張技，蔣淼，李白雪

桂郁金對(duì)肝星狀細(xì)胞TGF-β1/Smad信號(hào)通路的影響

張技1，蔣淼2，李白雪1

目的：探討桂郁金對(duì)肝纖維化的作用機(jī)制。方法：用血小板衍生生長(zhǎng)因子（PDGF）誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞HSC-T6活化，隨后采用桂郁金醇提取物進(jìn)行干預(yù)；采用ELISA法測(cè)定細(xì)胞上清液中Ⅰ型、Ⅲ型膠原的含量，采用半定量RT-PCR法檢測(cè)細(xì)胞中TGF-β1、Smad2、Smad3 mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果：與空白組相比，模型組中上清液中Ⅰ型、Ⅲ型膠原的含量明顯增高（P＜0.01），TGF-β1、Smad2、Smad3 mRNA的表達(dá)均呈現(xiàn)顯著增高（P＜0.01）；與模型組相比，桂郁金醇提取物低濃度組、高濃度組上清液中Ⅰ型、Ⅲ型膠原含量均有所下降（P＜0.05），TGF-β1 mRNA的表達(dá)水平存在差異（P＜0.05），Smad3 mRNA的表達(dá)水平在高濃度組中存在差異（P＜0.05）。結(jié)論：桂郁金可能通過(guò)抑制TGF-β1/Smad信號(hào)通絡(luò)，起到抗肝纖維化的作用。

桂郁金；肝纖維化；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1；Smad

肝纖維化（hepatic fibrosis, HF）是肝細(xì)胞受到炎癥刺激或壞死時(shí)，肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cells, HSC）被激活，進(jìn)而增殖，合成并分泌大量的細(xì)胞外基質(zhì)（extra cellular matrix, ECM），導(dǎo)致ECM沉積增多，形成肝纖維化。祖國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)并無(wú)肝纖維化的記載，現(xiàn)代醫(yī)家根據(jù)其臨床癥狀，將肝纖維化歸于“積聚”、“脅痛”、“肝著”等病癥的范疇。目前，在臨床上，尚未開(kāi)發(fā)出針對(duì)肝纖維化有效治療的西藥。已有研究顯示，桂郁金對(duì)改善肝功能、抗肝纖維化有顯著療效，但其作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究[1～2]。本研究利用血小板衍生生長(zhǎng)因子（platelet derived growth factor, PDGF）誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞HSC-T6活化，隨后采用桂郁金醇提取物進(jìn)行干預(yù)，旨在研究桂郁金對(duì)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（transforming growth factor - β1, TGF-β1）及其下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子Smads表達(dá)水平的影響，以探討桂郁金抗肝纖維化的作用機(jī)制。

1 材料

1.1 細(xì)胞株

本實(shí)驗(yàn)采用肝星狀細(xì)胞株HSC-T6，購(gòu)自四川大學(xué)華西醫(yī)院生物治療國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

1.2 藥物、試劑與儀器

桂郁金（購(gòu)自廣西欽州陸屋鎮(zhèn)）；新生小牛血清（蘭州民海生物有限公司），DMEM培養(yǎng)基（Gihco，Grand Island，NY，美國(guó)），Ⅰ型、Ⅲ型膠原試劑盒（上海森熊科技實(shí)業(yè)有限公司），TRIZOL Reagent試劑（Inicitrogen，CA），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（EasyScript First-Strand cDNA Synthesis Super Mix，北京全式金生物技術(shù)有限公司），PCR試劑盒（Fermentas）；Powerwave XS型全波長(zhǎng)掃描酶標(biāo)儀（Bio-tek，美國(guó)），PCR儀（Bio-radiCycler，美國(guó)）

2 方法

2.1 實(shí)驗(yàn)分組

實(shí)驗(yàn)設(shè)定4組，分別為空白組、模型組、桂郁金醇提取物低濃度組、桂郁金醇提取物高濃度組。將HSC-T6接種于含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，在37℃、5%CO2、95%濕度條件下培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HSC-T6細(xì)胞以1.0×105個(gè)/孔的密度接種于96孔板，在37℃、5% CO2的條件下，培養(yǎng)過(guò)夜。分別在模型組、桂郁金醇提取物低濃度組、高濃度組加入血小板衍生生長(zhǎng)因子PDGF (終濃度5 μg﹒L-1)，30 min后，在低、高濃度組分別加入桂郁金醇提取物(終濃度22.5 μmol﹒L-1、90 μmol﹒L-1)，分別培養(yǎng)48 h。

