龐鵬飛，李 冰，毛軍杰，周 斌，胡曉俊，張永裕，敖 峰，單 鴻*

(1.中山大學(xué)附屬第五醫(yī)院介入醫(yī)學(xué)中心，2.眼科，廣東 珠海 519000)

人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞靶向納米基因載體制備及體外細(xì)胞磁共振成像

龐鵬飛1，李 冰2，毛軍杰1，周 斌1，胡曉俊1，張永裕1，敖 峰1，單 鴻1*

(1.中山大學(xué)附屬第五醫(yī)院介入醫(yī)學(xué)中心，2.眼科，廣東 珠海 519000)

目的探討靶向納米基因載體單鏈神經(jīng)節(jié)苷脂抗體-聚乙二醇-聚乙烯亞胺-超順磁性氧化鐵(scAbGD2-PEG-g-PEI-SPION)轉(zhuǎn)染人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(hBMSCs)的可行性、效率及體外細(xì)胞MR顯像能力。方法合成scAbGD2-PEG-g-PEI-SPION后，采用凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)評估其復(fù)合外源性基因的能力；動態(tài)光散射法測量scAbGD2-PEG-g-PEI-SPION/pDNA納米復(fù)合物的粒徑大小及表面電位；體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)檢測其對hBMSCs的細(xì)胞毒性。采用流式細(xì)胞儀檢測scAbGD2-PEG-g-PEI-SPION靶向轉(zhuǎn)染hBMSCs的效率，并設(shè)置PEG-g-PEI-SPION組、cAbGD2-PEG-g-PEI-SPION組、抗體競爭抑制(scAbGD2-PEG-g-PEI-SPION+free AbGD2)組和同型抗體(scAbIgG2a-PEG-g-PEI-SPION)組，通過激光共聚焦顯微鏡及普魯士藍(lán)染色觀察hBMSCs對納米復(fù)合物的攝入。通過體外細(xì)胞MR掃描驗(yàn)證scAbGD2-PEG-g-PEI-SPION的MR成像功能。結(jié)果scAbGD2-PEG-g-PEI-SPION細(xì)胞毒性小，復(fù)合外源性基因后能夠形成穩(wěn)定的納米復(fù)合物，粒徑80～100 nm。在相同的N/P比值下，scAbGD2-PEG-g-PEI-SPION組的轉(zhuǎn)染率明顯高于其他組(P<0.001)。N/P=20時(shí)，靶向組具有最高轉(zhuǎn)染率[(59.60±4.50)%]。同時(shí)，scAbGD2-PEG-g-PEI-SPION中的SPION可有效標(biāo)記hBMSCs，在MR T2/T2*加權(quán)圖像上呈低信號。結(jié)論scAbGD2-PEG-g-PEI-SPION是一種MRI可視的、可有效轉(zhuǎn)染hBMSCs的靶向納米基因載體。

骨髓；間充質(zhì)干細(xì)胞；磁共振成像；靶向基因載體；納米醫(yī)學(xué)

人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(human bone marrow-derived mesenchymal stem cells, hBMSCs)具有向肝樣細(xì)胞分化的潛能，參與肝損傷的修復(fù)[1-2]。隨著對治療機(jī)制研究的深入，發(fā)現(xiàn)移植入肝臟的hBMSCs僅少數(shù)分化為肝樣細(xì)胞，多數(shù)hBMSCs以旁分泌和免疫調(diào)節(jié)的方式參與肝損傷的修復(fù)，極大降低了其預(yù)期療效[3]。有學(xué)者[4-6]研究發(fā)現(xiàn)hBMSCs可分化為肌成纖維樣細(xì)胞，不僅未發(fā)揮治療作用，反而加重了肝纖維化，甚至導(dǎo)致肝硬化。目前仍缺乏對hBMSCs生物學(xué)過程長期、實(shí)時(shí)示蹤的有效手段[7-9]。納米醫(yī)學(xué)的發(fā)展和分子影像學(xué)技術(shù)的進(jìn)步為解決間充質(zhì)干細(xì)胞領(lǐng)域的共性難題提供了可能。本研究根據(jù)hBMSCs表面標(biāo)記物二唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂GD2(neural ganglioside)制備靶向納米基因載體，評價(jià)制備該載體的可行性、效率及體外細(xì)胞MR顯像功能。

