胡珊珊 楊 紅 丁 輝 李修嶺 錢家鳴

ARHI基因?qū)θ艘认侔┙M織血管生成的影響

胡珊珊 楊 紅 丁 輝 李修嶺 錢家鳴

目的探討ARHI基因與胰腺癌組織血管密度和臨床病理的相關(guān)性。方法收集23例胰腺癌石蠟標(biāo)本作為實(shí)驗(yàn)組，27例正常胰腺石蠟標(biāo)本作為對照組。然后采用免疫組化方法檢測兩組標(biāo)本ARHI、CD34蛋白表達(dá)情況；分析ARHI、CD34蛋白表達(dá)與胰腺癌的關(guān)系；分析ARHI與MVD的相關(guān)性。結(jié)果對照組和實(shí)驗(yàn)組標(biāo)本中ARHI陽性率分別為88.9%(24/27)、21.7%(5/23)，實(shí)驗(yàn)組標(biāo)本中ARHI基因表達(dá)下降，兩組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；對照組MVD值顯著低于實(shí)驗(yàn)組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)； ARHI表達(dá)與胰腺癌分化程度呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，其中腫瘤分化程度越低，ARHI表達(dá)缺失概率越大；實(shí)驗(yàn)組標(biāo)本中CD34陽性表達(dá)較高，多數(shù)具有管腔結(jié)構(gòu)，且MVD值明顯高于對照組標(biāo)本，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；胰腺癌組織中，MVD與ARHI的表達(dá)無相關(guān)性(P>0.05)；而所有統(tǒng)計(jì)病例中，ARHI陰性者比陽性者的MVD值高，且MVD與ARHI的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(P<0.001)。結(jié)論ARHI可能通過抑制胰腺癌微血管的生成進(jìn)而抑制胰腺癌生長。

胰腺癌；腫瘤血管生成；微血管密度

(ThePracticalJournalofCancer,2017,32:1613～1616)

胰腺癌是惡性程度最高的腫瘤之一[1]，在我國，胰腺癌的發(fā)病率和死亡率也逐年上升，由于早期檢出率低，一半胰腺癌患者確診時已全身轉(zhuǎn)移[2]；由于缺少有效的治療手段，胰腺癌患者存活率較低[3]。Yu等[4]于1999年發(fā)現(xiàn)在人類心、腦、胰腺等組織均可以表達(dá)母源性抑癌印跡基因ARHI(aplasia ras homologue member I)。然而和正常組織相比，胰腺癌組織中表達(dá)降低，揭示了ARHI基因可能與腫瘤發(fā)生、發(fā)展相關(guān)[5]。研究發(fā)現(xiàn)腫瘤新生血管的形成直接影響著其生長和轉(zhuǎn)移，因此此次研究我們通過觀察ARHI基因是否影響胰腺癌微血管密度、及其與胰腺癌分化程度、臨床分期相關(guān)性，旨在為ARHI影響胰腺癌生長、轉(zhuǎn)移相關(guān)機(jī)制提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 研究對象

收集我院2013年4月至2016年11月行Whipple手術(shù)并病理診斷均為胰腺導(dǎo)管腺癌的23例胰腺癌石蠟標(biāo)本(臨床病理資料完整)作為實(shí)驗(yàn)組；27例正常胰腺石蠟標(biāo)本作為對照組。其中實(shí)驗(yàn)組男性10例，女性13例；年齡37～76歲，平均年齡(60.61±9.99)歲，兩組石蠟標(biāo)本均制成4 μm大小的切片；對照組男性13例，女性14例，年齡37～79歲，平均年齡(60.44±9.79歲)。兩組標(biāo)本的性別分布以及年齡分布比較，差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.2 主要試劑與方法

ARHI抗體(美國百奇生物公司)，CD34抗體、二步法免疫組化檢測試劑盒(均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。免疫組化步驟：將患者的石蠟切片進(jìn)行常規(guī)的脫蠟、PBS清洗3次；抗原修復(fù)；3%H2O2室溫封閉10 min；4 ℃孵育一抗過夜，同時孵育PBS代替一抗作為陰性對照；孵育二抗室溫60 min，PBS清洗3次；蘇木精復(fù)染2 min，鹽酸酒精分化，PBS清洗3次；脫水、漂洗、透明；最后封片。

