殖的影響，取密度為5.0×104個/mL，每個孔100μL的對數(shù)生長期肝癌HepG2細胞，接種至96孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24h后，配制提取的黃酮濃度為0、5、10、20、40、80μg/mL的溶液，加入到96孔培養(yǎng)板中，每孔加入100μL，繼續(xù)培養(yǎng)24h后，再向96孔培養(yǎng)板中加入10μLMTT，在37℃條件下培養(yǎng)4h，棄去上層培養(yǎng)液，向96孔培養(yǎng)板中加100μL DMSO，振搖10min，在450nm處用酶標儀測吸光度。實驗時進行三組平行試驗，結(jié)果取平均值。

1.3.3 肝癌HepG2細胞高糖模型的建立（1）胰島素濃度對葡萄糖消耗量的影響：在培養(yǎng)的細胞中加入等量的葡萄糖進行培養(yǎng)，再向加葡萄糖培養(yǎng)的細胞中加入不同濃度的胰島素，其中胰島素濃度分別為：10-5、10-6、10-7、10-8、10-9mmol/L，繼續(xù)進行培養(yǎng)，得到不同濃度對葡萄糖消耗的量。（2）胰島素濃度對肝癌HepG2細胞存活率的影響：在相同數(shù)目的細胞培養(yǎng)板中分別加入不同濃度的胰島素，其中胰島素濃度分別為：10-5、10-6、10-7、10-8、10-9mmol/L，然后進行培養(yǎng)細胞，觀察細胞的存活情況。

1.3.4 玉米須黃酮對肝癌HepG2細胞培養(yǎng)液中葡萄糖的影響首先將試劑盒中R1試劑和R2試劑等量混勻最為實驗的工作液，在96孔板中分別加入1mL工作液，加入不同濃度培養(yǎng)細胞的培養(yǎng)液10μL，并做空白對照，加完培養(yǎng)液后混勻，在37℃水浴加熱15min，待顯色穩(wěn)定后，利用酶標儀在450nm處測其吸光度值。

1.3.5 玉米須黃酮培養(yǎng)的肝癌HepG2細胞對甘油三酯（TG）的影響將培養(yǎng)好的細胞懸液取出，以1000r/min離心10min，棄去上清液，用pH為7的磷酸鹽緩沖液清洗后，以以1000r/min離心10min，棄去上清液，加入0.3mLpH為7的磷酸鹽緩沖液進行勻漿，在冰水浴條件下將細胞超聲破碎30s備用。在96孔板中加入工作液250μL，再加入破碎好的細胞樣品10μL，并做空白對照，在37℃恒溫培養(yǎng)10min，利用酶標儀在450nm處測其吸光度值。

1.3.6 玉米須黃酮培養(yǎng)的肝癌HepG2細胞對葡萄糖-6-磷酸酶（G-6-Pase）的影響首先將試劑盒中孔板進行洗滌，每孔加滿洗滌液，靜置1min后甩盡孔內(nèi)洗滌液，在濾紙上拍干，如此方法洗滌5次。在指定標準品孔內(nèi)加不同濃度的標準品50μL，在樣品指定孔中加入超聲破碎的細胞樣品10μL，再加樣品稀釋液40μL，并作空白對照。處空白外，向孔板中加入辣根過氧化物酶（HRP），標記的檢測抗體100μL，用封板膜封住孔板，在37℃水域反應60min。棄去液體拍干后加入洗滌液，靜置1min，棄去洗滌液，拍干，按此方法重復5次。每孔加入試劑盒底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。每孔加入終止液50μL，15min內(nèi)利用酶標儀在450nm處測其吸光度值。

