萬彥軍+廖理曦+劉瑜琦+姜勇+劉蓮英+曾克武+屠鵬飛

[摘要] 保元湯作為治療元氣虛弱的著名方劑，臨床上廣泛用于冠心病治療，但由于成分復雜，因此其作用靶點及藥理機制尚不明確。該研究構(gòu)建了一種表面鍵合有光敏化學基團二苯甲酮的固相微球，利用紫外光激發(fā)下二苯甲酮基團與中藥化學成分中的碳氫鍵發(fā)生化學偶聯(lián)反應(yīng)，將中藥保元湯的化學成分組整體鍵合到微球的表面，并與小鼠心臟組織裂解液共孵育，進而富集保元湯對應(yīng)的心肌保護靶點群。針對靶點群進行蛋白質(zhì)組學分析，共發(fā)現(xiàn)46個潛在結(jié)合靶點蛋白，且大多數(shù)定位于線粒體。KEGG分析發(fā)現(xiàn)這些靶點蛋白主要與三羧酸循環(huán)和氨基酸代謝信號通路關(guān)系密切，提示保元湯可能主要通過調(diào)控線粒體功能及ATP能量產(chǎn)生進而發(fā)揮心肌保護作用。此外JC-1熒光染色實驗也證實，保元湯對線粒體損傷具有明顯的保護作用。綜上所述，該研究通過 “鉤釣”直接作用靶點蛋白從源頭上解釋了保元湯發(fā)揮心肌保護作用的潛在藥理機制，進而從分子細胞水平上詮釋了保元湯的傳統(tǒng)功效。此外，該研究也提供了一種用于研究中藥復雜方劑多靶點作用機制的新方法，有助于進一步推動傳統(tǒng)中藥藥理機制的現(xiàn)代科學解析。

[關(guān)鍵詞] 中藥復方； 保元湯； 心肌保護； 靶點； 作用機制

[Abstract] Baoyuan decoction （BYD） is a well-known traditional Chinese medicine formula for coronary heart disease with Qi deficiency. However， the detailed pharmacological mechanism of BYD is still unknown because of its complicated chemical compositions. In this study， we synthesized a kind of solid beads with benzophenone groups on its surface. Benzophenone can be activated and chemically cross-linked with the C-H bonds of the chemical compositions in BYD （BYD beads） under UV activation. We thus captured all the target proteins from mouse heart tissue lysates by using BYD beads. Based on proteomics analysis， we discovered totally 46 potential binding target proteins， most of which were located in mitochondria. KEGG analysis revealed that these target proteins were mainly associated with TCA cycle and amino acid metabolism signaling pathways， suggesting that the cardioprotection of BYD might be associated with regulating mitochondrial function and energy production. Moreover， JC-1 staining analysis also confirmed the protective effect of BYD on mitochondrial damage. In summary， our findings elucidated the potential mechanism of BYD on cardioprotection through "target fishing" strategy， and further explained its traditional efficacy in the molecular level. In addition， we also provide an approach for investigating the target group of complicated compositions in Chinese herbal formula. This novel method may provide a methodological reference for exploring the pharmacological mechanism of traditional Chinese formula in the future.

[Key words] traditional Chinese formula； Baoyuan decoction； myocardial protection； target； mechanism

中藥復雜方劑在中醫(yī)藥理論指導下，臨床療效確切，但是，由于藥效物質(zhì)基礎(chǔ)不明和作用靶點不清，方劑配伍規(guī)律的詮釋仍停留在經(jīng)驗水平。因此，探究中藥復雜體系的作用靶點群，建立一套“基于靶點發(fā)現(xiàn)技術(shù)”藥物機制研究體系，揭示藥物作用機制及發(fā)現(xiàn)新靶點，對中醫(yī)藥現(xiàn)代化研究具有重要意義^[1-2]。