1.3 結(jié)果判定

ARHI判斷標(biāo)準(zhǔn)：光鏡下隨機(jī)觀察10個高倍鏡(400倍)視野，每個視野計(jì)數(shù)細(xì)胞100個，陽性為出現(xiàn)棕黃色顆粒，計(jì)算平均值為最終結(jié)果[4]。其中陰性(-)：陽性細(xì)胞數(shù)在0～10%；陽性(+)：陽性細(xì)胞數(shù)在10%～50%；強(qiáng)陽性(++)：陽性細(xì)胞數(shù)超過50%。根據(jù)Weidner等[2]的標(biāo)準(zhǔn)判斷微血管密度(MVD)：低倍鏡下確定密度最高腫瘤內(nèi)血管區(qū)域，然后換高倍鏡(×200)觀察最高數(shù)目5個視野的微血管數(shù)目，然后以平均值為最終結(jié)果。其中鏡下為棕黃或棕褐色的內(nèi)皮細(xì)胞、細(xì)胞叢以及不相連分支結(jié)構(gòu)作為一個微血管，排除血管壁>50 μm的血管。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 19.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析；計(jì)量資料用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用卡方χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法檢驗(yàn)；等級變量采用Spearman相關(guān)分析，以P<0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ARHI在胰腺癌組織中的表達(dá)情況

ARHI陽性均勻的棕褐或棕黃色顆粒，主要在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，少數(shù)胞核呈棕黃色。ARHI蛋白也在正常胰腺組織導(dǎo)管以及腺泡細(xì)胞中表達(dá)；然而大部分胰腺癌組織不表達(dá)ARHI蛋白。對照組和實(shí)驗(yàn)組標(biāo)本中ARHI陽性率分別為88.9%(24/27)、21.7%(5/23)，實(shí)驗(yàn)組標(biāo)本中ARHI基因表達(dá)下降，兩組數(shù)據(jù)比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 兩組標(biāo)本ARHI蛋白表達(dá)情況比較/例

2.2 MVD計(jì)數(shù)

實(shí)驗(yàn)組標(biāo)本中MVD值(43.47±6.44)明顯高于對照組(27.84±2.01)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。

2.3 ARHI蛋白表達(dá)和胰腺癌的關(guān)系

統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，ARHI的表達(dá)與胰腺癌分化程度呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，即腫瘤分化程度越低，ARHI表達(dá)缺失概率越大，見表2。

2.4 MVD與胰腺癌臨床病理特征的關(guān)系

觀察MVD與胰腺癌臨床病理因素的關(guān)系發(fā)現(xiàn)：胰腺癌中微血管密度(MVD)與年齡、飲酒史、血清CA199、CA242水平、腫瘤大小、分化程度、臨床分期、血管浸潤以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P<0.001)；其中年齡≤60歲、飲酒、血清CA199高表達(dá)、CA242水平低表達(dá)，臨床分期越晚、分化程度越低、腫瘤直徑越大、出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、無血管浸潤的患者M(jìn)VD更高，見表3。

2.5 ARHI的表達(dá)與MVD的關(guān)系

在胰腺癌組織中，MVD值A(chǔ)RHI陰性者(45.03±6.35)比陽性者(40.07±5.95)高，但MVD與ARHI的表達(dá)無相關(guān)性(P>0.05，t=1.563)；而所有統(tǒng)計(jì)病例中，MVD值A(chǔ)RHI陰性者(42.75±6.94)比陽性者(31.57±6.13)高，且MVD與ARHI的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(P<0.001，Z=-4.472)。

3 討論

胰腺癌作為惡性程度最高的腫瘤，臨床上由于早期胰腺癌難以診斷，造成患者發(fā)病為時已晚引起死亡。調(diào)查發(fā)現(xiàn)胰腺癌5年內(nèi)存活率不足10%，因此分析胰腺癌發(fā)病的相關(guān)機(jī)制對于患者的及時治療意義重大。

血管生成作為腫瘤生長、轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因素，腫瘤組織的新生血管可為腫瘤細(xì)胞提供充足的營養(yǎng)，為腫瘤細(xì)胞增殖、浸潤、轉(zhuǎn)移提供有利條件。自1971年Folkman[6]第一次提出新生血管可以為腫瘤的生長提供條件，人們越來越關(guān)注實(shí)體瘤血管形成，因此抑制腫瘤新生血管生成可以作為抑制腫瘤生長的重要靶點(diǎn)。

