岳麗曉，李登云，張玲玲

（鄭州工業(yè)應用技術學院 醫(yī)學院，河南 鄭州 451100）

擬南芥衰老相關突變體lsm3的鑒定和基因克隆

岳麗曉，李登云，張玲玲

（鄭州工業(yè)應用技術學院 醫(yī)學院，河南 鄭州 451100）

本研究采用葉綠素熒光成像技術，對葉衰老相關突變體進行篩選，研究使用材料為南芥T-DNA插入突變體庫.表型重復后提取突變體的DNA，利用PCR技術和DNA瓊脂糖凝膠電泳技術對突變體進行T-DNA插入驗證.然后采用TAIL-PCR技術擴增T-DNA兩翼序列，對目的條帶回收測序，最后分析測序結果確定葉衰老突變體的候選基因.

擬南芥；衰老相關基因；葉綠素熒光；T-DNA；突變體

1 前言

1.1 研究目的與意義

由于細胞、器官、組織或者整個植株水平的生理功能衰退稱為植物衰老，植物衰老最終會表現(xiàn)為植物生命周期的結束，或者植物的自然死亡[1].植物葉片衰老不僅代表了植物生命周期的結束，而且對于研究發(fā)育生物學有重要的作用.有些作物會產(chǎn)生種子，當發(fā)生衰老，葉片同化功能就會退化，從而影響作物的產(chǎn)量，包括大部分農(nóng)作物，無法充分發(fā)揮作物產(chǎn)量的潛力，對于蔬菜作物來說也是如此，影響采摘質(zhì)量[2].在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，控制葉片衰老，有針對性地進行防治，對于延長農(nóng)產(chǎn)品的貯藏期，或者提高作物的產(chǎn)量有重要的意義.對葉片衰老的深入研究，可以幫助更好地了解葉片的發(fā)育過程，并且利用研究的成果，進行農(nóng)業(yè)指導，控制葉片衰老，促進農(nóng)業(yè)的發(fā)展，為人類造福.

1.2 葉片衰老機制的研究現(xiàn)狀

葉衰老盡管是由發(fā)育階段決定，但它同樣受激素和環(huán)境信號的調(diào)控.影響衰老的主要外部因素有：紫外線、臭氧、遮蔽、氯化鈉等；影響植物衰老的內(nèi)部因素有：生長素、水楊酸、ABA、乙烯、赤霉素等[3].葉衰老開始后，光合作用相關基因表達得到削弱，而與此同時卻有眾多的基因表達量獲得增加，這些基因被命名為衰老誘導基因SAGs.通過進一步的研究觀察發(fā)現(xiàn)，在調(diào)控葉衰老的過程中，轉錄因子發(fā)揮著一定的作用，比如轉錄因子WRKY70可以對葉衰老的起始進行調(diào)控[4].上世紀四十年代，研究者們發(fā)現(xiàn)，從光合有機體發(fā)射出的葉綠素熒光，和自身的光合活性有密切的關系[5-6].利用葉綠素熒光成像儀，能夠對葉片PSII中的電子傳遞效率進行測定，并且沒有任何侵害，測定速度較快[7].

1.3 葉綠素熒光成像技術在葉衰老方面的研究應用

葉綠素熒光幾乎全部來源于PSII的Chla，活體葉綠素熒光提供的快速信息僅能反映PSII對激發(fā)能的利用和耗散情況.本實驗通過對發(fā)射光的能量大小的調(diào)制，獲得相關的光合參數(shù)，進一步了解光合能力的強弱[8].通過測定衰老的水稻葉片葉綠素熒光參數(shù)Fv/Fm，發(fā)現(xiàn)葉綠素的含量越高，葉片的光合作用越大，光合作用和葉綠素含量有正相關的關系.Rubisco的含量，以及Rubisco活性與光合速率也有正相關關系，降低Rubisco含量和活性，會導致光合速率的降低.黑暗處理擬南芥保綠突變體pph-1，對比于野生型，葉綠素熒光參數(shù)Fv/Fm下降更多，表示受衰老影響的葉綠體降解，能夠較大作用于pph-1的光合作用能力[9].研究AtNAP化學誘導性超表達植株顯示，使用地塞米松外源進行處理，葉片出現(xiàn)早衰，并且黃化嚴重，并且Fv/Fm比值有大幅下降.該基因的回補轉基因苗顯示野生型，F(xiàn)v/Fm比值變化，與其表型變化相同[10].本實驗利用葉綠素熒光成像技術篩選葉衰老相關突變體是可行的，并在此基礎上用TAIL-PCR技術進行基因的擴增分析.