保元湯（Baoyuan decoction，BYD）最早見于明代魏直的《博愛心鑒》^[3]，是治療元氣虛弱的著名方劑，主要包含黃芪、人參、甘草（炙）、肉桂4味藥材，臨床上廣泛用于冠心病治療^[4]，經(jīng)過歷代醫(yī)家數(shù)百年的運用驗證，保元湯臨床療效確切。由于中藥復方是一個復雜體系，因此研究保元湯心肌保護的藥理機制就要從多成分、多靶點協(xié)同作用的角度進行。本研究利用光化學偶聯(lián)反應(yīng)將保元湯的化學成分整體鍵合到表面修飾有光敏基團二苯甲酮的固相微球上，進而與心臟組織裂解液混合孵育，富集相應(yīng)的結(jié)合蛋白并用高分辨質(zhì)譜進行鑒定。接著針對每個結(jié)合蛋白的功能進行生物信息學分析，闡釋保元湯心肌保護作用的分子機制。因此本研究不僅從分子水平上闡釋了保元湯多成分、多靶點的藥理作用機制，同時對其他中藥或復雜方劑體系的作用機制研究也具有重要的借鑒意義。endprint

1 材料

1.1 藥物

保元湯由黃芪、人參、甘草（炙）、肉桂4味藥材組成，藥材均購于河北省安國藥材市場，經(jīng)北京大學藥學院天然藥物學系屠鵬飛教授鑒定，黃芪為豆科植物蒙古黃芪Astragalus membranaceus的干燥根的飲片，人參為五加科植物人參Panax ginseng的干燥根和根莖，甘草為豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis的干燥根和根莖經(jīng)蜜制后的飲片，肉桂為樟科植物肉桂Cinnamomum cassia的干燥莖皮。各味藥材按6∶2∶2∶1混合后，加水浸泡過夜，常壓回流提取2 h。分離水提液和藥渣，藥渣再加水，常壓回流提取2 h，提取2次。最后合并3次濾液，提取液混合后低溫冷凍干燥成粉末^[5]，備用。

1.2 動物

1～2 d齡SD乳鼠，SPF級；6～7周齡ICR小鼠（雄），20～25 g，SPF級，生產(chǎn)許可證號SCXK（京）2016-0010，均由北京大學醫(yī)學部實驗動物中心提供。

1.3 試劑

H9c2心肌細胞系購自于中國醫(yī)學科學院基礎(chǔ)醫(yī)學研究所細胞中心；DMEM培養(yǎng)基購自Macgene公司；胎牛血清購自PAN Biotech公司；3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT），4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）均購自Sigma公司；JC-1試劑盒購自上海碧云天公司，α-actin抗體和熒光二抗均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.4 儀器

FDU-1100冷凍干燥機（Eyela，日本）；ND-1000微量紫外分光光度計（NanoDrop公司，美國）；Sunrise-Basic酶標儀（TECAN公司，瑞士）；5424R離心機（Eppendorf，德國）；CIX100顯微鏡（OLYMPUS，日本）。

2 方法

2.1 BYD藥效作用研究

2.1.1 原代心肌細胞培養(yǎng) 1～2 d齡SD新生乳鼠用75%的乙醇消毒，在胸骨劍突下稍左側(cè)打開胸腔，左手輕輕用力，使心臟躍出，取心臟，置于預冷10 mL的DMEM中，在預冷的DMEM中漂洗2次，用眼科彎鑷將心臟撕裂成3份，放入預冷的0.25%胰酶中4 ℃過夜（12～15 h）^[6]。取出心臟組織，預冷D-Hanks液漂洗2次，加入消化酶溶液（0.1%膠原酶Ⅰ和0.01% DNA酶）37 ℃振搖消化5 min，將消化液過200目細胞篩，并加入血清終止消化，然后2 000 r·min-1離心10 min，去除上清，在沉淀中加入5 mL正常DMEM培養(yǎng)基（含10%胎牛血清，100 U·L-1青霉素和鏈霉素）輕輕吹打以重懸細胞，接種于6孔板（成纖維細胞首先貼壁），30 min后取出細胞懸液再次接種，貼壁后即為心肌細胞。