表2 ARHI蛋白表達(dá)與胰腺癌臨床病理的關(guān)系/例

注：除分化程度外其他項(xiàng)目均采用Fisher確切概率法，#為采用χ2檢驗(yàn)，χ2=7.806。

母源性印跡基因ARHI可多種組織中表達(dá)，研究發(fā)現(xiàn)其在乳腺癌、胰腺癌等組織中表達(dá)下降，說明其可能具有抑制腫瘤的作用。目前研究發(fā)現(xiàn)ARHI可以通

表3 MVD與胰腺癌臨床病理特征的關(guān)系

注：a為與高分化組相比，b為與中分化組相比。

過母源性印跡來抑制腫瘤細(xì)胞生長，控制細(xì)胞周期[7]，調(diào)節(jié)血管生成[8]。其中甲基化異常[9-10]、雜合性丟失[11]以及組蛋白的乙?；痆12]有關(guān)可能是導(dǎo)致ARHI的失活的原因。然而人們并未完全清楚ARHI如何影響腫瘤血管生成、調(diào)控胰腺癌微環(huán)境。本實(shí)驗(yàn)通過在人胰腺癌組織學(xué)水平分析ARHI基因?qū)π律苌杉跋嚓P(guān)機(jī)制的影響，并闡述新生血管對腫瘤發(fā)展的影響，為靶向治療胰腺癌提供理論依據(jù)。

此次研究結(jié)果顯示，對照組和實(shí)驗(yàn)組標(biāo)本中ARHI陽性率分別為88.9%(24/27)、21.7%(5/23)，實(shí)驗(yàn)組標(biāo)本中ARHI基因表達(dá)下降，兩組數(shù)據(jù)比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，這說明了ARHI蛋白在胰腺癌中的表達(dá)出現(xiàn)了明顯的下降趨勢。分析前期研究結(jié)果我們發(fā)現(xiàn)，ARHI蛋白在46例胰腺癌組織中有29例表達(dá)缺失，缺失率為63.0%；而39例正常胰腺組織中僅3例表達(dá)缺失，缺失率僅為7.7%(3/39)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。此外，我們還發(fā)現(xiàn)ARHI的表達(dá)和胰腺癌分化程度呈負(fù)相關(guān)性(P<0.05)。這說明了ARHI基因可以抑制胰腺癌分化，進(jìn)一步說明ARHI基因可以起到抑癌基因的作用。而ARHI的表達(dá)與年齡、性別以及臨床分期等因素?zé)o相關(guān)性，其原因可能是參與此次研究的樣本數(shù)不足，后面可擴(kuò)大樣本深入研究。

MVD作為腫瘤血管新生的標(biāo)志，可以通過CD31、CD34來標(biāo)記血管內(nèi)皮細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組標(biāo)本中CD34陽性表達(dá)較多，多數(shù)具有管腔結(jié)構(gòu)，且MVD值明顯高于對照組標(biāo)本，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，說明血管生成可能促進(jìn)胰腺癌的發(fā)生發(fā)展。胰腺癌中年齡越小者、飲酒者、分化程度差、CA199分泌多、臨床分期晚、發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及瘤直徑大的患者M(jìn)VD值越高。其原因可能是正常組織無法為胰腺大量供血，而腫瘤組織含大量血管可為其提供營養(yǎng)，有利于胰腺癌生長、轉(zhuǎn)移。此外，分化程度低易引起組織缺氧，導(dǎo)致HIF-1α表達(dá)上升，促使血管生成。

在胰腺癌組織中，MVD與ARHI的表達(dá)無相關(guān)性(P>0.05)；而所有統(tǒng)計(jì)病例中，ARHI陰性者比陽性者的MVD值高，且MVD與ARHI的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(P<0.001)。這提示我們腫瘤組織的新生血管形成以及細(xì)胞增殖的機(jī)制復(fù)雜，容易受到其微環(huán)境中其他因子的影響，只有通過大量樣本數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析才能解決這個問題。

綜上所述，ARHI基因可以抑制胰腺癌新生血管形成以及癌細(xì)胞的生長，這對于研究腫瘤發(fā)生、發(fā)展意義重大，為臨床上胰腺癌患者的靶向治療提供理論依據(jù)。

[1] Siegel R,Naishadham D,Jemal A.Cancer statistics,2013〔J〕.CA Cancer J Clin,2013,63(1):11-30.

