王 勝，熊 飛，開(kāi)金丹

(湖北省腫瘤醫(yī)院胸外科，武漢 430079)

研究報(bào)告

miR-424對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株A549遷移及侵襲
的影響

王 勝，熊 飛，開(kāi)金丹*

(湖北省腫瘤醫(yī)院胸外科，武漢 430079)

目的探討miR-424對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株A549遷移及侵襲的影響。方法RT-PCR法檢測(cè)肺癌細(xì)胞NCI-H460、NCI-H1975、NCI-H446、A549、NCI-H1299、NCI-H157及人胚肺成纖維細(xì)胞MRC-5中miR-424表達(dá)，脂質(zhì)體LipofectamineTM2000將miR-424 inhibitor和miR-424 NC轉(zhuǎn)入A549細(xì)胞中，48 h后，RT-PCR法檢測(cè)miR-424表達(dá)，CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力，劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力，Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力，western blot檢測(cè)基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP2)、MMP9、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)及p-Smad3的表達(dá)。結(jié)果miR-424在肺癌細(xì)胞NCI-H460、NCI-H1975、NCI-H446、A549、NCI-H1299、NCI-H157中的[(1.78±0.13)，(1.69±0.10)，(1.89±0.18)，(2.88±0.27)，(2.52±0.20)，(2.49±0.23)]表達(dá)量顯著高于miR-424在人胚肺成纖維細(xì)胞MRC-5中的(0.58±0.05)表達(dá)量(P< 0.01)。與miR-424 NC組比較，miR-424 inhibitor組miR-424表達(dá)量顯著降低(P< 0.01)，細(xì)胞活力下降(P< 0.01)，細(xì)胞遷移及侵襲能力降低(P<0.01)，MMP2，MMP9，TGF-β1及p-Smad3表達(dá)量均顯著下調(diào)(P< 0.01)。結(jié)論miR-424表達(dá)量下調(diào)后能通過(guò)抑制TGF-β1/Smad3信號(hào)通路進(jìn)而抑制A549細(xì)胞的遷移及侵襲。

miR-424；非小細(xì)胞肺癌；A549；遷移；侵襲

肺癌是一種常見(jiàn)的呼吸道惡性腫瘤，在全世界范圍內(nèi)發(fā)病率及死亡率均居首位，且逐年成上升趨勢(shì)。肺癌包括非小細(xì)胞肺癌及(non-small cell lung cancer,NSCLC)小細(xì)胞肺癌(SCLC)，前者占了將近85%的比例。近些年來(lái)雖然隨著外科手術(shù)、化療、放療等醫(yī)學(xué)技術(shù)手段不斷提高，肺癌患者術(shù)后5年生存率仍不足5%，預(yù)后極差。造成這一結(jié)果的主要原因是肺癌的侵襲轉(zhuǎn)移，因此探討肺癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制對(duì)于肺癌的治療將具有重要意義[1-3]。miRNA是一種長(zhǎng)度約為21～23 nt的高度保守的非編碼小RNA分子，通過(guò)靶向調(diào)控靶基因mRNA表達(dá)，參與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡、遷移及侵襲轉(zhuǎn)移等生命過(guò)程[4, 5]。眾多研究已經(jīng)表明miRNA在包括肺癌在內(nèi)的眾多腫瘤組織中異常表達(dá)，miR-424是其中一種[5, 6]。miR-424是miR-16家族的一員，研究顯示miR-424在不同的腫瘤組織中表達(dá)趨勢(shì)不同，在NSCLC、乳腺癌、腎癌等組織中表達(dá)量上調(diào)，在宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌、卵巢癌中表達(dá)量下調(diào)[7, 8]，但在腫瘤的發(fā)生過(guò)程中的具體作用機(jī)制尚未見(jiàn)報(bào)道，因此本研究將探討miR-424在肺癌細(xì)胞株中的表達(dá)，及其對(duì)肺癌細(xì)胞遷移及侵襲的影響及相關(guān)機(jī)制。

1 材料和方法

1.1細(xì)胞株

人大細(xì)胞肺癌細(xì)胞NCI-H460，人肺腺癌細(xì)胞NCI-H1975，人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞NCI-H446，人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549，H1299，NCI-157，人胚肺成纖維細(xì)胞MRC-5購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。