1 材料與方法

1.1 材料 根據(jù)文獻(xiàn)[10-11]的方法合成聚乙二醇-聚乙烯亞胺-超順磁性氧化鐵(PEG-g-PEI-SPION)。hBMSCs由中山大學(xué)干細(xì)胞中心惠贈。細(xì)胞培養(yǎng)基(Dulbecco's modified Eagle's medium，DMEM，low glucose)、胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)、CCK-8試劑盒(Cell Counting Kit-8)購自美國Invitrogen公司。紅色熒光染料popo-3、綠色熒光染料Oregon Green 488、細(xì)胞核熒光染料DAPI購自美國Molecular Probes公司。商品化的陽離子脂質(zhì)體LipofectaminTM2000購自廣州碧云天生物科技公司。增強(qiáng)型綠色熒光蛋白質(zhì)粒(plasmid EGFP-C1, 4.70 kb)提取后采用1%凝膠電泳鑒定，濃度2.40 μg/μl。GD2抗體和GD2同型抗體購自美國BD Biosciene Pharmingen公司。

1.2 靶向納米基因載體單鏈神經(jīng)節(jié)苷脂抗體-聚乙二醇-聚乙烯亞胺-超順磁性氧化鐵(scAbGD2-PEG-g-PEI-SPION)的制備 室溫下100 mg巰基乙胺溶于500 μl含20 μl EDTA(0.5 M，pH=8.0)的PBS中。200 μl GD2抗體與200 μl EDTA充分混合后加入到上述巰基乙胺溶液，37℃孵育90 min，獲得單鏈GD2抗體(single chain AbGD2，scAbGD2)。將單鏈GD2抗體溶液轉(zhuǎn)移至50 ml超濾離心管中(MWCO=10 kDa)，加入15 ml含EDTA的PBS(pH=7.40，每500 μl含10 μl 0.5 M EDTA)，于4℃恒溫離心機(jī)中離心40 min，轉(zhuǎn)速4 000 rpm，重復(fù)3次。加入200 μg mal-PEG-COOH，4℃孵育過夜，反應(yīng)獲得scAbGD2-PEG-COOH。加入15 ml PBS(pH7.4)于4℃恒溫離心機(jī)中離心40 min，轉(zhuǎn)速4 000 rpm，重復(fù)3次。取EDC和NHS各10 μg活化scAbGD2-PEG-COOH中的羧基15 min，加入PEG-g-PEI-SPION 200 μg，充分混合后于4℃反應(yīng)過夜。超濾離心除去小分子雜質(zhì)后將剩余的溶液轉(zhuǎn)移至1.50 ml EP管，12 000 rpm離心除去游離抗體，收集離心后的沉淀，超聲分散至蒸餾水中備用。

1.3 scAbGD2-PEG-g-PEI-SPION/pDNA納米復(fù)合物的制備 將1 μg的pDNA與不同比例的scAb GD2-PEG-g-PEI-SPION分別溶于超純水中，通過靜電作用形成不同N/P比值(scAbGD2-PEG-g-PEI-SPION 的氮原子與pDNA的磷原子的摩爾比)的納米復(fù)合物。

1.4 瓊脂糖凝膠阻滯實(shí)驗(yàn) 制備不同N/P比值(2.1、2.2、2.3、2.4、2.5)的scAbGD2-PEG-g-PEI-SPION/pDNA納米復(fù)合物，pDNA 1 μg，體系10 μl。納米復(fù)合物與加樣緩沖液充分混合后加入到1%的瓊脂糖凝膠中電泳，電壓120 V，時(shí)間25 min。

1.5 納米復(fù)合物的粒徑大小及表面電位測定 制備不同N/P比值(5、10、15、20、25、30、35、40)的PEG-g-PEI-SPION/pDNA和scAbGD2-PEG-g-PEI-SPION/pDNA納米復(fù)合物，pDNA 2 μg，體系100 μl。室溫下使用動態(tài)光散射儀(DLS，ELS-8000，Photal，Japan)測量納米復(fù)合物的粒徑大小及表面電位。