1.3.7 玉米須黃酮培養(yǎng)的肝癌HepG2細胞對葡萄糖激酶（GK）的影響首先將試劑盒中孔板進行洗滌，每孔加滿洗滌液，靜置1min后甩盡孔內(nèi)洗滌液，在濾紙上拍干，如此方法洗滌5次。在指定標準品孔內(nèi)加不同濃度的標準品50μL，在樣品指定孔中加入超聲破碎的細胞樣品10μL，再加樣品稀釋液40μL，并作空白對照。處空白外，向孔板中加入辣根過氧化物酶（HRP），標記的檢測抗體100μL，用封板膜封住孔板，在37℃水域反應60min。棄去液體拍干后加入洗滌液，靜置1min，棄去洗滌液，拍干，按此方法重復5次。每孔加入試劑盒底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。每孔加入終止液50μL，15min內(nèi)利用酶標儀在450nm處測其吸光度值。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米須黃酮對肝癌HepG2細胞毒性實驗驗證結(jié)果見圖1。

由圖1可知，經(jīng)過玉米須黃酮培養(yǎng)過的細胞的細胞活力較好，沒有對肝癌HepG2細胞的增殖造成抑制的作用，所以可以用玉米須黃酮培養(yǎng)肝癌HepG2細胞進行降糖實驗的研究。

圖1 不同方法提取的黃酮對細胞活力的影響

2.2 肝癌HepG2細胞高糖模型建立的結(jié)果

胰島素濃度對葡萄糖消耗量的影響結(jié)果見圖2，胰島素濃度對肝癌HepG2細胞存活率的影響見圖3。

圖2 胰島素濃度對葡萄糖消耗量的影響

圖3 胰島素濃度對肝癌HepG2細胞存活率的影響

由圖2、圖3可知，葡萄糖的消耗量隨著胰島素濃度的變化，在10-7mmol/L時，葡萄糖的消耗量最少，而肝癌HepG2細胞存活率是隨著胰島素濃度的增加而降低，由此選擇了最佳的胰島素濃度10-7mmol/L進行建立高糖細胞模型。

2.3 玉米須黃酮對肝癌HepG2細胞培養(yǎng)液中葡萄糖的實驗見圖4。

圖4 玉米須黃酮對肝癌HepG2細胞培養(yǎng)液中葡萄糖消耗量的影響

通過測細胞培養(yǎng)液中葡萄糖的消耗量來判斷降糖效果，其中細胞培養(yǎng)液中的葡萄糖消耗量越多，則細胞降糖效果越好。其中常規(guī)法提取的黃酮對細胞培養(yǎng)液中葡萄糖消耗量是隨著黃酮濃度的升高呈現(xiàn)上升的趨勢，通過顯著性差異分析，在黃酮濃度為50μg/mL時，葡萄糖消耗量極顯著（P＜0.01），在黃酮濃度為100μg/mL時，葡萄糖消耗量顯著（P＜0.05）。超聲波輔助法提取的黃酮對細胞培養(yǎng)液中葡萄糖消耗量是隨著黃酮濃度的升高呈現(xiàn)上升的趨勢，通過顯著性差異分析，在黃酮濃度為50μg/mL和100μg/mL時，葡萄糖消耗量極顯著（P＜0.01），在黃酮濃度為50μg/mL時，葡萄糖消耗量顯著（P＜0.05）。微波法提取的黃酮對細胞培養(yǎng)液中葡萄糖消耗量是隨著黃酮濃度的升高，在黃酮濃度從20μg/mL增加到50μg/mL之間葡萄糖消耗量明顯增加，當黃酮濃度再增加到100μg/mL時，葡萄糖消耗量呈現(xiàn)平緩趨勢，那么在黃酮濃度為50μg/mL時，葡萄糖消耗量極顯著（P＜0.01），在黃酮濃度為100μg/mL時，葡萄糖消耗量顯著（P＜0.05）。通過三種方法相比較得到，葡萄糖消耗量：微波法＞超聲波法＞常規(guī)法，即降糖效果：微波法＞超聲波法＞常規(guī)法。