[2] Vincent A,Herman J,Schulick R,et al.Pancreatic cancer〔J〕. Lancet,2011,378(9791):607-620.

[3] Stathis A,Moore M J.Advanced pancreatic carcinoma:current treatment and future challenges〔J〕.Nat Rev Clin Oncol,2010,7(3):163-172.

[4] Yu Y,Xu F,Peng H,et al.NOEY2 (ARHI),an imprinted putative tumor suppressor gene in ovarian and breast carcinomas〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA,1999,96(1):214-219.

[5] Hisatomi H,Nagao K,Wakita K,et al.ARHI/NOEY2 inactivation may be important in breast tumor pathogenesis〔J〕.Oncology,2002,62(2):136-140.

[6] Folkman J,Hochberg M.Self-regulation of growth in three dimensions〔J〕.J Exp Med,1973,138(4):745-753.

[7] Lu X,Qian J,Yu Y,et al.Expression of the tumor suppressor ARHI inhibits the growth of pancreatic cancer cells by inducing G1 cell cycle arrest〔J〕.Oncol Rep,2009,22(3):635 -640.

[8] Zhao X,Li J,Zhuo J,et al.Reexpression of ARHI inhibits tumor growth and angiogenesis and impairs the mTOR/VEGF pathway in hepatocellular carcinoma〔J〕.Biochem Biophys Res Commun,2010,403(3):417-421.

[9] Yuan J,Luo RZ,Fujii S,et al.Aberrant methylation and silencing of ARHI,an imprinted tumor suppressor gene in which the function is lost in breast cancers〔J〕.Cancer Res,2003,63(14):4174-4180.

[10] Peng H,Xu F,Pershad R,et al.ARHI is the center of allelic deletion on chromosome 1p31 in ovarian and breast cancers〔J〕.Int J Cancer,2000,86(5):690-694.

[11] Yang H,Lu X,Qian J,et al.Imprinted tumor suppressor gene ARHI induces apoptosis correlated with changes in DNA methylation in pancreatic cancer cells〔J〕.Mol Med Rep,2010,3(4):581-587.

[12] Yu Y,Fujii S,Yuan J,et al.Epigenetic regulation of ARHI in breast and ovarian cancer cells〔J〕.Ann N Y Acad Sci,2003,983(1):268-277.

TheEffectofARHIonTumorAngiogenesisinPancreaticCancer

HUShanshan,YANGHong,DINGHui,etal.

People'sHospitalofZhengzhouUniversity,Zhengzhou,450003

ObjectiveTo analyze the correlation between ARHI gene and vascular density and clinicopathological features of pancreatic cancer.Methods23 paraffin specimens of pancreatic cancer were collected as the experimental group,27 normal pancreatic paraffin specimens were collected as the control group.Immunohistochemical method was used to detect the expression of ARHI and CD34 protein in the 2 groups.The relationship between the expression of ARHI and CD34 protein in pancreatic cancer and the correlation between ARHI and MVD.The MVD group was significantly lower than that of the control group,the difference was statistically significant (P<0.05);the expression of ARHI was negatively associated with the differentiation of pancreatic cancer (P<0.05),wherein the lower the degree of tumor differentiation,the greater the probability of loss of ARHI expression.ResultsThe positive rates of ARHI in the control group and the experimental group were 88.9%(24/27) and 21.7%(5/23),the expression of ARHI gene in experimental group decreased,the difference between the 2 groups was statistically significant (P<0.05).In the experimental group,the positive expression of CD34 was more,most of them had the lumen structure,and the MVD value was significantly higher than that of the control group,the difference was statistically significant (P<0.001).There was no correlation between the expression of MVD and ARHI in pancreatic cancer tissues (P>0.05).In all the cases,the MVD value of the ARHI negative patients was higher than that of the positive ones,and the expression of MVD was negatively correlated with the expression of ARHI (P<0.001).ConclusionARHI may suppress the growth of pancreatic cancer through the microvessel angiogenesis.

Pancreatic carcinoma;Tumor angiogenesis;MVD

450003 鄭州大學(xué)人民醫(yī)院(胡珊珊，丁 輝，李修嶺)；100032 北京協(xié)和醫(yī)院(楊 紅，錢家鳴)

錢家鳴

10.3969/j.issn.1001-5930.2017.10.014

R735.9

A

1001-5930(2017)10-1613-04

2017-03-08

2017-06-12)

(編輯吳小紅)