2.1.2 心肌細胞形態(tài)學觀察 心肌細胞接種于6孔板中培養(yǎng)，貼壁后，倒置顯微鏡下觀察心肌細胞形態(tài)并拍照。

2.1.3 心肌細胞純度鑒定（α肌細胞純度鑒定） 心肌細胞接種于6孔板中培養(yǎng)，貼壁后吸取培養(yǎng)基，PBS液輕柔漂洗，4%多聚甲醛室溫固定30 min，PBS液漂洗5 min，棄PBS液，加入0.5% Triton X-100室溫輕微振搖10 min，PBS液漂洗5 min，棄PBS液，0.1%血清封閉，室溫輕微振搖30 min，加入α-actin抗體工作液，4 ℃過夜，PBS液漂洗5 min，棄PBS液，滴加二抗（mouse anti-goat，1∶200稀釋），37 ℃避光孵育1.5 h，PBS液避光漂洗5 min，加入DAPI（1∶100稀釋），37 ℃避光孵育20 min，PBS液避光漂洗5 min。熒光顯微鏡下觀察，激發(fā)波長分別為527，358 nm，拍照，免疫熒光染色陽性者為心肌細胞，藍色表示細胞核，綠色表示心肌細胞。同一視野下普通光下觀察、拍照、統(tǒng)計細胞總數(shù)，并計算心肌細胞純度。

2.1.4 氧糖剝奪/復氧糖（OGD/R）模型的建立 H9c2細胞或原代心肌細胞接種后培養(yǎng)24 h，棄上清，更換為無糖、無血清培養(yǎng)基并置于95%氮氣、5% CO2中培養(yǎng)8 h，然后更換為正常DMEM培養(yǎng)基并在95%空氣、5%CO2中復氧糖培養(yǎng)24 h，即為OGD/R模型。

2.1.5 MTT法測定細胞活力 H9c2細胞或心肌細胞接種于96孔板，24 h后，更換為無糖、無血清培養(yǎng)基或含有不同濃度BYD（50，100，200，400，800 mg·L-1）無糖、無血清培養(yǎng)基養(yǎng)于缺氧小室中8 h，然后更換為正常DMEM培養(yǎng)基或含有不同濃度BYD（50，100，200，400，800 mg·L-1）正常DMEM培養(yǎng)基，并在95%空氣、5%CO2中培養(yǎng)24 h，于570 nm處測定各組吸光度。

2.2 BYD作用靶點研究

2.2.1 心臟蛋白提取 ICR小鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉，打開胸腔，從左心室注入生理鹽水，減去右心耳，直至流水無血色（約50 mL）。按照每100 mg的組織加入1 mL的裂解液的比例加入裂解液（含cocktail蛋白酶抑制劑）。用勻漿機將組織充分裂解，勻漿的整個過程需要在冰上完成。充分裂解后在4 ℃離心10 min，離心力為12 000 r·min-1，取上清液，BCA方法測定蛋白含量并于-80 ℃條件保存。

2.2.2 光敏微球的制備 將分散聚合所得交聯(lián)聚苯乙烯（PSt）微球^[7]（650 nm，0.1 g）加入一含甲醇（30 mL）的50 mL單口燒瓶中，超聲分散、攪拌（100 r·min-1）；加入乙氧基化三羥甲基丙烷三丙烯酸酯（E-TMPTA，0.31 g）、三羥甲基丙烷三（3-巰基丙酸酯）（TMPTA，0.086 g）和三乙胺（TEA，0.1 mL）于室溫反應(yīng)2 h；然后加入含巰基聚氧乙烯（HS-PEG1k-SH，0.05 g，按文獻制備^[8]）和4，4-雙丙烯酰氧基二苯甲酮（ABPA，0.03 g，按文獻方法制備^[9]）繼續(xù)反應(yīng)2 h；所得粒子（PSt-BP）經(jīng)離心分離、甲醇洗滌至少3次并分散于少量甲醇中備用。endprint