2.4 玉米須黃酮培養(yǎng)的肝癌HepG2細胞對甘油三酯（TG）的實驗見圖5。

圖5 玉米須黃酮培養(yǎng)的肝癌HepG2細胞對甘油三酯（TG）的影響

將培養(yǎng)的肝癌HepG2細胞破碎處理后，測定肝癌HepG2細胞對甘油三酯分解能力，其中細胞對甘油三酯消耗的越多，對葡萄糖消耗量就會減少。所以甘油三酯含量越少降糖效果越顯著。其中常規(guī)法提取的黃酮培養(yǎng)細胞分解甘油三酯的能力隨著黃酮濃度的增加呈現(xiàn)平緩上升的趨勢，在黃酮濃度為50μg/mL時，葡萄糖消耗量極顯著（P＜0.01），在黃酮濃度為20μg/mL時，葡萄糖消耗量顯著（P＜0.05）。超聲波法提取的黃酮培養(yǎng)細胞分解甘油三酯的能力隨著黃酮濃度的增加呈現(xiàn)平緩上升的趨勢，但在50μg/mL～100μg/mL時，甘油三酯的消耗量明顯增加，在黃酮濃度為50μg/mL時，葡萄糖消耗量極顯著（P＜0.01），在黃酮濃度為10μg/mL和20μg/mL時，葡萄糖消耗量顯著（P＜0.05）。微波法提取的黃酮培養(yǎng)細胞分解甘油三酯的能力隨著黃酮濃度的增加呈現(xiàn)平緩上升的趨勢，在黃酮濃度為50μg/mL時，葡萄糖消耗量極顯著（P＜0.01），在黃酮濃度為20μg/mL時，葡萄糖消耗量顯著（P＜0.05）。通過三種方法相比較，得到分解甘油三酯的能力為：微波法＜常規(guī)法＜超聲波法，即降糖效果：微波法＞常規(guī)法＞超聲波法。

2.5 玉米須黃酮培養(yǎng)的肝癌HepG2細胞對葡萄糖-6-磷酸酶（G-6-Pase）的實驗見圖6。

圖6 玉米須黃酮培養(yǎng)的肝癌HepG2細胞對葡萄糖-6-磷酸酶（G-6-Pase）的影響

將培養(yǎng)的肝癌HepG2細胞破碎處理后，測定肝癌HepG2細胞對葡萄糖-6-磷酸酶的酶活力大小，因為葡萄糖-6-磷酸酶對葡萄糖-6-磷酸具有分解作用，導致產(chǎn)生葡萄糖，所以其酶活力越低降糖效果越好。其中常規(guī)法提取的黃酮培養(yǎng)細胞對葡萄糖-6-磷酸酶的酶活力大小隨著黃酮濃度的增加呈現(xiàn)平緩上升的趨勢，在黃酮濃度為50μg/mL時，葡萄糖消耗量極顯著（P＜0.01），在黃酮濃度為100μg/mL時，葡萄糖消耗量顯著（P＜0.05）。超聲波法提取的黃酮培養(yǎng)細胞對葡萄糖-6-磷酸酶的酶活力大小隨著黃酮濃度的增加呈現(xiàn)上升的趨勢，在黃酮濃度為50μg/mL時，葡萄糖消耗量極顯著（P＜0.01），在黃酮濃度為20μg/mL時，葡萄糖消耗量顯著（P＜0.05）。微波法提取的黃酮培養(yǎng)細胞對葡萄糖-6-磷酸酶的酶活力大小隨著黃酮濃度的增加呈現(xiàn)上升的趨勢，在黃酮濃度為50μg/mL～100μg/mL之間葡萄糖-6-磷酸酶的活力增長十分平緩，基本接近停止增長，在黃酮濃度為50μg/mL時，葡萄糖消耗量極顯著（P＜0.01），在黃酮濃度為100μg/mL時，葡萄糖消耗量顯著（P＜0.05）。通過三種方法相比較，得到葡萄糖-6-磷酸酶的酶活力大小為：常規(guī)法＜微波法＜超聲波法，即降糖效果：常規(guī)法＞微波法＞超聲波法。

