樊雪艷+王鑫+劉曉晨+王春英

[摘要] 建立同時測定灌胃給予大鼠廣金錢草提取物后膽汁中7種黃酮和1種酚酸類化合物濃度的HPLC-MS/MS，并用于膽汁排泄研究。大鼠灌胃給予廣金錢草提取物后，分別在0～1，1～2，2～4，4～6，6～8，8～12，12～24 h時間段收集膽汁。色譜柱采用Diamonsil C18 column （4.6 mm×150 mm，5 μm），柱溫 40 ℃。以甲醇-0.01%乙酸水溶液為流動相，梯度洗脫，流速0.8 mL·min-1。質(zhì)譜采用電噴霧離子源（ESI），負(fù)離子模式下檢測，多反應(yīng)離子監(jiān)測（MRM）模式進(jìn)行定量。結(jié)果表明8種成分在測定濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r≥0.991 5），日內(nèi)、日間精密度RSD<15%，準(zhǔn)確度RE-15%～15%，穩(wěn)定性良好。提取回收率>63.2%，內(nèi)標(biāo)歸一化的基質(zhì)因子RSD均未超過15%，符合要求。大鼠膽汁排泄研究結(jié)果顯示，8種成分在膽汁中的原型排泄率均比較小，并且不同個體之間差別較大。該研究方法靈敏度高，選擇性好，樣品處理簡單，可用于灌胃給予大鼠廣金錢草提取物后膽汁中8種成分的排泄動力學(xué)研究。

[關(guān)鍵詞] 廣金錢草； 黃酮； 酚酸； HPLC-MS/MS； 含量測定； 膽汁排泄

[Abstract] To establish a HPLC-MS/MS quantitative method for analysis of 8 constituents in rat bile. The method was applied in the biliary excretion study after oral administration of Desmodii Styracifolii Herba extract. The rat bile samples were collected during 0-1， 1-2， 2-4， 4-6， 6-8， 8-12， 12-24 h. Diamonsil C18 column （4.6 mm×150 mm， 5 μm） was adopted and eluted with methanol and 0.01% acetic acid in a gradient mode. The flow rate was 0.8 mL·min-1， and the column temperature was set at 40 ℃. The detection was carried out by a triple quadrupole linearion trap mass spectrometer in the negative ion mode with an electrospray source. Multiple reactions monitoring （MRM） mode was employed. The calibration curves showed a good linearity， with correlation coefficients （r≥0.991 5） for all of the analytes within the concentration range. The intra-day and inter-day precisions （RSD） were both less than 15%， and the accuracies （RE） ranged from -15% to 15%. The method had a good stability， and was suitable for the content determination of 8 constituents in rat bile. The extraction recoveries of the 8 analytes were more than 63.2%， and the RSD of IS-normalized matrix factors were no more than 15%， which met the requirements for analysis. According to the biliary excretion study， the bile excretion rates of the 8 analytes were relatively low， with great difference among the individuals. The results showed that the established method was simple， selective and specific， thus could be applied in the biliary excretion study of the 8 analytes in rat bile.

[Key words] Desmodii Styracifolii Herba； flavonoids； phenolic acid； HPLC-MS/MS； content determination； biliary excretion

廣金錢草為豆科植物廣金錢草Desmodium styracifolium（Osb.）Merr.的干燥地上部分^[1]，是我國常用的傳統(tǒng)中藥，具有清熱排石、利膽利尿、抗炎鎮(zhèn)痛的功效，可用于預(yù)防、治療泌尿系統(tǒng)結(jié)石以及結(jié)石術(shù)后消炎止痛等 [2-3]。廣金錢草中含有黃酮、酚酸、多糖、生物堿、鞣質(zhì)、揮發(fā)性成分等^[4]。其中，黃酮類成分能夠顯著減少高草酸尿大鼠腎結(jié)石的形成^[5]，酚酸則具有抗炎的效果^[6]。為更好的指導(dǎo)其臨床應(yīng)用，本課題組在對廣金錢草在大鼠體內(nèi)的藥物代謝動力學(xué)研究的基礎(chǔ)上^[7]，進(jìn)一步對其在大鼠體內(nèi)的排泄進(jìn)行研究。旨在建立一種HPLC-MS/MS同時測定廣金錢草中7種黃酮和1種酚酸類化合物在大鼠膽汁中的濃度，從而考察其膽汁排泄的動力學(xué)過程，為全面研究廣金錢草的體內(nèi)過程奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器

Agilent-1200高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；BP211D型1/10萬天平（德國Sartorius公司）；3200Q TRAP型三重四極桿線性離子阱質(zhì)譜儀，配有ESI離子源（美國AB公司）；MTN-2800D型氮吹儀（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）；Analyst 1.5.2 software數(shù)據(jù)系統(tǒng)（美國AB公司）；N1001旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海愛朗儀器有限公司）。