2.2.3 中藥化學成分的固相微球包被 將表面含二苯甲酮結(jié)構(gòu)單元的聚合物微球PSt-BP（0.01 g），保元湯提取物（0.01 g）及20 mL去離子水加入一帶磨口、平面石英蓋的直管光照反應(yīng)瓶中，通入N2 30 min后，置于UV光下（375 W汞燈，光強12.5 W·m-2，λ=254 nm）反應(yīng)1 h，所得產(chǎn)物經(jīng)離心分離，并用去離子水洗滌至少3次。

2.2.4 靶點群的富集與鑒定 將表面包被有保元湯化學組分的微球及表面未被保元湯化學組分包被的微球分別與小鼠心臟組織裂解液充分混合，于4 ℃下孵育12 h，使保元湯與靶點蛋白充分結(jié)合。然后用0.1%SDS洗脫液反復清洗微球6遍，并加入適量的loading buffer（6×），98 ℃，煮沸8 min。然后8 000 r·min-1離心5 min，取上清液并進行SDS-PAGE凝膠電泳，銀染并對2組有差異蛋白條帶進行酶解和高分辨質(zhì)譜鑒定，檢索每個靶點蛋白的屬性及名稱。

2.2.5 作用靶點群的KEGG通路分析 Cytoscape是一個網(wǎng)絡(luò)可視化和分析的開放性免費軟件，它根據(jù)基本的數(shù)據(jù)結(jié)合成可視化網(wǎng)絡(luò)，進行網(wǎng)絡(luò)參數(shù)分析和生物功能注釋^[10]。將每個靶點蛋白名稱導入Cytoscape軟件，使用插件GlueGo進行KEGG Pathway分析，以P<0.01為顯著性閾值，得到蛋白集合相對于背景具有統(tǒng)計學意義的信號轉(zhuǎn)導及疾病通路。

2.3 BYD作用靶點的功能驗證（JC-1染色）

H9c2細胞接種于6孔板后，檢測不同濃度BYD（200，400，800 mg·L-1）處理對OGD/R誘導的心肌細胞線粒體去極化水平的調(diào)控能力，利用JC-1染色進行鑒定。同時，CCCP屬于線粒體電子傳遞鏈抑制劑，作為陽性對照。CCCP（10 mmol·L-1）按照1∶1 000的比例加入到細胞培養(yǎng)液中，稀釋至10 μmol·L-1，處理細胞20 min，線粒體的膜電位會完全喪失。當膜電位水平較高時，JC-1主要以聚合體形式存在，激發(fā)波長為590 nm，呈紅色熒光，當膜電位水平較低時，主要以單體形式存在，激發(fā)波長為527 nm，呈綠色熒光。通過熒光顯微鏡觀察，并拍照。利用Image Pro Plus圖像分析軟件測定細胞內(nèi)的紅色和綠色熒光強度，評估線粒體的膜電位水平。

2.4 統(tǒng)計方法

數(shù)據(jù)均用SPSS 20.0統(tǒng)計分析軟件進行處理，各組數(shù)據(jù)以±s表示，各組數(shù)據(jù)比較采用t檢驗，以P<0.05，P<0.01或P<0.001表示差異具有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果與分析

3.1 原代心肌細胞形態(tài)學觀察

原代心肌細胞在24 h左右開始長出偽足；48 h左右，偽足在鏡下成纖維條索狀，細胞胞體呈不規(guī)則形狀，如梭形、菱形，見圖1。72 h左右出現(xiàn)自發(fā)性搏動，78～90次/min。

3.2 原代心肌細胞純度鑒定

原代心肌細胞的α肌細胞純度染色呈陽性，可見明顯的心肌特異性橫紋肌結(jié)構(gòu)，細胞核周圍可見綠色顆粒，見圖1。心肌細胞陽性率大于95%。

3.3 保元湯對OGD/R損傷的H9c2細胞及原代心肌細胞的保護作用

H9c2細胞及原代心肌細胞經(jīng)過OGD/R處理后，顯示細胞存活率極顯著下降（P<0.001），說明造模成功。與模型組相比，BYD（50，100，200，400，800 mg·L-1）均顯著改善OGD/R所誘導的H9c2細胞及原代心肌細胞的損傷，且隨著BYD濃度增加，細胞活力增加，顯示劑量依賴性，見圖2。