1.2主要試劑和儀器

miR-424 inhibitor和miR-424 NC均購(gòu)自廣州銳博技術(shù)有限公司。兔抗人MMP2、MMP9、TGF-β1、Smad3和p-Smad3多克隆抗體均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。胎牛血清和DMEM培養(yǎng)基均購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司。辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG (H+L)、BCA試劑盒和CCK-8試劑盒均購(gòu)自南京凱基生物技術(shù)有限公司。Trizol法試劑盒、LipofectamineTM2000脂質(zhì)體和一步法RT-PCR試劑盒均購(gòu)自大連寶生生物技術(shù)有限公司。Transwell小室購(gòu)自美國(guó)Corning公司。DYCZ-425D型雙垂直電泳儀和DYCZ-40D型轉(zhuǎn)印電泳儀均購(gòu)自北京六一儀器廠。GelDoc XR System凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)伯樂(lè)公司。FACSCalibur型流式細(xì)胞儀和168-1000XC型酶標(biāo)儀均購(gòu)自美國(guó)BD公司。AF6000型熒光顯微鏡購(gòu)自德國(guó)萊卡公司。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 RT-PCR法檢測(cè)miR-424在細(xì)胞中的表達(dá)

使用Trizol試劑盒提取細(xì)胞總RNA，并檢測(cè)純度；接著采用一步法RT-PCR將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA并進(jìn)行擴(kuò)增；最后利用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)cDNA擴(kuò)增產(chǎn)物。miR-424上游引物：5’- CAGCAGC AAUUCAUGUUUUGAA -3’，下游引物：5’-CGCTTC ACGAATTTGCGTGTCAT-3’； GAPDH上游引物：5’-AGCCACATCGCTCAGACA-3’，下游引物：5’-TGGA CTCCACGACGTACT-3’。 上游引物和下游引物由上海生工合成。

1.3.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

當(dāng)A549細(xì)胞生長(zhǎng)至50%左右時(shí)，利用LipofectamineTM2000脂質(zhì)體將miR-424 inhibitor和miR-424 NC轉(zhuǎn)染到A549細(xì)胞中，6 h后棄去培養(yǎng)液，換成含10%血清的DMEM培養(yǎng)基并繼續(xù)培養(yǎng)48 h。使用RT-PCR法檢測(cè)細(xì)胞中miR-424表達(dá)。

1.3.3 CCK-8法檢測(cè)A549細(xì)胞活力

將5×103個(gè)A549細(xì)胞接種至96孔板，培養(yǎng)24 h，按“1.3.2”進(jìn)行轉(zhuǎn)染，48 h時(shí)每孔中均加入CCK-8試劑，繼續(xù)孵育4 h，然后利用酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)570 nm處的OD值，所測(cè)OD值即為細(xì)胞活力。

1.3.4 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力

取按“1.3.2”進(jìn)行轉(zhuǎn)染的A549細(xì)胞接種到6孔板，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，用200 μL的槍頭對(duì)6孔板內(nèi)的細(xì)胞進(jìn)行劃痕，接著用PBS洗去脫落下來(lái)的細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，于倒置顯微鏡下進(jìn)行拍照并每孔選取4個(gè)視野進(jìn)行劃痕距離的記錄。

1.3.5 Transwell法檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力

實(shí)驗(yàn)前將Matrigel膠均勻的平鋪于Transwell小室微膜上，備用。將1×104個(gè)A549細(xì)胞接種于6孔板后，按“1.3.2”進(jìn)行轉(zhuǎn)染，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，用胰蛋白酶將細(xì)胞消化下來(lái)并制成單懸液，用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基重懸，并接種至Transwell上室，下室僅加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，48 h后，將Transwell小室取出，用多聚甲醛固定細(xì)胞，接著結(jié)晶紫染色，并在倒置顯微鏡下進(jìn)行觀察，對(duì)Transwell下室5個(gè)視野中的細(xì)胞計(jì)數(shù)取平均值，即為細(xì)胞的侵襲數(shù)目。

1.3.6 Western blot檢測(cè)細(xì)胞MMP2、MMP9、TGF-β1、Smad3、p-Smad3中表達(dá)

將1×105個(gè)細(xì)胞接種至6孔板，按“1.3.2”操作步驟進(jìn)行轉(zhuǎn)染，培養(yǎng)48 h，在冰浴條件下將6孔板中的細(xì)胞刮取并離心收集，向其中加入細(xì)胞裂解液，30 min后離心收取上清液即為總蛋白，總蛋白濃度測(cè)定及定量根據(jù)BCA試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行，接著將蛋白煮沸變性，取大約30 ng左右蛋白樣品上樣，進(jìn)行十二烷基苯磺酸鈉凝膠電泳2 h；接著濕法轉(zhuǎn)膜30～50 min。2%BSA室溫下孵育1 h，一抗溶液(兔MMP2，MMP9，TGF-β1，Smad3，p-Smad3多克隆抗體，稀釋度為1∶100) 4℃過(guò)夜孵育。第二天在室溫條件下，在二抗溶液(辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG (H+L))中孵育1～2 h，凝膠成像系統(tǒng)中曝光。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1miR-424在肺癌細(xì)胞及胚肺成纖維細(xì)胞中的表達(dá)

