丁燕芳　平文麗　孫計平

摘要：為明確煙草黑脛病（Phytophthora parasitica var. nicotianae Tucker）抗性鑒定方法，采用粗毒素浸種法、粗毒素浸根法、孢子懸浮液浸根法及田間病圃接種法，研究煙草革新3號（抗病品種，R）、G28（R）、金星6007（中抗品種，MR）、小黃金1025（感病品種，S）、紅花大金元（S）等對煙草黑脛病的抗性，并對其抗性鑒定效果進行相關(guān)性分析。結(jié)果表明，孢子懸浮液浸根法的鑒定結(jié)果與粗毒素浸種法的鑒定結(jié)果呈顯著負相關(guān)，與田間病圃接種法的鑒定結(jié)果呈顯著正相關(guān)。粗毒素浸種法不受季節(jié)限制，可以對煙草材料黑脛病的抗性進行大批量篩選。粗毒素浸根法和田間病圃接種法有一定的缺陷，可以作為粗毒素浸種法和孢子懸浮液浸根法的輔助鑒定方法。在整個抗性鑒定過程中，孢子懸浮液浸根法可觀測到煙株病情指數(shù)和發(fā)病率的動態(tài)變化，較其他3種方法更能準確、合理地評價品種抗性。

關(guān)鍵詞：煙草黑脛?。≒hytophthora parasitica var. nicotianae Tucker）；抗性鑒定效果；相關(guān)性分析

中圖分類號：S435.72 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）18-3477-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.18.021

Abstract： In order to determine the reasonable and effective method for the identification of resistance to tobacco black shan disease（Phytophthora parasitica var. nicotianae Tucker），using four identification methods：Toxins soaked seed soaking method， root method， spore suspension dipping root method and field disease nursery inoculation method，the tobacco resistant of flue-cured tobacco cv. Gexin 3 （resistant，R），G28 （resistant，R），Jinxing 6007 （medium resistance，MR），Xiaohuangjin 1025 （susceptible，S） and Honghuadajinyuan（susceptible，S） were researched. And its resistance identification effects for correlation analysis were conducted. The results showed that there were negatively correlation between the identification results of the immersing seeds method and the identification results of immersing root in spore suspension. There were significantly positive correlation between the identification results of the immersing root in spore suspension and the results of inoculating in disease nursery. The immersing seeds with liquid toxin was unaffected by seasonal factors， which could be used to screen tobacco varieties with black shank disease resistance in a large scale all the year round. There were somewhat defects in immersing immersing roots with liquid toxin and inoculating in disease nursery methods had flaws， which could be used to assist the methods of immersing seeds with liquid toxin and immersing root in spore suspension to evaluate disease resistance level of different tobacco varieties. Immersed the root with pore suspension could be applied to observe dynamic change of the disease index and the incidence rate of the tobacco during the whole inoculating process. Compared with other three methods， immersing the root with pore suspension could be more accurate and reasonable to evaluate disease resistance of different tobacco varieties.

Key words： tobacco black shank（Phytophthora parasitica var. nicotianae Tucker）； resistance identification effect； correlation analysisendprint

煙草黑脛?。≒hytophthora parasitica var. nicotianae Tucker）是典型的土傳性單循環(huán)病害，可為害烤煙、晾煙、曬煙等栽培煙草[1]，且多與青枯病混合發(fā)生[2]，對煙葉的產(chǎn)量和品質(zhì)造成較大損害[3，4]。隨著中國煙田連作面積的不斷擴大，連作年限的不斷增長，加重了該病害的流行。目前生產(chǎn)上對煙草黑脛病的防治主要有栽培防治、農(nóng)業(yè)防治、生物防治等方法[5，6]。與這些防治方法相比，選育和利用抗性品種是一種更為經(jīng)濟有效的措施。而抗病性鑒定是選育抗性材料的關(guān)鍵，是煙草新品種選育過程中不可或缺的環(huán)節(jié)[7]。