2.2 HSC-T6上清液中膠原的含量的檢測(cè)

HSC-T6細(xì)胞分組培養(yǎng)48 h后，收集上清液，用ELISA測(cè)定上清液中Ⅰ型、Ⅲ型膠原的含量。

2.3 半定量RT-PCR檢測(cè)HSC-T6中TGF-β1、Smad2、Smad3 mRNA的表達(dá)水平

H S C-T 6細(xì)胞分組培養(yǎng)4 8 h后，采用TRIzol法抽提總RNA。TGF-β1 上游引物：5’-TGGAGTTGTCCGGCAGTGGC-3’，下游引物：5’-TGCTGTACTGTGTGTCCAGG-3’；Smad2上游引物：5’-TACCCACTCCATTCCA-3’，下游引物：5’-TGATAAACGGAATCAA -3'；Smad3上游引物：5'-TTCCAGAAACCCCACCT-3'，下游引物：5'-GACAGCCTCAAA-GCCCT-3'；內(nèi)源性參照引物β-a c t i o n R a c t i n 2 2 9 S：5’-CGGACTCATCGTACTCCTGCT-3’，Ractin229AS：5’-CGTAAAGACCTCTATGCCAACA-3’

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0，數(shù)據(jù)用表示，組間采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 HSC-T6上清液中膠原含量

與空白組相比，模型組中上清液中Ⅰ型、Ⅲ型膠原的含量明顯增高；與模型組相比，桂郁金醇提取物干預(yù)48 h后，低濃度組、高濃度組上清液中Ⅰ型、Ⅲ型膠原含量均有所下降，具體結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 各組HSC-T6上清液中膠原含量的比較

3.2 HSC-T6中TGF-β1、Smad2、Smad3 mRNA的表達(dá)水平

與空白組相比，模型組TGF-β1、Smad2、Smad3 mRNA的表達(dá)均呈現(xiàn)顯著增高；與模型組相比，桂郁金醇提取物低濃度組、高濃度組中TGF-β1 mRNA的表達(dá)水平存在差異，Smad2 mRNA的表達(dá)水平差異不明顯，Smad3 mRNA的表達(dá)水平在低濃度組中差異不明顯，在高濃度組中存在差異，具體結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 各組HSC-T6中TGF-β1、Smad2、Smad3 mRNA表達(dá)水平的比較

4 討論

HSC的活化增殖是肝纖維化發(fā)生的中心環(huán)節(jié)。活化的HSC 轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，合成大量ECM，導(dǎo)致ECM合成和降解失衡，促進(jìn)了肝纖維化的發(fā)生[3～4]。因此，抑制HSC的活化增殖或促進(jìn)活化的HSC凋亡是防治肝纖維化的重要手段。TGF-β是一類能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)和分化的多肽，具備多種生物作用，在肝纖維化發(fā)生發(fā)展過(guò)程中具有活化HSC，促進(jìn)膠原基因表達(dá)，促進(jìn)ECM合成與沉積等作用，是最重要的促肝纖維化細(xì)胞因子之一[5～6]。Smads蛋白是TGF-β受體復(fù)合物下游起重要作用的信號(hào)分子， TGF-β通過(guò)與Smad2、3等結(jié)合，使其發(fā)生磷酸化，隨后引起靶基因的轉(zhuǎn)錄，Ⅰ型膠原等細(xì)胞外基質(zhì)大量合成，進(jìn)而促進(jìn)肝纖維化[7]。

HSC激活增生轉(zhuǎn)化是肝纖維化的中心環(huán)節(jié)，TGF-β是這一病理過(guò)程中必需的生物調(diào)節(jié)因子，Smads 又是TGFβ唯一的作用底物，故TGFβ- Smads信號(hào)通路對(duì)HSC產(chǎn)生的影響引起極大關(guān)注[8～9]。TGFβ-Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在肝纖維化發(fā)病中起著舉足輕重的作用，干預(yù)該信號(hào)通路就成為肝纖維化防治的理想選擇[10]。