1.6 體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn) hBMSCs以8 000個(gè)細(xì)胞/孔接種于96孔板，每孔加入100 μl全培養(yǎng)基(DMEM含10% FBS，1%青霉素，1%鏈霉素)，于培養(yǎng)箱中(37℃，5% CO2)常規(guī)培養(yǎng)24 h。實(shí)驗(yàn)孔細(xì)胞與不同N/P比值(5、10、15、20、25、30、35、40)的PEG-g-PEI-SPION/pDNA和scAbGD2-PEG-g-PEI-SPION/pDNA納米復(fù)合物(pDNA 0.15 μg，體系3 μl)共同培養(yǎng)24 h。然后向每孔加入10 μl CCK8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)3 h。采用酶標(biāo)儀測定在450 nm處的吸光值。每個(gè)N/P比值設(shè)3個(gè)復(fù)孔，常規(guī)設(shè)置調(diào)零孔和對照孔。

1.7 體外轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn) hBMSCs以2×105個(gè)細(xì)胞/孔接種于6孔板，每孔加入1 ml全培養(yǎng)基，細(xì)胞于培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)12 h。實(shí)驗(yàn)孔細(xì)胞與不同N/P比值(0、10、15、20、30、40)的納米復(fù)合物(pDNA 4 μg，體系30 μl)共同培養(yǎng)12 h，PEG-g-PEI-SPION組和scAbGD2-PEG-g-PEI-SPION組的用量根據(jù)N/P比值計(jì)算。然后更換全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)40 h。對照組的轉(zhuǎn)染采用商品化的陽離子脂質(zhì)體Lipofectamine。每個(gè)樣品均設(shè)3個(gè)復(fù)孔。同時(shí)設(shè)置抗體競爭抑制(scAbGD2-PEG-g-PEI-SPION+free AbGD2)組和同型抗體(scAbIgG2a-PEG-g-PEI-SPION)組進(jìn)行抗體競爭抑制實(shí)驗(yàn)和同型抗體實(shí)驗(yàn)。轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)結(jié)束后使用倒置熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白表達(dá)情況，并使用流式細(xì)胞分析儀(BD，美國)檢測轉(zhuǎn)染率。

1.8 激光共聚焦顯微鏡實(shí)驗(yàn) 綠色熒光染料Oregon Green 488采用超濾法標(biāo)記納米載體。紅色熒光染料popo-3用于標(biāo)記pDNA。Oregon Green 488標(biāo)記的納米載體與popo-3標(biāo)記的pDNA按照N/P=20制備納米復(fù)合物(pDNA 4 μg，體系30 μl)。2×105個(gè)hBMSCs接種于35 mm玻璃底培養(yǎng)皿，加入1 ml全培養(yǎng)基，常規(guī)培養(yǎng)12 h。將上述熒光標(biāo)記的納米復(fù)合物加入到培養(yǎng)基中共同培養(yǎng)6 h。棄去培養(yǎng)基，PBS洗滌3次，加入4%的多聚甲醛1 ml固定10 min后使用DAPI染核15 min。培養(yǎng)皿置于激光共聚焦顯微鏡(Carl Zeiss，德國)下觀察并拍攝圖像。

1.9 普魯士藍(lán)染色實(shí)驗(yàn) hBMSCs以2×105個(gè)細(xì)胞/孔接種于6孔板，常規(guī)培養(yǎng)12 h。將納米復(fù)合物(N/P=20，pDNA 4 μg，體系30 μl)加入到培養(yǎng)基中共同培養(yǎng)6 h。棄去培養(yǎng)基，PBS洗滌3次，加入4%的多聚甲醛1 ml固定10 min。每孔加入1 ml Perls液(2%的亞鐵氰化鉀與2%的鹽酸水溶液等量混合)染色30 min后于顯微鏡下觀察。

1.10 細(xì)胞MR顯像 將hBMSCs以2×105個(gè)細(xì)胞/孔接種于6孔板，常規(guī)培養(yǎng)12 h。制備鐵濃度為0、5、10、20、40、60 μg/ml的納米復(fù)合物(N/P=20，pDNA 4 μg)，共同培養(yǎng)6 h后收集細(xì)胞。采用1.5T MR掃描儀、3 inch表面線圈，對所得細(xì)胞進(jìn)行掃描，獲得T2/T2*加權(quán)圖像。掃描結(jié)束后測量不同鐵濃度下細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)化信號強(qiáng)度。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件，計(jì)量資料以±s表示。在相同的N/P比值下，scAbGD2-PEG-g-PEI-SPION與PEG-g-PEI-SPION的細(xì)胞毒性和Lipofectamine的轉(zhuǎn)染率采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 凝膠阻滯實(shí)驗(yàn) PEG-g-PEI-SPION和scAbGD2-PEG-g-PEI-SPION分別在N/P為2.3和2.4時(shí)完全復(fù)合pDNA，形成電中性或偏正電荷的納米復(fù)合物(圖1)。