如圖1所示，miR-424在肺癌細(xì)胞NCI-H460、NCI-H1975、NCI-H446、A549、NCI-H1299、NCI-H157中[(1.78±0.13)、(1.69±0.10)、(1.89±0.18)、(2.88±0.27)、(2.52±0.20)、(2.49±0.23)]的表達(dá)量顯著高于miR-424在人胚肺成纖維細(xì)胞MRC-5(0.58±0.05)中的表達(dá)量，差異有顯著性(P< 0.01)。

注：1：MRC-5；2：NCI-H460；3：NCI-H1975；4：NCI-H446；5：A549；6：NCI-H1299；7：NCI-H157；與MRC-5比較，** P< 0.01；miR-214表達(dá)量即是miR-214的拷貝數(shù)。圖1 miR-424在肺癌細(xì)胞及胚肺成纖維細(xì)胞中的表達(dá)Note.1：MRC-5 cells；2：NCI-H460 cells；3：NCI-H1975 cells；4：NCI-H446 cells；5：A549 cells；6：NCI-H1299 cells；7：NCI-H157 cells；Compared with MRC-5, ** P< 0.01；The expression of miR-214 is miR-214 copy number.Fig.1 Expression of miR-424 in the lung cancer cells and embryonic lung fibroblasts

注：與miR-424 NC比較，** P< 0.01。圖2 miR-424 inhibitor轉(zhuǎn)染效果的檢測(cè)Note.Compared with the miR-424 NC, ** P< 0.01.Fig.2 Detection of transfection efficiency of miR-424 inhibitor

2.2miR-424inhibitor轉(zhuǎn)染效果的檢測(cè)

如圖2所示，與miR-424 NC組(2.89±0.28)比較，miR-424 inhibitor組(0.74±0.07)中miR-424表達(dá)量下降 (P< 0.01)。

2.3miR-424inhibitor對(duì)A549細(xì)胞活力的影響

與miR-424 NC組(0.72±0.07)比較，miR-424 inhibitor組(0.35±0.03)細(xì)胞活力均降低 (P< 0.01)。

2.4miR-424inhibitor對(duì)A549細(xì)胞遷移及侵襲能力的影響

如圖3所示，與miR-424 NC組(25.34±2.35)比較，miR-424 inhibitor組(4.78±0.45)細(xì)胞遷移距離降低(P< 0.01)。如圖4所示，與miR-424 NC組(156.49±14.55)比較，miR-424 inhibitor組(39.76±3.28)細(xì)胞侵襲數(shù)目降低(P< 0.01)。

圖3 miR-424 inhibitor對(duì)A549細(xì)胞遷移能力的影響( ×200)Fig.3 Effect of miR-424 inhibitor on A549 cell migration ability

圖4 miR-424 inhibitor對(duì)A549細(xì)胞侵襲能力的影響( ×200)Fig.4 Effect of miR-424 inhibitor on A549 cell invasion ability

2.5miR-424inhibitor對(duì)A549細(xì)胞中MMPs表達(dá)量的影響

如圖5所示，與miR-424 NC組比較，miR-424 inhibitor組中MMP2、MMP9表達(dá)量顯著下調(diào)，差異有顯著性(P< 0.01)。

圖5 miR-424 inhibitor對(duì)A549細(xì)胞中MMPs表達(dá)量的影響Fig.5 Effect of miR-424 inhibitor on the expression of MMPs in A549 cells

2.6miR-424inhibitor對(duì)A549細(xì)胞中TGF-β信號(hào)通路的影響

如圖6所示，與miR-424 NC組比較，miR-424 inhibitor組中TGF-β1、p-Smad3表達(dá)量顯著下調(diào)，差異有顯著性(P< 0.01)。

圖6 miR-424 inhibitor對(duì)A549細(xì)胞中TGF-β信號(hào)通路的影響Fig.6 Effect of miR-424 inhibitor on TGF-β signal pathway in A549 cells