3.4 保元湯心肌保護作用靶點群的富集與鑒定

對富集得到的靶點蛋白進行凝膠電泳后，銀染，共發(fā)現(xiàn)15條主要蛋白條帶。對每個蛋白條帶分別酶解后，進行LC-MS/MS高分辨質(zhì)譜鑒定，共計發(fā)現(xiàn)46個潛在結(jié)合靶點蛋白，見圖3。因此推測，保元湯的作用靶點群可能主要包括這46個靶點蛋白。

3.5 保元湯作用靶點群的分類與功能解析

根據(jù)鑒定得到的靶點群，按照不同蛋白功能進行了分類，主要可分為如下8類功能靶點蛋白：①線粒體類核體（mitochondrial nucleoid）：主要包括Atp5b，Hadha，Lrpprc；②碳氧裂解酶活性（carbon-oxygen lyase activity）：主要包括Aco2，F(xiàn)h1；③酰基輔酶A代謝過程（acyl-CoA metabolic process）：主要包括Acat1，Hmgcl，Pdhb，Sucla2；④三羧酸循環(huán)（tricarboxylic acid cycle）：主要包括Acadm，Cs，Etfdh，Got2，Idh2，Ogdhl，Pfkm，Suclg1；⑤心肌收縮功能調(diào)控（regulation of cardiac muscle cell contraction）：主要包括Atp1a1，Atp2a2，Jup，Pkp2，Col6a3；⑥脂肪酸β脂氧化（fatty acid beta-oxidation）：主要包括Acad11，Acad9，Cpt1b，Decr1，Ephx2，Etfa，Etfb，Hadh，Hmgcl，Idh2；⑦髓鞘（myelin sheath）：主要包括Atp5a1，Atp5c1，Atp5f1，Atp5o，Cltc，Hspa5，Hspa8，Nnt，Pkm，Uqcrc2；⑧其他：Krt78，Nebl，Sacm1l，Tgm2，Vwa8，Ckmt2。

3.6 保元湯心肌保護作用的機制詮釋

通過生物信息學分析對鑒定得到的46個靶點蛋白進行了研究。KEGG分析發(fā)現(xiàn)，這些靶點主要與6條信號通路相關(guān)，包括：①三羧酸循環(huán)（TCA cycle）；②致心律失常右室心肌病相關(guān)（ARVC）；③糖酵解，糖異生途徑；④丙酮酸代謝、氧化磷酸化途徑；⑤神經(jīng)退行性疾病相關(guān)；⑥氨基酸代謝途徑，見圖4。其中，保元湯與三羧酸循環(huán)信號通路的相關(guān)性最為密切（P=5.5×10-13）。三羧酸循環(huán)是一組酶學反應(yīng)，在線粒體基質(zhì)中進行，催化底物轉(zhuǎn)變，并在此過程中產(chǎn)生能量。在三羧酸循環(huán)信號通路中主要包含 Aco2，Cs，F(xiàn)h1，Idh2，Ogdhl，Pdhb，Sucla2和Suclg1等靶點。其次是氨基酸代謝途徑（P=5.6×10-8），包括脂肪酸降解，纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解，賴氨酸降解，色氨酸代謝，丙酸代謝，丁酸甲酯代謝，這6條信號通路與調(diào)節(jié)線粒體功能及產(chǎn)生能量密切相關(guān)。因此，推測保元湯中活性成分可能通過保護線粒體功能，調(diào)控線粒體內(nèi)有氧呼吸，保證能量正常釋放，進而保護心肌功能。三羧酸循環(huán)代謝通路障礙在線粒體功能缺失中起著重要作用。線粒體功能受損，不能給心臟跳動提供足夠的ATP以供能。因此，保護線粒體功能在保元湯調(diào)控心肌功能中發(fā)揮了重要角色。endprint