2.6 玉米須黃酮培養(yǎng)的肝癌HepG2細胞對葡萄糖激酶（GK）的實驗見圖7。

圖7 玉米須黃酮培養(yǎng)的肝癌HepG2細胞對葡萄糖激酶（GK）的影響

將培養(yǎng)的肝癌HepG2細胞破碎處理后，測定肝癌HepG2細胞對葡萄糖激酶的酶活力大小，因為葡萄糖激酶對葡萄糖具有分解作用，所以其酶活力越高降糖效果越好。其中常規(guī)法提取的黃酮培養(yǎng)細胞對葡萄糖激酶的酶活力大小隨著黃酮濃度的增加呈現(xiàn)上升的趨勢，在黃酮濃度為50μg/mL時，葡萄糖消耗量極顯著（P＜0.01），在黃酮濃度為100μg/mL時，葡萄糖消耗量顯著（P＜0.05）。超聲波法提取的黃酮培養(yǎng)細胞對葡萄糖激酶的酶活力大小隨著黃酮濃度的增加呈現(xiàn)上升的趨勢，在黃酮濃度為50μg/mL時，葡萄糖消耗量極顯著（P＜0.01），在黃酮濃度為20μg/mL時，葡萄糖消耗量顯著（P＜0.05）。微波法提取的黃酮培養(yǎng)細胞對葡萄糖激酶的酶活力大小隨著黃酮濃度的增加呈現(xiàn)上升的趨勢，在黃酮濃度為50μg/mL時，葡萄糖消耗量極顯著（P＜0.01），在黃酮濃度為20μg/mL時，葡萄糖消耗量顯著（P＜0.05）。通過三種方法相比較，得到對葡萄糖激酶的酶活力的大小為：超聲波法＞微波法＞常規(guī)法，即降糖效果：超聲波法＞微波法＞常規(guī)法。

3 結(jié)論

通過玉米須黃酮培養(yǎng)肝癌HepG2細胞，對培養(yǎng)液中葡萄糖的消耗量、細胞對甘油三酯（TG）、葡萄糖-6-磷酸酶（G-6-Pase）、葡萄糖激酶（GK）的作用影響，反應出玉米須黃酮的降糖消耗比較明顯，并且每種方法提取的黃酮對各個指標的影響也不完全相同。其中培養(yǎng)液中葡萄糖的影響，通過測細胞培養(yǎng)液中葡萄糖的消耗量得出：微波法＞超聲波法＞常規(guī)法，即降糖效果：微波法＞超聲波法＞常規(guī)法；甘油三酯（TG）的影響，通過測破碎后細胞對甘油三酯試劑盒中含量得出：微波法＜常規(guī)法＜超聲波法，即降糖效果：微波法＞常規(guī)法＞超聲波法；葡萄糖-6-磷酸酶（G-6-Pase）的影響，通過測破碎后細胞對葡萄糖-6-磷酸酶的酶活力得出：常規(guī)法＜微波法＜超聲波法，即降糖效果：常規(guī)法＞微波法＞超聲波法；葡萄糖激酶（GK）的影響，通過測破碎后細胞對葡萄糖激酶的酶活力得出：超聲波法＞微波法＞常規(guī)法，即降糖效果：超聲波法＞微波法＞常規(guī)法。雖然每種方法的降糖效果有所不同，但每種方法的降糖效果都比較顯著。

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Study on Hypoglycemic Effect of Corn Flavonoids on Hepatocellular Carcinoma Cells

WANG Qiushi1，2，LI Fenglin2
（1.Jilin Agriculture University School of Food Engineering，Changchun 130118；2.Jilin Agricultural Science and Technology University School of Food Engineering，Jilin 132101）

Study on Hypoglycemic Effect of Corn Flavonoids on HepG2 Cells.The low level，medium and high concentration of the flavonoids were set up by the extracted flavonoids，and the positive，the model and the blank experiment were carried out.The medium and high concentration of cornflavonoids were used to induce glucose and triglycerides to be hypoglycemic.The decomposition of glucose-6-phosphate to play a role in the inhibition of hypoglycemic action，the glucose kinase decomposition of glucose play a role in promoting hypoglycemic effect.Lay the foundation for the alleviation of diabetes.

Flavonoids；hepatoma cells；hypoglycemic

R285

A

2017-04-23

吉林農(nóng)業(yè)科技學院2014年種子基金

王秋實（1993-），男，吉林省四平市人，吉林農(nóng)業(yè)科技學院2015級食品加工與安全專業(yè)碩士研究生。

※為本文通訊作者

責任編輯：建德鋒