1.2 試藥與試劑

阿魏酸 （0773-9910），磺胺甲噁唑（IS）（100025-199503） 購于中國食品藥品檢定研究院；夏佛塔苷 （ZL25854XFT），異夏佛塔苷（ZL85428YXF），甘草素（ZL68515GCS），芹菜素（ZL10852QCS），柚皮素（ZL78156YPS），異鼠李素 （110860-200406），異牡荊素（ZL95565YMJ） 均購于南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司。各物質(zhì)結(jié)構(gòu)見圖1。甲醇為色譜純（美國J T Baker公司）；超純水（杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司）；其他試劑均為分析純（天津化學(xué)試劑公司）。廣金錢草藥材購于河北安國。

1.3 動物

實(shí)驗(yàn)動物為Wistar大鼠，清潔動物，體質(zhì)量240～250 g，雄性，河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，合格證號為603242。實(shí)驗(yàn)前禁食12 h，自由飲水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為Diamonsil C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm），流動相為甲醇 （A） 和 0.01%乙酸水溶液 （B），梯度洗脫條件：0～34 min，20%～34% A；34～38 min，34%～95% A；38～42 min，95% A。流速0.8 mL·min-1；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量20 μL。

2.2 質(zhì)譜條件

離子源為Turbo V電噴霧離子化源（ESI）；源溫度為650 ℃；采用多反應(yīng)離子監(jiān)測（MRM）模式進(jìn)行負(fù)離子檢測；源噴射電壓（IS）為-4 500 V；霧化氣（GS1，N2）壓力為60 psi（1 psi=6.895 kPa）；輔助氣（GS2，N2）壓力為65 psi；氣簾氣（N2）壓力為25 psi。各物質(zhì)的MS和MS2離子碎片數(shù)據(jù)，解簇電壓（DP）和碰撞能量（CE）見圖1。內(nèi)標(biāo)磺胺甲噁唑 m/z 252.0→155.9，保留時間為10.94 min。

2.3 對照品溶液的制備

精密稱取8個對照品及內(nèi)標(biāo)適量，用20%甲醇溶解制成混合對照品溶液，使對照品的質(zhì)量濃度分別為10 400，424，344.4，71.2，24，23.4，20.4，118.4 mg·L-1，內(nèi)標(biāo)磺胺甲噁唑?yàn)?0.525 mg·L-1。將混合對照品溶液用20%的甲醇分別稀釋成1∶0，1∶5，1∶10，1∶100，1∶200，1∶500，1∶1 000的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。同時將混合對照品溶液用20%甲醇稀釋成1∶2.5，1∶20，1∶800的溶液用于制備QC樣品。

2.4 廣金錢草提取物的制備

取已切碎的廣金錢草藥材（批號1008016）200 g，加入50%乙醇回流提取3次（1∶15，1∶15，1∶10），每次1 h。第1次提取前浸泡1 h，合并提取液，過濾，回收乙醇并濃縮至20 mL。用外標(biāo)法測得該提取物中夏佛塔苷、異夏佛塔苷、阿魏酸、甘草素、芹菜素、柚皮素、異鼠李素、異牡荊素的質(zhì)量濃度分別為1.701，0.386，0.015，0.001，0.024，0.012，0.031，0.234 g·L-1。

2.5 膽汁樣品采集與處理

膽汁樣品采集：取Wistar大鼠6只，按4 mL·kg-1灌胃給予廣金錢草提取液，25%烏拉坦7 mL·kg-1腹腔麻痹，實(shí)施膽管插管手術(shù)。收集0～1，1～2，2～4，4～6，6～8，8～12，12～24 h的膽汁，-20 ℃冷藏。膽汁樣品處理：取膽汁0.4 mL，加甲醇20 μL，內(nèi)標(biāo)溶液20 μL，鹽酸（0.25 mol·L-1）50 μL，渦旋3 min，再加乙酸乙酯1.2 mL，渦旋5 min混勻，14 000 r·min-1離心10 min，取上清液1.2 mL。N2吹干，用50%甲醇100 μL復(fù)溶，14 000 r·min-1離心10 min，取上清液進(jìn)樣分析。

2.6 方法學(xué)驗(yàn)證

2.6.1 選擇性考察 通過比較實(shí)際生物樣品，模擬生物樣品，空白生物基質(zhì)來考察內(nèi)源性物質(zhì)和代謝產(chǎn)物的干擾。給藥后收集的膽汁樣品、LLOQ標(biāo)準(zhǔn)添加膽汁樣品及空白膽汁的典型MRM色譜圖，見圖2。結(jié)果表明膽汁中的內(nèi)源性物質(zhì)和代謝產(chǎn)物均不干擾內(nèi)標(biāo)物和待測物測定。