3.7 保元湯對H9c2細胞線粒體膜電位的影響

正常對照組細胞紅色熒光強，而綠色熒光較弱，CCCP組綠色熒光較強，說明染色方法合適。OGD/R模型組紅色熒光弱，綠色熒光強，紅/綠熒光強度比值下降。與模型組相比，隨著保元湯濃度的增加，紅色熒光增強，綠色熒光減弱，紅/綠熒光強度比值升高，見圖5。OGD/R模型組，保元湯200，400，800 mg·L-1組細胞紅/綠熒光強度比值分別為（0.16±0.03），（0.35±0.06），（1.32±0.14），（2.25±0.09），與正常對照組（2.62±0.15）相比OGD/R模型組比值顯著降低；與OGD/R模型組相比保元湯400，800 mg·L-1組比值均顯著升高（P<0.001，n=3）。表明保元湯可改善OGD/R誘導的H9c2細胞線粒體膜電位的下降。

4 討論

中藥復雜方劑具有多成分、多靶點的特性，決定了中藥發(fā)揮作用的復雜性。長期以來，中藥復雜方劑中哪些成分起作用以及各種成分與治療作用之間有何聯(lián)系等問題，還不是很清楚。因此，明確其作用靶點，闡明藥物作用機制，對中藥研究至關(guān)重要。本研究根據(jù)中藥成分富含碳氫鍵的特性，利用表面光敏偶聯(lián)反應(yīng)將中藥成分鍵合到固相微球上，進行靶點研究。

通過分析保元湯所結(jié)合的靶點蛋白的生物學功能，筆者發(fā)現(xiàn)了8類結(jié)合蛋白，包括：線粒體類核、碳氧裂解酶活性、?；o酶A代謝過程、三羧酸循環(huán)、心肌收縮功能調(diào)控、脂肪酸β謝氧化、脂肪酸β化氧化與髓鞘以及其他功能等。線粒體類核體即線粒體DNA，是線粒體基因組的功能單位，保證mtDNA免受各種損害且不影響其復制和轉(zhuǎn)錄的基本功能，其結(jié)構(gòu)與細胞核內(nèi)將DNA組裝成染色體的結(jié)構(gòu)完全不同。類核的部分結(jié)構(gòu)非常接近微管，與線粒體內(nèi)膜相連，沿線粒體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)成行排列，對線粒體功能具有很重要作用^[11]；心肌收縮功能調(diào)控靶點可能主要參與心臟收縮舒張功能，對心臟組織發(fā)揮正常生理功能有重要作用^[12]；碳氧裂解酶活性、?；o酶A代謝過程、三羧酸循環(huán)可能與調(diào)控線粒體內(nèi)能量代謝相關(guān)，并可增強心肌細胞線粒體內(nèi)的ATP合成，以提高線粒體功能，進而為心肌細胞提供更多的能量^[13]；髓鞘是包裹在神經(jīng)細胞軸突外面的一層膜，即髓鞘由施旺細胞和髓鞘細胞膜組成，起絕緣作用，防止神經(jīng)電沖動從神經(jīng)元軸突傳遞至另一神經(jīng)元軸突^[14]。總之，保元湯的作用靶點群主要與線粒體功能、ATP能量產(chǎn)生、心肌收縮及神經(jīng)傳導相關(guān)。

此外，通過KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)保元湯可能主要是通過作用于兩大類信號級聯(lián)發(fā)揮心肌保護作用的，即三羧酸循環(huán)和氨基酸代謝通路。這2個通路均與線粒體功能相關(guān)，因此推測保元湯的核心調(diào)控機制可能是保護線粒體功能，保證產(chǎn)生足夠的能量發(fā)揮心肌保護作用^[12]。通過線粒體膜電位實驗證實保元湯確實具有保護線粒體損傷作用。因此，本研究提出了一種研究中藥復雜方劑的可靠方法，為今后中藥復雜方劑靶點研究提供了新的思路。

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[責任編輯 張寧寧]endprint