3 討論

相關(guān)學(xué)者于1993年在秀麗隱桿線蟲中首次發(fā)現(xiàn)了miRNA的存在，即lin-4；于2000年在秀麗隱桿線蟲中又發(fā)現(xiàn)了第二個(gè)miRNA，即let-7。后續(xù)的十幾年來(lái)在脊椎動(dòng)物、植物及病毒中發(fā)現(xiàn)了近千種的miRNA，并發(fā)現(xiàn)了miRNA不僅與生長(zhǎng)發(fā)育，免疫調(diào)控有關(guān)，還發(fā)現(xiàn)miRNA所定位的基因組處于腫瘤相關(guān)的脆性區(qū)，提示了miRNA與腫瘤的發(fā)生可能密切相關(guān)[4, 5]。相關(guān)學(xué)者于2002年證實(shí)了miRNA和腫瘤的關(guān)系，慢性淋巴細(xì)胞白血病患者中miR-15和miR-16表達(dá)量下調(diào)，并且這兩個(gè)miRNA與白血病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，引發(fā)了探討miRNA在腫瘤發(fā)生過(guò)程中的作用的相關(guān)研究[5, 6]。miR-15/16家族包括了miR-15a/b，miR-16，miR-195，miR-424和miR-497。其中miR-424定位于人類染色體Xq26.3上，但在鼠類中的同源物為miR-322。研究顯示miR-424在不同的生理和病理?xiàng)l件下其作用效果不一樣。如miR-424在NSCLC、乳腺癌、腎癌等組織中表達(dá)量上調(diào)，在宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌、卵巢癌中表達(dá)量下調(diào)，但具體的作用機(jī)制尚未見(jiàn)報(bào)道[7, 8]。因此本研究將探討miR-424在肺癌中的作用機(jī)制。首先Chen等[9]研究發(fā)現(xiàn)miR-424在肺癌患者病灶組織及肺癌細(xì)胞系中的表達(dá)量均顯著提高。Donnem等[10]研究發(fā)現(xiàn)生存時(shí)間短的NSCLC患者中miR-424表達(dá)量顯著的高于生存時(shí)間長(zhǎng)的NSCLC患者，且這一過(guò)程可能與miR-424促血管生成有關(guān)。所以本研究首先利用RT-PCR法檢測(cè)肺癌細(xì)胞NCI-H460，NCI-H1975，NCI-H446，A549，NCI-H1299，NCI-H157及人胚肺成纖維細(xì)胞MRC-5中miR-424的表達(dá)量，結(jié)果與Chen等[9]，Donnem等[10]研究一致，肺癌細(xì)胞中miR-424的表達(dá)量顯著高于MRC-5細(xì)胞中的表達(dá)量，提示miR-424在肺癌的發(fā)生發(fā)展中起促進(jìn)作用。同時(shí)miR-424在A549中的表達(dá)量最高，所以本研究選取此細(xì)胞株作為后續(xù)研究對(duì)象。接著利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染miR-424 inhibitor和miR-424 NC，RT-PCR法證明轉(zhuǎn)染成功。進(jìn)一步CCK-8法檢測(cè)miR-424 inhibitor對(duì)A549細(xì)胞活力的影響，結(jié)果表明miR-424 inhibitor能顯著的降低A549活力，與miR-424在胃癌細(xì)胞中的作用一致[11]。

研究已經(jīng)顯示肺癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致肺癌患者預(yù)后不良，5年生存率低的主要原因[1-3]。因此本研究進(jìn)一步的探討miR-424 inhibitor對(duì)A549細(xì)胞遷移及侵襲能力的影響，結(jié)果表明miR-424 inhibitor能顯著的抑制A549的遷移及侵襲能力。weel，Chk1，CYLD，Wnt3a，BCL-2，E2F6蛋白是目前已報(bào)道的miR-424的靶基因，但上述蛋白主要與細(xì)胞增殖、凋亡、細(xì)胞周期有關(guān)的，而與細(xì)胞的遷移及侵襲關(guān)系不大[7, 8]。另外細(xì)胞外基質(zhì)的降解是細(xì)胞遷移，侵襲及轉(zhuǎn)移等過(guò)程中的必經(jīng)過(guò)程，MMPs是降解細(xì)胞外基質(zhì)最為主要的蛋白水解酶。同時(shí)MMPs也是一組Zn2+-Ca2+依賴性蛋白酶，可以降解幾乎所有的ECM成分。其中MMP2可以通過(guò)降解細(xì)胞外基質(zhì)成分和誘導(dǎo)血管新生進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)[12]。MMP9是MMPs中分子量最大的蛋白水解酶，幾乎也能降解所有的細(xì)胞外基質(zhì)成分，提高腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力[13]。所以本研究進(jìn)一步的探討miR-424 inhibitor對(duì)A549細(xì)胞遷移及侵襲的影響，結(jié)果表明miR-424 inhibitor能顯著的下調(diào)MMP2及MMP9表達(dá)量，提示miR-155 inhibitor能通過(guò)下調(diào)MMPs進(jìn)而抑制A549細(xì)胞的遷移及轉(zhuǎn)移。