煙草黑脛病接種鑒定方法有室內(nèi)接種鑒定法和田間接種鑒定法。室內(nèi)接種鑒定法主要包括游動孢子懸浮液灌根接種法[8]、菌絲塊莖基部針刺創(chuàng)傷接種法[9]、菌絲塊莖基部不創(chuàng)傷接種法[7-9]和黑脛病菌毒素浸種鑒定法[10]等。龔龍英等[10]研究指出，不同接種方法對煙草黑脛病菌致病力的測定有一定影響。為此，本研究利用粗毒素浸種法、粗毒素浸根法、孢子懸浮液浸根法及田間病圃接種法等4種方法，對5份不同抗性煙草材料（革新3號、G28、金星6007、小黃金1025和紅花大金元）進行鑒定，并對不同的鑒定方法進行比較，以期找出更為有效的煙草黑脛病鑒定方法，為今后煙草黑脛病抗性鑒定提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

供試煙草品種為抗病品種革新3號（R）和G28（R）、中抗品種金星6007（MR）、感病品種小黃金1025（S）和紅花大金元（S）[11]。用于接種鑒定的煙草黑脛病菌1號強毒菌株由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所提供。

1.2 試驗地點

煙草種子接種鑒定試驗在河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所分子實驗室進行，苗期鑒定試驗在河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所育苗溫室大棚和實驗室進行，大田成株期鑒定試驗在河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗田黑脛病病圃內(nèi)進行。

1.3 接種病原菌的制備

1.3.1 孢子懸浮液的制備 將煙草黑脛病菌接種到燕麥平板培養(yǎng)基上，在28 ℃下培養(yǎng)7 d后，挑取菌絲體接種到燕麥培養(yǎng)液中，置于120 r/min的搖床上培養(yǎng)14 d（28 ℃），制成游動孢子懸浮液。再用1%葡萄糖液配制成1×106 CFU/mL的孢子懸浮液，備用[7]。

1.3.2 粗毒素的制備 采用龐龍等[12]的方法制備煙草黑脛病菌的粗毒素。用打孔器將在燕麥平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)7～14 d的煙草黑脛病病菌打成直徑為0.5 cm的菌餅，接種到含150 mL燕麥培養(yǎng)液的250 mL錐形瓶中，每瓶接種6塊菌餅。置于150 r/min恒溫（28 ℃）搖床上，暗培養(yǎng)14 d，用雙層紗布濾去培養(yǎng)液中的菌絲，取濾液8 000 r/min離心15 min制取上清液，再用0.22 μm微孔無菌濾液器過濾，得到無菌粗毒素原液，置于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4 方法

1.4.1 粗毒素浸種法 種子消毒：每個品種分別挑選150粒飽滿的種子，用濃度為75%乙醇浸泡3 min，再用濃度為3%的次氯酸鈉浸泡5 min，用無菌水清洗3次。

毒素處理：將5個品種的種子分別裝入2 mL無菌離心管中（每管各裝150粒），在每個離心管中加入1.5 mL濃度為1 000 μL/mL的粗毒素液[9]，浸泡8 h后取出種子，分別播種在鋪有濕潤濾紙的無菌培養(yǎng)皿中，每皿播種50粒種子，每個品種播種3皿。

5 d后調(diào)查病情，計算發(fā)病率。

1.4.2 室內(nèi)粗毒素浸根法 供試煙草品種采用漂浮育苗方法育苗[7]。待煙苗長到4～5葉期時，移植到200孔的聚苯乙烯塑料泡沫漂浮苗盤中。每個苗盤移植5個不同抗性品種，每個品種選取20株，重復(fù)3次。等苗齡達到30 d，整盤苗裝入室內(nèi)固定育苗盒內(nèi)，用粗毒素液（制備方法參照“1.3.2”）代替漂浮育苗的營養(yǎng)液，進行粗毒素浸根處理。5 d后調(diào)查病情，計算發(fā)病率。