圖1 凝膠阻滯實(shí)驗(yàn) A.N/P=2.3時(shí)，PEG-g-PEI-SPION完全復(fù)合pDNA； B.N/P=2.4時(shí)，pDNA被scAbGD2-PEG-g-PEI-SPION完全復(fù)合，此時(shí)pDNA在電泳時(shí)的遷移被完全阻滯

2.2 納米復(fù)合物的粒徑大小及表面電位 PEG-g-PEI-SPIO和scAbGD2-PEG-g-PEI-SPION未復(fù)合pDNA時(shí)粒徑大小約60 nm。N/P≥10時(shí)形成穩(wěn)定的粒徑為80～100 nm的納米復(fù)合物，表面電位隨N/P比值的增大而逐漸增加，見圖2。

2.3 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn) 納米復(fù)合物的細(xì)胞毒性隨N/P比值的增大而增加。N/P=20時(shí)靶向組細(xì)胞的存活率為(80.56±1.29)%，非靶向組細(xì)胞的存活率為(77.70±1.49)%，見圖3。在相同的N/P比值下，scAbGD2-PEG-g-PEI-SPION與PEG-g-PEI-SPION的細(xì)胞毒性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖2 粒徑大小及表面電位測定，兩者未復(fù)合pDNA時(shí)粒徑大小約為60 nm，N/P≥10時(shí)形成穩(wěn)定的粒徑80～100 nm的納米復(fù)合物，表面電位隨N/P比值的增大而增加 A.PEG-g-PEI-SPIO； B.scAbGD2-PEG-g-PEI-SPION 圖3 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn) 納米復(fù)合物的細(xì)胞毒性隨N/P比值的增大而增加

圖4 不同載體轉(zhuǎn)染hBMSCs的結(jié)果 A.N/P=20時(shí)，scAbGD2-PEG-g-PEI-SPION轉(zhuǎn)染hBMSCs后綠色熒光蛋白表達(dá)情況(×100)； B.10 μl Lipofectamine復(fù)合4 μg pDNA轉(zhuǎn)染hBMSCs后綠色熒光蛋白表達(dá)情況(×100)； C.N/P=20時(shí)PEG-g-PEI-SPION轉(zhuǎn)染hBMSCs后綠色熒光蛋白表達(dá)情況(×100)； D.流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果 (#：與相同的N/P比值下scAbGD2-PEG-g-PEI-SPION組比較，P<0.001；*：N/P=20時(shí)，與其余各組比較，P<0.001)

2.4 轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn) 在相同N/P比值下，不同組別間轉(zhuǎn)染率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=105.303，P<0.001)。scAbGD2-PEG-g-PEI-SPION組的轉(zhuǎn)染率明顯高于PEG-g-PEI-SPION組、scAbGD2-PEG-g-PEI-SPION+free AbGD2組和scAbIgG2a-PEG-g-PEI-SPION組(P均<0.001)，余兩兩比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。N/P=20時(shí)，scAbGD2-PEG-g-PEI-SPION組轉(zhuǎn)染率最高，為(59.60±4.50)%；PEG-g-PEI-SPION組的最高轉(zhuǎn)染率為(17.70±2.90)%；scAbGD2-PEG-g-PEI-SPION+free AbGD2組的最高轉(zhuǎn)染率為(16.30±2.60)%；scAbGD2a-PEG-g-PEI-SPION組的最高轉(zhuǎn)染率為(16.70±4.10)%。Lipofectamine轉(zhuǎn)染hBMSCs的最佳條件為4 μg pDNA與10 μl Lipofectamin復(fù)合，此時(shí)轉(zhuǎn)染率為(34.90±3.60)%。N/P=0時(shí)無綠色熒光蛋白表達(dá)，轉(zhuǎn)染率為零(數(shù)據(jù)未列出)。見圖4。