研究結(jié)果顯示，HSC-T6在PDGF作用48 h后，引起了TGF-β1、Smad2、Smad3 mRNA表達(dá)水平的顯著上調(diào)，同時(shí)在培養(yǎng)細(xì)胞上清液的檢測(cè)中，發(fā)現(xiàn)Ⅰ型、Ⅲ型膠原含量顯著升高，提示PDGF通過(guò)TGF-β1/Smad通路使肝星狀細(xì)胞活化，促進(jìn)HSC-T6分泌Ⅰ型、Ⅲ型膠原。同時(shí)，HSC-T6在PDGF作用30 min后，采用桂郁金醇提取物干預(yù)后發(fā)現(xiàn)，TGF-β1 mRNA的表達(dá)水平存在差異，且呈現(xiàn)出隨劑量的增長(zhǎng)差異更顯著，Smad3 mRNA的表達(dá)水平在低濃度組中差異不明顯，在高濃度組中存在差異，Smad2 mRNA的表達(dá)水平差異不明顯；在培養(yǎng)細(xì)胞上清液的檢測(cè)中，發(fā)現(xiàn)Ⅰ型、Ⅲ型膠原含量均有所下降，且隨干預(yù)藥物劑量的升高而降低。結(jié)果提示，桂郁金醇提取物可能通過(guò)TGF-β1/Smad通路，抑制HSC-T6的活化、增殖，進(jìn)而起到抗肝纖維化的作用。

本研究雖然起到了相關(guān)的提示作用，但在TGF-β1/Smad通路中，有著大量信號(hào)因子，本實(shí)驗(yàn)僅檢測(cè)了相關(guān)的TGF-β1、Smad2、Smad3 mRNA表達(dá)情況，數(shù)據(jù)不夠全面。此外，在基因表達(dá)過(guò)程中，還會(huì)受到許多因素的調(diào)控，本實(shí)驗(yàn)中還未涉及到相關(guān)蛋白表達(dá)的測(cè)定，及調(diào)控因素的檢測(cè)，這些都是在以后的實(shí)驗(yàn)中可進(jìn)一步完善。

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Effects and mechanism of Guangxi Yujin on TGF -β1/Smad signaling pathways in HSC-T6

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ZHANG Ji1, JIANG Miao2,LI Bai-xue1//(1. School of Basic Medicine, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu, 611137, Sichuan; 2.School of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu, 611137, Sichuan)

Objective: To investigate the protective effects and mechanism of Guangxi Yujin on hepatic fibrosis. Method:HSC-T6 was activated by platelet-derived growth factor(PDGF), and then treated by alcohol extracts of Guangxi Yujin. The ELISA method was adopted to detect the contents of collagen Ⅰand Ⅲ in supernatant of hepatic stellate cell (HSC-T6). mRNA expressions of transforming growth factor (TGF)- β1, Smad2, Smad3 were measured by semiquantitative RT-PCR. Result: The contents of collagen Ⅰand Ⅲ in supernatant of HSC-T6, and the expressions of TGF- β1, Smad2, Smad3 mRNA in HSC-T6 were markedly higher (P＜0.01) in the model group than those in the blank group. Compared with the model group, the contents of collagen Ⅰand Ⅲin supernatant of HSC-T6 ,and the expression of TGF- β1 in HSC-T6 were lower (P＜0.05) in alcohol extracts of Guangxi Yujin group.Conclusion: Guangxi Yujin probably plays a role of anti-hepatic fi brosis by inhibiting TGF -β1/Smad signaling pathway.

Guangxi Yujin; hepatic fi brosis; transforming growth factor (TGF)- β1; Smad

R 285.5

A

1674-926X(2017)04-009-03

成都中醫(yī)藥大學(xué)?；?NO. 030018031)

1.成都中醫(yī)藥大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，四川 成都 611137；2.成都中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，四川 成都 611137

張技，女，博士研究生，主要從事中醫(yī)證候的分子生物學(xué)研究Tel：13880552842 Email：27629565@qq.com

2017-02-19

（責(zé)任編輯：陳思敏）