1.4.3 孢子懸浮液浸根法 孢子懸浮液浸根鑒定法同“1.4.2”。每個育苗盒內(nèi)的500 μL/mL粗毒素液用1×106 CFU/mL孢子懸浮液代替。接種5 d后調(diào)查病情（病株數(shù)及每病株病級），并計算發(fā)病率和病情指數(shù)[13]。

1.4.4 田間病圃接種法 選用歷年黑脛病高發(fā)區(qū)連作煙田為病圃，待煙苗生長到7～8片真葉時移栽到病圃里。每小區(qū)移栽5個不同抗性品種，每個品種選取20株，重復(fù)3次。成熟采收前調(diào)查煙草黑脛病發(fā)病情況，并計算發(fā)病率和病情指數(shù)[14]。

1.5 病情調(diào)查與抗性評價

病害嚴重度分級標準按照GB/T 23222-2008[14]規(guī)定的標準進行。以株為單位分級調(diào)查。根據(jù)調(diào)查結(jié)果計算并統(tǒng)計煙株病情指數(shù)。

病情指數(shù)=∑（各級病株數(shù)×該病級值）/（調(diào)查總株數(shù)×最高病級值）×100。

按照GB/T 23224—2008[11]的規(guī)定進行抗性標準評價。高抗或免疫（I），病情指數(shù)為0；抗病（R），病情指數(shù)為0.1～20.0；中抗（MR），病情指數(shù)為20.1～40.0；中感（MS），病情指數(shù)為40.1～60.0；感?。⊿），病情指數(shù)為60.1～80.0；高感（HS），病情指數(shù)為80.1～100.0。

1.6 數(shù)據(jù)分析

利用Excel 2007軟件對試驗數(shù)據(jù)進行處理，采用DPS軟件對不同鑒定方法之間的相關(guān)性進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 粗毒素浸種法的抗性鑒定分析

粗毒素浸種試驗結(jié)果（表1）表明，2個抗病品種革新3號和G28的煙苗發(fā)芽率差異顯著。革新3號煙苗發(fā)芽率達98.0%以上，抗性穩(wěn)定?？共∑贩NG28煙苗發(fā)芽率與中抗品種金星6007差異不顯著。中抗品種金星6007在處理后5 d煙苗發(fā)芽率較高，達82.0%，之后隨處理時間的增加，其芽苗發(fā)芽率逐漸降低。在整個處理期間，金星6007的煙苗發(fā)芽率與抗病品種革新3號、感病品種小黃金1025和紅花大金元均差異顯著。感病品種小黃金1025和紅花大金元的煙苗發(fā)芽率只在接種后15 d差異顯著，在接種后20 d其煙苗發(fā)芽率分別降低到62.0%和58.7%。endprint

2.2 粗毒素浸根法的抗性鑒定分析

粗毒素浸根鑒定結(jié)果（表2）表明，抗病品種的發(fā)病率較低。在接種后15 d，抗病品種革新3號和G28的發(fā)病率分別為3.3%、17.7%；中抗品種金星6007的發(fā)病率為36.7%；感病品種小黃金1025和紅花大金元的發(fā)病率分別為30.0%、35.0%。在整個處理期間，中抗品種金星6007的煙苗發(fā)病率在5個品種中最高，且接種后5、10 d差異顯著。接種后15 d，感病品種與抗病品種的發(fā)病率差異顯著，與中抗品種的發(fā)病率差異不顯著。因此，粗毒素浸根法只能對抗病和感病品種進行區(qū)分。

2.3 孢子懸浮液浸根法的抗性鑒定分析

由表3可知，抗病品種革新3號和G28的煙苗發(fā)病率較低，而感病品種小黃金1025和紅花大金元的發(fā)病率在接種后5 d已達100.0%，中抗品種金星6007的發(fā)病率在接種后15 d達90.0%。接種后10 d，抗病品種革新3號的病情指數(shù)最低，其次是G28，感病品種小黃金1025的病情指數(shù)最高，其次是紅花大金元，中抗品種金星6007處于中間。在整個處理期間，2個感病品種的病情指數(shù)差異均不顯著，但與抗病品種和中抗品種相比均差異顯著。因此，用孢子懸浮液浸根法處理30 d苗齡的煙苗能較快速、準確地鑒定不同種質(zhì)的抗性水平。