2.5 激光共聚焦顯微鏡及普魯士藍(lán)染色實(shí)驗(yàn) scAbGD2-PEG-g-PEI-SPION組細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見很強(qiáng)的顆粒狀分布的綠色熒光和紅色熒光(圖5)，即hBMSCs攝入了大量的納米復(fù)合物。普魯士藍(lán)染色示scAbGD2-PEG-g-PEI-SPION組hBMSCs的胞質(zhì)內(nèi)可見較多藍(lán)染鐵顆粒(圖6)。

2.6 細(xì)胞MR顯像 scAbGD2-PEG-g-PEI-SPION組、PEG-g-PEI-SPION組及scAbGD2-PEG-g-PEI-SPION+free AbGD2組的細(xì)胞在MR T2/T2*加權(quán)圖像上均呈低信號(圖7)。隨鐵濃度的增加，細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)化信號強(qiáng)度逐漸降低。在相同的鐵濃度下，scAbGD2-PEG-g-PEI-SPION信號降低的程度明顯高于PEG-g-PEI-SPION和scAbGD2-PEG-g-PEI-SPION+free AbGD2制組(圖8)。

圖5 hBMSCs攝取納米復(fù)合物的激光共聚焦顯微鏡實(shí)驗(yàn)(×30) scAbGD2-PEG-g-PEI-SPION組hBMSCs細(xì)胞被DAPI(A)、Oregon Green 488(B)、popo-3(C)和Merge(D)標(biāo)記后的圖像，可見細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有很強(qiáng)的綠色熒光和紅色熒光;PEG-g-PEI-SPION組hBMSCs細(xì)胞被DAPI(E)、Oregon Green 488(F)、popo-3(G)和Merge(H)標(biāo)記后的圖像，及scAbGD2-PEG-g-PEI-SPION+free AbGD組hBMSCs細(xì)胞被DAPI(I)、Oregon Green 488(J)、popo-3(K)和Merge(L)標(biāo)記后的圖像，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)僅可見到少量綠色熒光和紅色熒光

圖6 hBMSCs攝取靶向和非靶向納米復(fù)合物的普魯士藍(lán)染色實(shí)驗(yàn)(×200) A.scAbGD2-PEG-g-PEI-SPION組hBMSCs的胞質(zhì)內(nèi)可見較多的藍(lán)染鐵顆粒； B.PEG-g-PEI-SPION組hBMSCs的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)僅能見到少量的藍(lán)染鐵顆粒 圖7 hBMSCs MR T2/T2*加權(quán)成像 A.T2WI; B.T2*WI (從上向下依次為scAbGD2-PEG-g-PEI-SPION組、PEG-g-PEI-SPION組及scAbGD2-PEG-g-PEI-SPION+free AbGD2組)

3 討論

Ahn等[12]采用PEI為載體負(fù)載綠色熒光蛋白質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染人脂肪來源的間充質(zhì)干細(xì)胞，最高轉(zhuǎn)染率僅19%。本研究PEG-g-PEI-SPION轉(zhuǎn)染hBMSCs的最高轉(zhuǎn)染率僅(17.70±2.90)%。為提高納米載體的轉(zhuǎn)染率，常采用靶向修飾納米載體的方法。細(xì)胞靶向配體如糖基化分子、多肽、蛋白質(zhì)和抗體等均可修飾納米載體，用于細(xì)胞的靶向基因傳輸[13-15]。T淋巴細(xì)胞對病毒載體及非病毒載體的基因改造均不敏感，T細(xì)胞表面特異性高表達(dá)CD3分子。Chen等[16]利用CD3單鏈抗體修飾PEG-g-PEI，合成具有靶向基因傳輸功能的納米載體scAbCD3-PEG-g-PEI，采用scAbCD3-PEG-g-PEI為載體靶向轉(zhuǎn)染CD3+小鼠T淋巴細(xì)胞，所得轉(zhuǎn)染率為非靶向載體PEG-g-PEI的16倍。因此，本研究旨在構(gòu)建靶向載體，對hBMSCs進(jìn)行靶向基因轉(zhuǎn)染，以提高轉(zhuǎn)染效率。