2 實驗過程

2.1 實驗材料

野生生態(tài)型Col-0、T-DNA突變體.

2.2 培養(yǎng)基及常用溶液的配制

MS固體篩選培養(yǎng)基，0.1%升汞、溴化乙錠溶液、TAE緩沖液、DNA上樣緩沖液、DEPC處理的水、DNA提取液、甘露醇(Man)溶液、考馬斯亮藍G-250染料試劑、甲基磺酸乙酯誘變液、10×PCRbuffer.

2.3 實驗方法

2.3.1 點種.取定量擬南芥干燥的種子，消毒，再用無菌水沖洗，經(jīng)過處理后點播在MS固體培養(yǎng)基上，于4℃條件下春化3天，放于培養(yǎng)間中培養(yǎng)12天后供實驗用.

2.3.2 衰老突變體的鑒定.將生長12天的幼苗進行葉綠素熒光成像，篩選出Fv/Fm較野生型擬南芥差別較大的，繼續(xù)培養(yǎng)一段時間后將其移至土中.待幼苗生長兩周左右后，對其進行葉綠素熒光成像分析.然后將其遮光暗處理四天進行葉綠素熒光成像分析，篩選Fv/Fm較野生型差異較大的個體留作實驗用.

2.3.3 T-DNA插入的鑒定.(1)DNA的提取.剪取上述步驟中篩選出的擬南芥幼苗的兩片葉子，置于1.5mL的EP管中，并加入100μLDNA提取液充分研磨.再往管中加入600μLDNA提取液，混勻后在4℃、12000rpm條件下高速離心15min.棄去沉淀，吸取上清至新的EP管中，并往上清液中加入等體積的異丙醇700μL，使DNA沉淀搖勻，于-20℃過夜沉淀.將過夜后的溶液 4℃、12000rpm離心10min，沉淀DNA，棄上清，留沉淀.在沉淀中加入1mL體積分數(shù)為20%的酒精，再在4℃、12000rpm的條件下高速離心5min.倒去酒精，將EP管倒置于吸水紙上風干，向管中加入30μL無菌去離子水，并在離心機上短甩后置于-20℃條件下保存.

(2)DNA的擴增.擴增上述步驟所獲的DNA.PCR反應體系如下：（單位：μL）

buffer 2 dNTP 2引物(LP&RP) (1+1)Taq酶 0.2 H2O 11.8 DNA 2

(3)瓊脂糖凝膠電泳.采用瓊脂糖凝膠電泳處理擴增產(chǎn)物，首先稱取1g瓊脂糖，準備100mlTAE，將瓊脂糖加入TAE中加熱，直到全部熔化.靜置一定時間降低溫度后，在混合物中加入溴化乙錠，并混勻，溴化乙錠為0.5mg/ml，5μL.將所得物質(zhì)放入制膠槽中，將梳子插入，等到凝固完成，小心拔出梳子，將凝膠和支撐物全部放入電泳槽中，加入電泳緩沖液體，液面比凝膠高1mm.再加入上述TAIL-PCR反應第三輪的產(chǎn)物和Marker.電壓為180V，溴酚藍移動，直到在凝膠距離2cm左右，電泳操作停止，進行觀察和拍照，保留數(shù)據(jù)和圖像.因插入T-DNA的基因過長，在設定的PCR反應中無法擴增，故無條帶的即為所需篩選的T-DNA插入突變體.

2.3.4衰老相關基因的鑒定.（1）T-DNA插入旁側序列的擴增.該過程采用的是TAIL-PCR技術，TAIL-PCR技術是通過3個嵌套的特異性引物分別和簡并引物組合，進行PCR循環(huán)，共采取三輪連續(xù)操作.AD引物Tm值為44℃到46℃，特異性引物的為57℃到62℃.熱循環(huán)程序采用低溫隨機擴增，高溫特異性擴增，相間進行，擴增特異產(chǎn)物，對隨機引物產(chǎn)生的非特異性擴增進行抑制，得到的片段可以直接用作測序模板、探針標記.（2）瓊脂糖凝膠電泳及膠回收.將第三輪PCR的產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈環(huán)境下切出瓊脂糖凝膠，瓊脂糖凝膠含有DNA，吸取干凈其表面的液體，然后稱重計算體積.1mg=1μL作為計算體積的標準.在膠塊中加入DR-I溶液，混合均勻，進行加熱，將膠塊融化，并進行振蕩充分混合.再次加入一半DR-I溶液，混合均勻.后經(jīng)多次濾過、離心、洗脫獲得DNA.（3）測序.將上述實驗過程中得到的DNA送往生物公司進行測序，比照擬南芥基因組圖譜確定基因.