腫瘤細(xì)胞的遷移、侵襲等生物學(xué)過(guò)程受多種信號(hào)通路調(diào)控，TGF-β就是其中一種[14, 15]。TGF-β包括TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3，其中TGF-β1研究最為廣泛。而TGF-β1/Smad信號(hào)通路也是TGF-β1介導(dǎo)的最為主要的信號(hào)通路，TGF-β1與其下游受體Smad2/3結(jié)合后，將信號(hào)傳遞到細(xì)胞核，進(jìn)而調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄。且有研究表明miR-424能通過(guò)抑制TGF-β1/Smad3信號(hào)通路進(jìn)而抑制胃癌細(xì)胞的增殖，遷移等生物學(xué)行為[11]，提示miR-424可能也可以通過(guò)調(diào)控TGF-β1/Smad3信號(hào)通路進(jìn)而抑制A549細(xì)胞的遷移及侵襲。所以本研究繼續(xù)探討miR-424 inhibitor對(duì)A549細(xì)胞中TGF-β1/Smad3信號(hào)通路的影響，結(jié)果表明miR-424 inhibitor能顯著的下調(diào)TGF-β1、p-Smad3表達(dá)，進(jìn)而抑制A549細(xì)胞的遷移及侵襲。

綜上所述，miR-424在肺癌細(xì)胞中的表達(dá)量高于人胚肺成纖維細(xì)胞中的表達(dá)量，miR-424 inhibitor能顯著的抑制A549細(xì)胞的遷移及侵襲，并下調(diào)MMP2及MMP9表達(dá)，與抑制TGF-β1/Smad3信號(hào)通路有關(guān)。

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EffectofmiR-424onmigrationandinvasionofnon-smallcelllungcancercellsA549

WANG Sheng， XIONG Fei， KAI Jin-dan*

(Department of Thoracic Surgery, Hubei Cancer Hospital, Wuhan 430079，China)

ObejectivesTo explore the effect of miR-424 on migration and invasion of non-small cell lung cancer A549 cells.MethodsExpression of miR-424 in NCI-H460, NCI-H1975, NCI-H446, A549, NCI-H1299, NCI-H157 lung cancer cells and embryonic lung fibroblasts MRC-5 cells was examined by RT-PCR.miR-424 inhibitor and miR-424 NC were transfected into A549 cells with liposome LipofectamineTM2000. Cell viability was measured by MTT assay. Cell migration and invasion was measured by wound scratch assay and transwell migration assay,respectively.The expression of matrix metalloproteinase 2 (MMP2), MMP9, transforming growth factor-β (TGF-β1), p-Smad3 was measured by western blot.ResultsThe expression of miR-424 in NCI-H460, NCI-H1975, NCI-H446, A549, NCI-H1299, NCI-H157 cells (1.78±0.13, 1.69±0.10, 1.89±0.18, 2.88±0.27, 2.52±0.20, 2.49±0.23) was significantly higher than that in MRC-5 cell 0.58±0.05(P< 0.01). Compared with the miR-424 NC group, the cell viability was reduced (P<0.01), cell migration and invasion ability was decreased (P< 0.01), and the expression of MMP2, MMP9, TGF-β1, p-Smad3 protein was down-regulated in miR-424 inhibitor group (P< 0.01).ConclusionsmiR-424 inhibitor can inhibit the migration and invasion in lung cancer A549 cells via inhibition of TGF-β1/Smad3 signal pathway.

miR-424; Non-small cell lung cancer; A549; Migration; Invasion

R-33

A

1671-7856(2017) 10-0074-06

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.10.015

2017-02-14

王勝(1980-)，男，碩士生，主治醫(yī)師，研究方向：胸部腫瘤的外科及綜合治療。E-mail: 13643651@qq.com

開(kāi)金丹，E-mail: glucosecn@hotmail.com