雖然hBMSCs表達(dá)多種表面分子，但特異性地高效識別早期hBMSCs仍較困難。近年來，新的表面分子二唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂GD2備受關(guān)注[17-18]，無論是新分離的還是體外培養(yǎng)的hBMSCs均可持續(xù)表達(dá)GD2，且是骨髓細(xì)胞中唯一表達(dá)該分子的細(xì)胞。GD2是一種含唾液酸的鞘糖脂分子，廣泛分布于hBMSCs細(xì)胞膜外層，Martinez等[17]利用GD2抗體免疫磁珠分選從骨髓細(xì)胞中高效獲取hBMSCs，免疫細(xì)胞化學(xué)和RT-PCR的結(jié)果均顯示hBMSCs高表達(dá)GD2。因此，GD2可作為特異性識別hBMSCs的表面標(biāo)志物。

圖8 hBMSCs的MR顯像標(biāo)準(zhǔn)化信號強(qiáng)度

本研究以GD2為靶點(diǎn)，成功制備了靶向納米基因載體scAbGD2-PEG-g-PEI-SPION。將GD2雙鏈抗體打開成為單鏈抗體scAbGD2，有利于減小納米載體的粒徑，同時(shí)可保留特異性結(jié)合GD2的能力。凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)表明，scAbGD2的存在并不影響scAbGD2-PEG-g-PEI-SPION復(fù)合外源性DNA的能力，也不增加scAbGD2-PEG-g-PEI-SPION的細(xì)胞毒性。scAbGD2-PEG-g-PEI-SPION復(fù)合外源性報(bào)告基因pDNA(pEGFP)后可形成穩(wěn)定的納米復(fù)合物scAbGD2-PEG-g-PEI-SPION/pDNA。scAbGD2-PEG-g-PEI-SPION/pDNA粒徑大小及表面電位適中，細(xì)胞毒性較小，hBMSCs的轉(zhuǎn)染率最高為(59.60±4.50)%，明顯高于非靶向組和對照組的轉(zhuǎn)染率。

為驗(yàn)證scAbGD2靶向轉(zhuǎn)染的特異性，本研究進(jìn)行了抗體競爭抑制實(shí)驗(yàn)、同型抗體實(shí)驗(yàn)、激光共聚焦顯微鏡實(shí)驗(yàn)及普魯士藍(lán)染色實(shí)驗(yàn)，結(jié)果均發(fā)現(xiàn)因scAbGD2與hBMSCs表面的GD2特異性結(jié)合，scAbGD2-PEG-g-PEI-SPION/pDNA組增加了細(xì)胞對靶向納米復(fù)合物的攝入，進(jìn)而提高其轉(zhuǎn)染率，細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度的增加，以及細(xì)胞質(zhì)內(nèi)SPION顆粒的增多。scAbGD2-PEG-g-PEI-SPION同樣具有良好的標(biāo)記hBMSCs進(jìn)行MR顯像的能力。由于scAbGD2-PEG-g-PEI-SPION具有靶向性，因此有可能將scAbGD2-PEG-g-PEI-SPION作為磁性探針，對移植的GD2陽性的hBMSCs進(jìn)行實(shí)時(shí)活體MR示蹤顯像。

總之，scAbGD2-PEG-g-PEI-SPION是一種MRI可視的，可有效轉(zhuǎn)染hBMSCs的靶向納米基因載體。

(致謝：感謝中山大學(xué)醫(yī)學(xué)院干細(xì)胞中心贈予人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞！)

[1] Haga H, Yan IK, Takahashi K, et al. Extracellular vesicles from bone marrow-derived mesenchymal stem cells improve survival from lethal hepatic failure in mice. Stem Cells Transl Med, 2017,6(4):1262-1272.

[2] 謝佩怡，胡曉俊，陳俊偉，等.過表達(dá)肝細(xì)胞核因子4 alpha對人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向肝樣細(xì)胞分化的作用.中國醫(yī)學(xué)影像技術(shù)，2014,30(7):991-995.

[3] Alison MR, Islam S, Lim S. Stem cells in liver regeneration, fibrosis and cancer:The good, the bad and the ugly. J Pathol, 2009,217(2):282-298.

[4] diBonzo LV, Ferrero I, Cravanzola C, et al. Human mesenchymal stem cells as a two-edged sword in hepatic regenerative medicine: Engraftment and hepatocyte differentiation versus profibrogenic potential. Gut, 2008,57(2):223-231.