2.4 田間病圃接種法的抗性鑒定分析

田間病圃鑒定結(jié)果（表4）顯示，抗病品種革新3號和G28的發(fā)病率和病情指數(shù)分別為16.7%、8.2和7.8%、2.0，屬于抗黑脛病種質(zhì)；金星6007發(fā)病率和病情指數(shù)分別為28.5%和24.3，屬于中抗黑脛病種質(zhì)；小黃金1025和紅花大金元的發(fā)病率和病情指數(shù)分別為72.6%、64.3和67.7%、59.4，屬于感黑脛病種質(zhì)。

2.5 不同鑒定方法的相關(guān)性分析

不同鑒定方法的相關(guān)性分析（表5）表明，粗毒素浸種法與孢子懸浮液浸根法的鑒定結(jié)果呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.778；孢子懸浮液浸根法與田間病圃接種法的鑒定結(jié)果呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.834。由此可見，孢子懸浮液浸根法接種鑒定的結(jié)果與粗毒素浸種法和田間病圃接種法的鑒定結(jié)果較為一致，可以較好地反映不同品種對煙草黑脛病的抗感特性。

3 小結(jié)與討論

在煙草抗黑脛病新種質(zhì)創(chuàng)造、抗病新品種選育過程中，抗病鑒定是一個重要的技術(shù)環(huán)節(jié)。本研究所使用的4種抗病鑒定方法，是煙草種質(zhì)抗性鑒定常規(guī)方法，但因病原菌種類以及病原菌的侵入方式不同，其鑒定效果存在不同差異。孫麗萍等[15]研究認為，毒素浸種法不能鑒定煙草種質(zhì)對赤星病的抗性。本研究用粗毒素浸種法鑒定煙草黑脛病抗性結(jié)果顯示，這是一種室內(nèi)初期鑒定方法，簡單靈活，不受季節(jié)限制，可對煙草黑脛病抗性進行多批量的初期篩選。然而因種子質(zhì)量影響形成的低發(fā)芽率可造成“假感病”的現(xiàn)象，影響毒素浸種法的判定效果。

有學(xué)者利用毒素浸根法進行植物抗感種質(zhì)的篩選鑒定研究，如在煙草赤星病[15]、棉花黃萎病[16]、廣藿香青枯病[17]等病害的種質(zhì)抗性鑒定中均被采用，表現(xiàn)出較好的鑒定效果。在煙草黑脛病抗性鑒定中，粗毒素浸根法可以初步鑒別抗病、感病品種，但是存在著不能區(qū)分中感和中抗煙草品種對煙草黑脛病抗性的缺陷。并且該方法粗毒素用量較大，難以確定處理根系時粗毒素的濃度，需反復(fù)試驗，工作量較大。

孢子懸浮液浸根法與其他3種方法相比，可在接種10 d之內(nèi)，較為快速、準確地鑒定出不同種質(zhì)的抗感水平，可觀測到整個處理期間煙苗病情指數(shù)和發(fā)病率的動態(tài)變化。此研究結(jié)果與于海琴等[18]對煙草苗期黑脛病的鑒定結(jié)果一致。田間病圃接種法作為一種常規(guī)的鑒定方法，其鑒定結(jié)果與孢子懸浮液浸根法的鑒定結(jié)果一致，但田間病圃接種法易受環(huán)境、接種量、接種時間等的影響[19]。此外，田間病圃接種法所需時間長，占地面積大，試驗費用高，并不是最理想的方法。

因此，在煙草黑脛病抗性鑒定過程中，孢子懸浮液浸根法較其他3種方法更能準確、合理地評價品種抗性。粗毒素浸根法和田間病圃接種法有一定缺陷，可作為粗毒素浸種法和孢子懸浮液浸根法的輔助鑒定方法。

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