2.6.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線和定量下限（LLOQ） 取空白膽汁400 μL，分別加入內(nèi)標(biāo)溶液20 μL，系列標(biāo)準(zhǔn)溶液20 μL，鹽酸溶液50 μL，按照2.5項(xiàng)下處理，記錄內(nèi)標(biāo)和待測物的峰面積。以待測物與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值為縱坐標(biāo)，以待測物的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。用加權(quán)最小二乘法（W=1/χ2）計算回歸方程。LLOQ為標(biāo)準(zhǔn)曲線上最低濃度點(diǎn)，連續(xù)測定6份。8種待測物的標(biāo)準(zhǔn)曲線和LLOQ見表1。結(jié)果各成分相關(guān)系數(shù)（r）均大于0.991 5，說明大鼠膽汁中8種成分在測定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。LLOQ的準(zhǔn)確度RE和精密度RSD均小于15%。

2.6.3 精密度和準(zhǔn)確度 取空白膽汁，分別加入內(nèi)標(biāo)溶液20 μL，制備QC樣品用的標(biāo)準(zhǔn)溶液20 μL，鹽酸溶液50 μL，按照2.5項(xiàng)下處理，記錄內(nèi)標(biāo)和待測物的峰面積。高、中、低3個濃度的QC樣品各平行測定6份，用當(dāng)日隨行的標(biāo)準(zhǔn)曲線測定QC樣品的質(zhì)量濃度，計算日內(nèi)精密度和準(zhǔn)確度。連續(xù)進(jìn)行3 d，分別以當(dāng)日的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算QC樣品的質(zhì)量濃度，計算日間精密度和準(zhǔn)確度。日內(nèi)和日間精密度和準(zhǔn)確度見表2。結(jié)果表明，膽汁樣品中各待測成分日內(nèi)、日間精密度RSD<15%，準(zhǔn)確度RE ±15%，表明本方法準(zhǔn)確度高、精密度好，符合要求。

2.6.4 提取回收率與基質(zhì)效應(yīng) 按2.6.3項(xiàng)測定低、中、高 3 個濃度的質(zhì)控樣品各6份，記錄待測物和內(nèi)標(biāo)的峰面積（A）。另外，取空白基質(zhì)400 μL，按2.5項(xiàng)下處理至N2吹干，精密加入配制質(zhì)控樣品用的標(biāo)準(zhǔn)溶液20 μL和內(nèi)標(biāo)溶液20 μL，N2吹干，50%甲醇100 μL復(fù)溶，14 000 r·min-1離心10 min，取上清液進(jìn)樣分析，記錄待測物和內(nèi)標(biāo)的峰面積（B）。提取回收率=A/B×100%。取來源不同的6批空白基質(zhì)各400 μL，按2.6.3項(xiàng)方法測定高、中、低3個濃度時待測物和內(nèi)標(biāo)的峰面積（C）。同時測定不含基質(zhì)時待測物和內(nèi)標(biāo)的峰面積（D），計算各分析物與內(nèi)標(biāo)的基質(zhì)因子=C/D×100%，再計算出每一分析物經(jīng)內(nèi)標(biāo)歸一化的基質(zhì)因子與其RSD。膽汁中每種被分析物的提取回收率、經(jīng)內(nèi)標(biāo)歸一化的基質(zhì)因子與RSD見表2。結(jié)果表明8種分析物的提取回收率均大于63.2%，經(jīng)內(nèi)標(biāo)歸一化的基質(zhì)因子RSD均小于15%，表明本實(shí)驗(yàn)方法的提取回收率較高，并且基質(zhì)效應(yīng)不影響膽汁中8種成分的濃度測定。

2.6.5 穩(wěn)定性 取空白基質(zhì)，制備高、中、低3個濃度的QC樣品，每濃度3份，考察樣品在室溫下12 h的短期穩(wěn)定性、-20 ℃儲存30 d的長期穩(wěn)定性、經(jīng)3次反復(fù)凍融循環(huán)后（-20 ℃～20 ℃）的穩(wěn)定性。膽汁的短期穩(wěn)定性、長期穩(wěn)定性以及3次凍融循環(huán)的穩(wěn)定性，見表3。結(jié)果表明膽汁樣品穩(wěn)定性良好。