[5] Quintanilha LF, Mannheimer EG, Carvalho AB, et al. Bone marrow cell transplant does not prevent or reverse murine liver cirrhosis. Cell Transplant, 2008,17(8):943-953.

[6] Baertschiger RM, Serre-Beinier V, Morel P, et al. Fibrogenic potential of human multipotent mesenchymal stromal cells in injured liver. PLoS One, 2009,4(8):e6657.

[7] Cai J, Zhang X, Wang X, et al. In vivo MR imaging of magnetically labeled mesenchymal stem cells transplanted into rat liver through hepatic arterial injection. Contrast Media Mol Imaging, 2008,3(2):61-66.

[8] Bos C, Delmas Y, Desmoulière A, et al. In vivo MR imaging of intravascularly injected magnetically labeled mesenchymal stem cells in rat kidney and liver. Radiology, 2004,233(3):781-789.

[9] Wu C, Li J, Pang P, et al. Polymeric vector-mediated gene transfection of MSCs for dual bioluminescent and MR tracking in vivo. Biomaterials, 2014,35(28):8249-8260.

[10] Pang P, Wu C, Gong F, et al. Nanovector for gene transfection and MR imaging of mesenchymal stem cells. J Biomed Nanotechnol, 2015,11(4):644-656.

[11] 龐鵬飛，李冰，胡曉俊，等.多功能納米基因載體轉(zhuǎn)染人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞及體外細(xì)胞磁共振顯像.中華醫(yī)學(xué)雜志,2014,94(13):1021-1024.

[12] Ahn HH, Lee JH, Kim KS, et al. Polyethyleneimine-mediated gene delivery into human adipose derived stem cells. Biomaterials, 2008,29(15):2415-2422.

[13] Suh W, Chung JK, Park SH, et al. Anti-JL1 antibody-conjugated poly (L-lysine) for targeted gene delivery to leukemia T cells. J Control Release, 2001,72(1-3):171-178.

[14] Lee Y, Kischuk E, Crist S, et al. Targeting and internalization of liposomes by bladder tumor cells using a fibronectin attachment protein-derived peptide-lipopolymer conjugate. Bioconjug Chem, 2017,28(5):1481-1490.

[15] Nasongkla N, Shuai X, Ai H, et al. cRGD-functionalized polymer micelles for targeted doxorubicin delivery. Angew Chem Int Ed Engl, 2004,43(46):6323-6327.

[16] Chen G, Chen W, Wu Z, et al. MRI-visible polymeric vector bearing CD3 single chain antibody for gene delivery to T cells for immunosuppression. Biomaterials, 2009,30(10):1962-1970.

[17] Martinez C, Hofmann TJ, Marino R, et al. Human bone marrow mesenchymal stromal cells express the neural ganglioside GD2: A novel surface marker for the identification of MSCs. Blood, 2007,109(10):4245-4248.

[18] Xu J, Liao W, Gu D, et al. Neural ganglioside GD2 identifies a subpopulation of mesenchymal stem cells in umbilical cord. Cell Physiol Biochem, 2009,23(4-6):415-424.

《中國醫(yī)學(xué)影像技術(shù)》增刊征稿啟事

《中國醫(yī)學(xué)影像技術(shù)》雜志于1985年創(chuàng)刊，是由中國科學(xué)院主管，中國科學(xué)院聲學(xué)研究所主辦的國家級學(xué)術(shù)期刊。本刊是中國科技核心期刊、《中文核心期刊要目總覽》收錄期刊、中國科學(xué)引文數(shù)據(jù)庫核心期刊，刊號ISSN 1003-3289，CN 11-1881/R。2017年度《中國醫(yī)學(xué)影像技術(shù)》增刊擬定于2017年12月出版，現(xiàn)將有關(guān)事項(xiàng)通知如下：