3 結果與分析

3.1 葉衰老突變體lsm3表型鑒定

在此實驗基礎上，篩選到一批潛在的葉衰老相關突變體.分別將這些突變體單株收種，對其進行表型重復剔除假陽性突變體，共獲得表型穩(wěn)定且能夠穩(wěn)定遺傳的葉衰老相關突變體15株，在本研究中對其中的一種突變體lsm3做了具體表型分析和基因克隆.如圖所示，在暗處理前，突變體與野生型之間在葉綠素熒光參數(shù)Fv/Fm指標上無差別，暗處理三天后，lsm3的Fv/Fm值明顯低于野生型.之后野生型和突變體之間的差異消失，說明lsm3確為葉衰老突變體.

圖1 突變體暗處理前后葉綠素熒光參數(shù)的變化

3.2 LSM3基因克隆

為使基因功能研究效果更好，采用TAIL-PCR技術對該基因進行克隆.首先對lsm3其進行了T-DNA插入驗證.因PCR擴增所用的特異引物是根據(jù)T-DNA序列設計的，所以只有T-DNA插入的突變體才能擴增出目的條帶.電泳結果如圖2，lsm3突變體能夠擴增出大約1000bp的目的條帶，而野生型則無任何條帶出現(xiàn)，說明lsm3確為T-DNA插入突變體.

圖2 T-DNA插入驗證結果

第二輪TAIL-PCR反應中，擴增到1個特異條帶，其長度500bp左右.以第2輪反應的產(chǎn)物為基礎模板，進行PCR循環(huán)擴增，最終得到一個片段，長度大約400bp.在操作中，為了防止擴增出現(xiàn)問題，采用瓊脂糖凝膠電泳進行分析，分別用第二輪的產(chǎn)物和第三輪的產(chǎn)物.特異引物具有嵌套的特點，因此第三輪的產(chǎn)物比第二輪反應產(chǎn)物小，兩者的距離和引物的位置相差距離一致，即片段長度和LexA4和LexA5在T-DNA上的位置差相同.回收作為特異性目標片段的第三輪產(chǎn)物，進行測序表明，T-DNA插入到LSM3基因內(nèi)部，引起突變體對干旱敏感的表型.

圖3 TAIL-PCR產(chǎn)物電泳和測序結果

4 討論

總的來說，跟其它基因克隆的方法相比,TAIL-PCR優(yōu)勢更多，第一是操作簡單，能夠節(jié)省許多時間，模板可以直接采用基因組DNA，并且這種方式不會要求很高純度和數(shù)量的模板，通常只需要幾個ng的DNA即可，可快速獲得目標片段.第二成本低：TAIL-PCR只需要設計幾個嵌套特異引物和簡并引物即可，節(jié)省成本，但是傳統(tǒng)的方式要求較高的實驗技術和樣品質(zhì)量，在RNA的提取、純化等過程中，需要耗費許多時間和成本，才能得到結果，與TAIL-PCR完全相反.第三TAIL-PCR具有較高的靈敏性和特異性.采用短的簡并引物，結合長的特異性嵌套引物，在分級反應、不對稱溫度循環(huán)下，可以擴增特異引物，并且最終產(chǎn)物質(zhì)量較高，擴增產(chǎn)物中的目的片段有絕對優(yōu)勢，能夠直接用作測序模板和探針標記.但是TAIL-PCR技術也有一些缺點.第一是要求反應條件比較精細，需要連續(xù)三輪的嵌套反應，并且每一輪十分重要，如果一輪出現(xiàn)問題，就會對下一輪造成影響，從而影響最終的結果，無法保證實驗的準確性.第二TAIL-PCR需要的引物組合比較多，不同的AD引物結合位點也有不同，AD引物結合位點有限，不是每次結果都是陽性，個別擴增中，即使不同的簡并引物，也可能不能得到陽性結果.

實驗最終獲得結果說明利用葉綠素熒光成像技術和TAIL-PCR來鑒定擬南芥衰老相關基因切實可行.本實驗只是初步鑒定了與衰老相關的該種基因，為了使TAIL-PCR的實驗結果更加真實可靠，對實踐指導更有意義，需要進一步的研究觀察，采用RT-PCR對突變體基因的情況進行檢驗，從而降低TAIL-PCR技術中可能出現(xiàn)的錯誤.

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A

1673-260X（2017）10-0009-03

2017-07-05

河南省社科聯(lián)重點支持課題 “大學生網(wǎng)上消費調(diào)查研究”（SKL-2017-2606）；河南省民協(xié)規(guī)劃課題基金項目（hmx20160411）課題名稱：角色互換法在民辦高校護理專業(yè)教學中的應用研究