2.6.6 稀釋可靠性 取空白基質(zhì)加入高濃度對照品溶液適量配制成待考察樣品，用空白基質(zhì)稀釋10，100，500倍，每個濃度平行配制5份，按2.5項(xiàng)下處理，進(jìn)樣分析，并計算準(zhǔn)確度與精密度。結(jié)果顯示，8種待測物濃度的精密度RSD均小于15%，準(zhǔn)確度RE -9.7%～12.3%，表明實(shí)驗(yàn)過程中稀釋樣品不影響待測物濃度的測定。

2.7 膽汁排泄動力學(xué)特征

按2.5項(xiàng)下操作，測定膽汁樣品，并以隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線計算各時段樣品中各待測物的濃度，根據(jù)相應(yīng)時段的排泄體積計算排泄量，以時間點(diǎn)為橫坐標(biāo)，累積排泄量為縱坐標(biāo)，繪制各成分的累積排泄量-時間曲線，見圖3。以時間為橫坐標(biāo)，排泄速率為縱坐標(biāo)，繪制平均排泄速率-時間曲線，見圖4。累積排泄量與給藥劑量相比，即得該成分的累積排泄率。在0～24 h 內(nèi)，大鼠膽汁樣品中8種化合物以原型在膽汁中的累積排泄率分別為柚皮素（0.047±0.01）%，阿魏酸（1.145±0.46）%，異牡荊素（0.007±0.004）%，夏佛塔苷（0.998±0.24）%，異夏佛塔苷（0.015±0.01）%，芹菜素（0.043±0.018）%，異鼠李素（0.010±0.006）%，甘草素（0.147±0.075）%。結(jié)果表明8種成分在膽汁中的原型排泄率較低，并且不同個體之間差別較大。

3 討論

本研究將所有待測物在正負(fù)離子檢測模式下所獲得的質(zhì)譜信息進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，所有待測物在負(fù)離子模式下靈敏度高且穩(wěn)定，故選擇負(fù)離子模式進(jìn)行定量分析。除此之外，對不同的流動相系統(tǒng)進(jìn)行考察，最終發(fā)現(xiàn)在以甲醇-0.01%乙酸水溶液為流動相，采用梯度洗脫的實(shí)驗(yàn)條件下，8種待測分析物能夠完全分開，且峰形好，響應(yīng)值高。因此選擇甲醇-0.01%乙酸水溶液為流動相。

本研究結(jié)果表明8種成分在膽汁中的原型排泄率均較低。本課題組曾對廣金錢草提取物在大鼠體內(nèi)的藥動學(xué)進(jìn)行了研究^[7]，8種成分中只獲得了夏佛塔苷、異牡荊素、芹菜素和阿魏酸的完整藥時曲線，而其他成分可能由于存在較強(qiáng)的首過效應(yīng)，進(jìn)入血液循環(huán)的量非常少，血漿濃度非常低，在膽汁中主要以代謝產(chǎn)物形式存在，原型較少。文獻(xiàn)[7-8]研究表明，阿魏酸比黃酮類消除快，且較容易吸收，可在體內(nèi)發(fā)生廣泛的生物轉(zhuǎn)化，生成相應(yīng)的代謝產(chǎn)物，且與膽汁中的排泄速率相比，阿魏酸在尿液中排泄速率更快，上述原因可導(dǎo)致阿魏酸在大鼠膽汁中排泄速率低、原型累積量少。關(guān)于柚皮素已有文獻(xiàn)報道^[9]，柚皮素在膽汁中主要以代謝產(chǎn)物形式存在，原型較少；在尿液中各代謝產(chǎn)物相對量的總和與原型的相當(dāng)；糞中的各代謝產(chǎn)物相對量非常低，幾乎全部以原型的形式排泄。說明導(dǎo)致柚皮素膽汁排泄率低的原因除首過效應(yīng)發(fā)生代謝外，還有可能是胃腸道吸收不好。芹菜素在膽汁中消除慢、原型排泄量少，排泄速率明顯低于尿液，且大部分以結(jié)合物形式排出^[10-11]，該結(jié)論與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致。有文獻(xiàn)表明^[12-13]，夏佛塔苷等黃酮苷類化合物在膽汁中的原型排泄率均較低，相同成分在尿液中的排泄率稍高些，排泄物大多為化合物的代謝產(chǎn)物，少數(shù)以原型排出，該結(jié)果可用來解釋本研究中黃酮苷類化合物膽汁中的原型排泄量少的原因。本研究闡述了廣金錢草中的7種黃酮和1種酚酸類化合物在大鼠膽汁中的排泄規(guī)律，提示其在大鼠體內(nèi)存在廣泛的代謝過程或其他排泄途徑，后續(xù)可進(jìn)行進(jìn)一步的考察與研究。

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[責(zé)任編輯 張燕]