1增刊稿件內(nèi)容放射、超聲、核醫(yī)學(xué)、內(nèi)鏡、介入治療、醫(yī)學(xué)物理與工程學(xué)等方面的論文。

2投稿截止時(shí)間2017年11月30日。

3出刊時(shí)間2017年12月20日。

4增刊規(guī)格同正刊，大16開本。

5征稿要求①有一定的學(xué)術(shù)價(jià)值，論點(diǎn)鮮明，論述嚴(yán)謹(jǐn)；②格式按雜志要求制作，必須包含中英文標(biāo)題，作者署名，作者單位、科室、地址、郵編，第一作者簡介(出生年份、性別、民族、籍貫、學(xué)歷、職稱、研究方向)，中英文摘要，關(guān)鍵詞，正文，參考文獻(xiàn)；③文字通順，表達(dá)清楚，各種符號使用符合規(guī)范；④論著一般不超過5000字為宜；⑤經(jīng)本刊退稿的文章投增刊時(shí)請注明原稿號；⑥直接發(fā)電子郵件至本刊投稿郵箱(cjmit@mail.ioa.ac.cn)，郵件題目“增刊投稿+第一作者姓名+文章名(原稿號)”。

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《中國醫(yī)學(xué)影像技術(shù)》期刊社

2017年7月20日

Targetednano-vectorforgenedeliveryintohumanbonemarrowmesenchymalstemcellsandcellularMRimaginginvitro

PANGPengfei1,LIBing2,MAOJunjie1,ZHOUBin1,HUXiaojun1,ZHANGYongyu1,AOFeng1,SHANHong1*
(1.InterventionalMedicineCenter, 2.DepartmentofOphthalmology,theFifthAffiliatedHospital,SunYat-senUniversity,Zhuhai519000,China)

ObjectiveTo explore the feasibility and efficacy of an MRI-visible, targeted, nano-vector which is synthesized by attaching a targeting ligand, the GD2 single chain antibody (scAb GD2), to the distal ends of PEG-g-PEI-SPION as a carrier for gene delivery into human bone marrow mesenchymal stem cells (hBMSCs) and in vitro cellular MR imaging.MethodsscAbGD2-PEG-g-PEI-SPION was synthesized as previously reported. Gel electrophoresis was performed to assess the pDNA condensation ability of scAbGD2-PEG-g-PEI-SPION. The particle size and Zeta potential of scAbGD2-PEG-g-PEI-SPION/pDNA nanocomplexes were observed by dynamic light scattering. Cytotoxicity of scAbGD2-PEG-g-PEI-SPION was evaluated by CCK-8 assay using hBMSCs. Gene transfection efficiency of scAbGD2-PEG-g-PEI-SPION in hBMSCs was quantified by flow cytometry, PEG-g-PEI-SPION, scAbGD2-PEG-g-PEI-SPION, scAbGD2-PEG-g-PEI-SPION+free AbGD2 and scAbIgG2a-PEG-g-PEI-SPION group was established. The cellular internalization of scAbGD2-PEG-g-PEI-SPION/pDNA nanocomplexes was observed by confocal laser scanning microscopy and Prussian blue staining. MRI of scAbGD2-PEG-g-PEI-SPION was performed by cellular MRI scanning in vitro.ResultsscAbGD2-PEG-g-PEI-SPION condensed pDNA to form stable nanocomplexes of 80—100 nm in diameter and showed low cytotoxicity to hBMSCs. At the same N/P ratio, the transfection efficiency of scAbGD2-PEG-g-PEI-SPION group was significantly higher than those of other groups (P<0.001). At the optimal N/P ratio of 20, scAbGD2-PEG-g-PEI-SPION/pDNA obtained the highest transfection efficiency of (59.60±4.50)% in hBMSCs. Furthermore, hBMSCs labeled with scAbGD2-PEG-g-PEI-SPION showed sensitive low signal intensity on MRI T2/T2*-weighted images in vitro.ConclusionscAbGD2-PEG-g-PEI-SPION is an efficient MRI-visible targeted nano-vector for gene delivery into hBMSCs.

Bone marrow; Mesenchymal stromal cell; Magnetic resonance imaging; Targeted gene vector; Nanomedicine

10.13929/j.1003-3289.201612120

R445.2

A

1003-3289(2017)10-1463-07

國家自然科學(xué)基金青年基金(81501561)、廣東省自然科學(xué)基金(2014A030310043、2017A030313873)。

龐鵬飛(1980—)，男，河南沈丘人，博士，副主任醫(yī)師。研究方向：分子影像學(xué)。E-mail: pflb@sina.com

單鴻，中山大學(xué)附屬第五醫(yī)院介入醫(yī)學(xué)中心，519000。E-mail: Shanhong@mail.sysu.edu.cn

2016-12-30

2017-07-27